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    雌激素受體β基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系研究

    2020-04-01 03:44:52郝娜田蕓婕賈亞靜路曉琳
    疑難病雜志 2020年3期
    關(guān)鍵詞:等位基因基因型位點(diǎn)

    郝娜,田蕓婕,賈亞靜,路曉琳

    子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EMs)多發(fā)于育齡期婦女,由多因素、多遺傳基因作用導(dǎo)致具有活性的子宮內(nèi)膜組織異位,生長(zhǎng)在子宮腔以外并反復(fù)周期性出血,從而引起患者慢性盆腔痛、痛經(jīng)、不孕等[1-2]。近年來(lái),隨著社會(huì)快速發(fā)展,生活節(jié)奏加快,臨床上EMs發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì),成為臨床上常見(jiàn)且危害較大的一類婦科疾病,嚴(yán)重影響婦女的生活質(zhì)量、生育功能和身心健康[3]。目前EMs的發(fā)病機(jī)制尚未得到明確闡明,臨床上也缺乏治療EMs的特效藥,因此探究與EMs發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因,以期找尋預(yù)防、診斷和治療EMs的新靶點(diǎn)對(duì)EMs患者意義重大。雌激素受體β(estrogen receptorβ,ERβ)作為可溶性糖蛋白分子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá),雌激素在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮生理功能必須通過(guò)ERβ介導(dǎo)[4-5]。EMs受雌激素調(diào)控,因此ERβ基因的變化可能影響雌激素的生理作用,從而導(dǎo)致EMs發(fā)病[6]。ERβ基因在EMs患者血清中表達(dá)水平未見(jiàn)相關(guān)研究,因此本研究使用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法檢測(cè)EMs患者血清中ERβ基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性,分析rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率與EMs患者臨床病理特征的關(guān)系,報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 選取于2017年6月—2019年6月邯鄲市中心醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科收治的60例EMs患者作為研究對(duì)象(EMs組),依據(jù)2015年“子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南”[7],超聲影像為無(wú)回聲區(qū)內(nèi)有密集光,腹腔鏡檢觀察病變形態(tài),經(jīng)病理檢查確診。EMs組年齡21 ~51(35.23±3.48)歲,體質(zhì)量指數(shù)(22.94±3.19)kg/m2;根據(jù)美國(guó)生育協(xié)會(huì)在1997年修訂的EMs分期(R-AFS)[8],Ⅰ期8例,Ⅱ期12例,Ⅲ期19例,Ⅳ期21例;病理類型,卵巢型21例,腹膜型20例,混合型19例;痛經(jīng)情況,無(wú)或輕度痛經(jīng)29例,中或重度痛經(jīng)31例;產(chǎn)次,0次11例,1次34例,≥2次15例;有流產(chǎn)史33例;有不孕史19例。另選取同期來(lái)邯鄲市中心醫(yī)院體檢的健康女性67例作為對(duì)照組,年齡22~52(36.17±2.91)歲,體質(zhì)量指數(shù)(22.74±4.50)kg/m2;產(chǎn)次,0次13例,1次36例,≥2次18例;有流產(chǎn)史36例;有不孕史20例。2組受試者年齡、體質(zhì)量指數(shù)、孕產(chǎn)情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》,入選者知情同意并簽署知情同意書。

    1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)月經(jīng)周期正常;(2)6個(gè)月內(nèi)未曾使用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患有其他婦科腫瘤或婦科病的者;(2)伴有心、腎、肝功能不全者;(3)免疫功能缺陷者;(4)處于妊娠期的受試者。

    1.3 主要試劑和儀器 rs1256064和rs1256049引物序列由上海生物工程公司合成;DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;SimpliAmp PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽飛世爾科技有限公司。

    1.4 檢測(cè)方法 清晨取所有受試者空腹靜脈血6 ml,用肝素抗凝,隨后置于-20℃冰箱中待用。

    1.4.1 用DNA提取試劑盒提取基因: rs1256064位點(diǎn)上游引物序列5’-TGATTGCTCAGCACATAGCC-3’,下游引物序列5’-GACAGGTCTTCAGCACCACA-3’;rs1256049位點(diǎn)上游引物序列5’-TCTACACACACAGGGAGCTGA-3’,下游引物序列5’-CAGGACTTTGTTCCCACTCAC -3’;PCR擴(kuò)增體系共20.0 μl,其中上下游引物(5μmol)各2.0 μl,ddH2O 4.0 μl,SYBR Mix 10.0 μl,cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl。PCR反應(yīng)條件:95℃ 5min,(95℃變性45s,60℃延伸60s)×40,72℃ 10min。

    1.4.2 酶切PCR擴(kuò)增引物: rs1256064和rs1256049位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,酶切體系共20.0 μl,其中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物16 μl,10×Buffer 2.1 μl,RsaI 0.7 μl,BSA 0.2 μl。酶切反應(yīng)條件為37℃ 4 h。將酶切后的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析,凝膠成像儀成像,隨后根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小確定基因型。

    2 結(jié) 果

    2.1 2組rs1256064位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256064位點(diǎn)基因318 bp片段,經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生153 bp和165 bp 2個(gè)片段,在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對(duì)照組相比,EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數(shù)顯著升高,PP基因型數(shù)顯著降低(P<0.01),p等位基因頻率顯著升高,P等位基因頻率顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表1。

    2.2 2組rs1256049位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256049位點(diǎn)基因299 bp片段,經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生105 bp和172 bp 2個(gè)片段,在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對(duì)照組相比,EMs患者組rs1256049等位基因PP基因型數(shù)顯著升高,Pp基因型數(shù)顯著降低(P<0.05),P等位基因頻率顯著升高,p等位基因頻率顯著降低(P<0.05), 見(jiàn)表2。

    2.3 rs1256064、rs1256049位點(diǎn)基因與子宮內(nèi)膜異位癥臨床病理特征的關(guān)系 rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無(wú)流產(chǎn)、有無(wú)不孕史有關(guān)(P<0.05),與EMs患者年齡、病理類型、有無(wú)痛經(jīng)、產(chǎn)次無(wú)關(guān)(P>0.05), 見(jiàn)表3。

    2.4 影響子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析表明,臨床分期、不孕史、rs1256064位點(diǎn)p等位基因頻率升高、rs1256049位點(diǎn)P等位基因頻率升高是EMs發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表4。

    表1 2組rs1256064位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

    表2 2組rs1256049位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

    表3 rs1256064和rs1256049位點(diǎn)與子宮內(nèi)膜異位癥臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

    表4 影響EMs發(fā)病的多因素Logistic回歸分析

    3 討 論

    EMs因侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高成為臨床上婦科難治疾病,育齡期婦女發(fā)病率高達(dá)10%,成為婦女不孕癥的危險(xiǎn)因素[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn),不孕癥婦女患者中25%~50%伴有EMs,盆腔體檢正常的育齡女性超過(guò)50%患有不同程度的EMs。到目前為止,很多學(xué)者對(duì)EMs的發(fā)病機(jī)制開(kāi)展大量的臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn),但仍無(wú)法完全闡述EMs的具體發(fā)病機(jī)制[11-12]。學(xué)術(shù)界對(duì)免疫學(xué)、子宮內(nèi)膜種植、遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制頗有爭(zhēng)論,隨著生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,ERβ基因與EMs發(fā)生發(fā)展的關(guān)系受到重視,成為研究的熱點(diǎn)[13]。但大多從細(xì)胞或動(dòng)物模型上探討ERβ與EMs的關(guān)系,在臨床上未曾對(duì)ERβ基因具體核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行研究。因此本研究選ERβ基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸,試圖從基因水平上找尋ERβ基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與EMs發(fā)病之間的相關(guān)性。

    ERβ基因由40 kb堿基組成,位于14q23-24.1,包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子,廣泛分布在兩性組織和生殖器官中,在人乳腺、卵巢、子宮內(nèi)膜中表達(dá),且分泌期低表達(dá),增生期高表達(dá)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),ERβ可能與子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)[16]。李鵬程等[17]研究發(fā)現(xiàn),ERβ在EMs大鼠模型子宮內(nèi)膜中高表達(dá),可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、氨基末端激酶(c-Jun)表達(dá)水平,在EMs發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在廣西壯族絕經(jīng)婦女血清雌二醇、孕酮水平研究中,ERβ基因經(jīng)Rsa-Ⅰ內(nèi)切酶酶切出RR、Rr、rr、r、R基因組,r基因組孕酮和雌二醇水平顯著降低,黃體生成素、促卵泡激素顯著升高[18]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256064位點(diǎn)基因318 bp片段,經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后分別產(chǎn)生153 bp、165 bp 2個(gè)片段,與對(duì)照組相比,EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數(shù)和p等位基因頻率顯著升高,PP基因型數(shù)和P等位基因頻率顯著降低,提示rs1256064位點(diǎn)基因與EMs相關(guān)。對(duì)rs1256049等位基因研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256049位點(diǎn)基因299 bp片段,經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生105 bp和172 bp 2個(gè)片段,與對(duì)照組相比,EMs組患者rs1256049等位基因PP基因型數(shù)和P等位基因頻率顯著升高,Pp基因型數(shù)和p等位基因頻率顯著降低,提示rs1256049位點(diǎn)基因與EMs有關(guān),可能此類基因特征患者更易患EMs。臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn),rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無(wú)流產(chǎn)、有無(wú)不孕史有關(guān),與EMs患者年齡、病理類型、有無(wú)痛經(jīng)、產(chǎn)次無(wú)關(guān),提示rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率可能參與EMs進(jìn)程,與EMs發(fā)生發(fā)展相關(guān),多因素Logistic回歸分析表明,臨床分期、不孕史、rs1256064位點(diǎn)p等位基因頻率升高、rs1256049位點(diǎn)P等位基因頻率升高是EMs發(fā)病的危險(xiǎn)因素,提示該類患者具有患EMs風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)定期體檢,注意防治。

    綜上所述,EMs患者rs1256064位點(diǎn)基因pp基因數(shù)和p等位基因頻率、rs1256049位點(diǎn)基因PP基因數(shù)和P等位基因頻率顯著升高,與患者臨床分期、不孕史有關(guān),是EMs患病的危險(xiǎn)因素,提示rs1256064和rs1256049位點(diǎn)可能作為早期預(yù)防和判斷EMs的臨床指標(biāo)。但rs1256064和rs1256049位點(diǎn)基因具體作用機(jī)制還有待從動(dòng)物和細(xì)胞模型進(jìn)行深入研究。

    利益沖突:所有作者聲明無(wú)利益沖突

    作者貢獻(xiàn)聲明

    郝娜:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,論文撰寫;田蕓婕:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;賈亞靜:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;路曉琳:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

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