循環(huán)miRNA作為癲癇診斷潛在生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

趙海燕，黃穎綜述 李永男審校

癲癇是一種常見的危害性極大并且發(fā)病機(jī)制尚不明確的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征是不可預(yù)測(cè)性的癲癇發(fā)作。由于其致殘率高、臨床反復(fù)發(fā)作和病程漫長(zhǎng)，嚴(yán)重影響患者的身心健康并且給社會(huì)帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，通過對(duì)循環(huán)miRNA表達(dá)譜的研究，在癲癇患者和癲癇動(dòng)物模型中已確定存在100多種不同miRNAs的表達(dá)變化，并有證據(jù)表明癲癇與循環(huán)miRNAs表達(dá)變化有關(guān)。本文就癲癇患者或癲癇動(dòng)物模型中差異性表達(dá)的循環(huán)miRNA及其與癲癇的相關(guān)性進(jìn)行綜述。

1 癲癇診療現(xiàn)狀

全世界癲癇患者有6 500萬人，約占世界人口的1%～2%[1-2]。目前，其診斷主要依賴于病史和臨床輔助檢查[3]，而輔助檢查中除在癲癇監(jiān)測(cè)單元中進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)腦電圖外，其他類型的腦電圖檢測(cè)率有限，許多癲癇患者的腦部影像學(xué)檢查為陰性[4]。目前，大部分癲癇患者經(jīng)過正規(guī)的抗癲癇藥物治療可有效控制，但仍有部分患者不能完全控制，其主要因素之一是癲癇病因的復(fù)雜性及異質(zhì)性。隨著2015年精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注如何能做到疾病的精確診斷和靶向治療。因此，找出有效的生物標(biāo)志物將有助于對(duì)癲癇作出快速正確的診斷和分類，同時(shí)為開發(fā)癲癇靶向藥物治療提供理論基礎(chǔ)。

2 循環(huán)miRNA作為癲癇潛在生物標(biāo)志物

2.1 循環(huán)miRNA MicroRNA(miRNA)是內(nèi)源性18～23個(gè)堿基的小片段非編碼RNA，作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，主要通過與其靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，使目標(biāo)mRNA降解或抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖及分化、細(xì)胞死亡、代謝等生物學(xué)過程，在基本生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[5]。存在于血液、尿液、唾液、精液、淚液、乳汁及羊水等體液中的一類miRNA統(tǒng)稱為循環(huán)miRNA[6]。近年來，循環(huán)miRNA因其具有穩(wěn)定、易檢測(cè)、經(jīng)濟(jì)及無創(chuàng)等特點(diǎn)而備受關(guān)注，已成為許多疾病的新型診斷工具[7]。

2.2 循環(huán)miRNA作為癲癇潛在生物標(biāo)志物 在腦組織中，特定細(xì)胞類型表達(dá)特定的miRNA，這些miRNA是維持其生理特性和細(xì)胞骨架所必需的。已發(fā)現(xiàn)miRNA在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中富集或獨(dú)特表達(dá)[8-9]。合成miRNA關(guān)鍵酶的缺失可導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)和功能上的巨大變化，從而導(dǎo)致神經(jīng)變性和反復(fù)癇性發(fā)作(即癲癇)的發(fā)生，即使一種miRNA的缺失也足以產(chǎn)生明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病表型[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇患者腦組織和癲癇動(dòng)物模型中發(fā)生miRNA表達(dá)變化，并且這些變化也可以在循環(huán)中檢測(cè)到[11]。這些研究結(jié)果為在miRNA水平對(duì)癲癇的診斷和治療開辟了新的途徑，也為癲癇患者的靶向治療帶來新的希望。目前，對(duì)癲癇相關(guān)miRNA的研究主要是對(duì)差異性表達(dá)的循環(huán)miRNA進(jìn)行篩選。然而，這些差異性表達(dá)的循環(huán)miRNA在癲癇的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚不十分明確。

3 循環(huán)miRNAs表達(dá)與癲癇的相關(guān)性研究

3.1 miR-134 研究表明，miR-134在大腦中豐富表達(dá)，可定位于神經(jīng)元樹突，并負(fù)向調(diào)節(jié)樹突棘的大小[12]。Avansini等[13]通過對(duì)顳葉內(nèi)側(cè)癲癇(mesial temporallobe epilepsy，MTLE)14例、局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focal cortical dysplasia，F(xiàn)CD)13例和正常對(duì)照16例的血漿miRNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，hsa-miR-134在MTLE患者血漿中顯著下調(diào)，而在FCD患者血漿中沒有下調(diào)。為了進(jìn)一步評(píng)估hsa-miR-134作為MTLE生物標(biāo)志物的穩(wěn)定性，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法驗(yàn)證了65例MTLE患者和83例對(duì)照組的獨(dú)立隊(duì)列證實(shí)，與對(duì)照組相比，MTLE患者血漿中hsa-miR-134顯著下調(diào)。因此，hsa-miR-134的表達(dá)下調(diào)或是MTLE一種潛在的非侵入性生物標(biāo)志物。最近的研究表明[14]，通過側(cè)腦室注入紅藻氨酸(kainic acid，KA)誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)大鼠模型中，miR-134的表達(dá)在大鼠海馬中顯著上調(diào)。而應(yīng)用miR-134拮抗劑后，不僅減少癲癇發(fā)作，并且抑制癲癇損傷所誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)的CHOP、Bim和細(xì)胞色素C的表達(dá)，還促進(jìn)海馬中環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)的表達(dá)。TUNEL和Nissl染色分析亦顯示，沉默miR-134的表達(dá)，可抑制癲癇所誘導(dǎo)的海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元凋亡及苔蘚纖維的異常發(fā)芽。在戊四唑(pentylenetetrazol，PTZ)癲癇模型、穿孔途徑刺激(perforant pathway stimulation，PPS)癲癇模型等多種顳葉癲癇模型中，沉默miR-134均可起到有效的抗癲癇作用[15-17]。這些研究結(jié)果表明，miR-134可能是有效的顳葉癲癇診斷標(biāo)志物，而抑制其表達(dá)是治療顳葉癲癇的干預(yù)措施。

3.2 miR-301a-3p Wang等[18]使用Illumina HiSeq 2000測(cè)序發(fā)現(xiàn)，30例耐藥性患者和30例非耐藥性癲癇患者之間血清miRNA存在差異性表達(dá)。然后，通過實(shí)時(shí)定量PCR法在77例耐藥性癲癇患者、81例非耐藥性癲癇患者和85例健康對(duì)照者中驗(yàn)證所選擇的miRNA。發(fā)現(xiàn)與非耐藥性癲癇組和健康對(duì)照組相比，耐藥性癲癇組血清miR-194-5p、miR-301a-3p、miR-30b-5p、miR-342-5p和miR-4446-3p表達(dá)顯著下調(diào)。其中，miR-301a-3p是鑒別耐藥性癲癇和非耐藥性最有價(jià)值的生物標(biāo)志物。多元回歸分析顯示，miR-301a是耐藥癲癇診斷的潛在生物標(biāo)志物，其敏感度為80.5%，特異度為81.2%，且其表達(dá)水平下調(diào)與癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果表明，血清miR-301a-3p或成為耐藥性癲癇診斷的潛在生物標(biāo)志物。

3.3 miR-106b及miR-146a Wang等[19]使用Illumina HiSeq2000測(cè)序篩選30例癲癇患者和30例健康對(duì)照組血清中差異性表達(dá)的miRNAs。然后，通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)117例癲癇患者和112例健康對(duì)照者中進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，癲癇患者血清miR-7d-5p、miR-106b-5p、miR-130a-3p和miR-146a-5p表達(dá)上調(diào)，而miR-15a-5p和miR-194-5p表達(dá)下調(diào)。其中，miR-106b-5p對(duì)癲癇的診斷價(jià)值最高，其敏感度為80.3%，特異度為81.2%。這一結(jié)果提示，miR-106b-5p可作為癲癇新的無創(chuàng)性診斷生物標(biāo)志物。An等[20]招募了90例癲癇患者(其中，57例為全身性癲癇發(fā)作，33例為局灶性癲癇發(fā)作)和90例健康對(duì)照者，通過PCR方法檢測(cè)了癲癇患者和對(duì)照組血清中4種與癲癇相關(guān)miRNAs，即miR-106b、miR-146a、miR-194-5p和miR-301a的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，癲癇組血清miR-106b、miR-146a和miR-301a顯著上調(diào)，而miR-194-5p顯著下調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-106b和miR-146a的表達(dá)上調(diào)水平與癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且在血清中兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)癲癇的預(yù)測(cè)具有更好的敏感度和特異度。這些研究表明，血清miR-106b及miR-146a可以作為診斷癲癇和評(píng)估其嚴(yán)重程度的潛在生物標(biāo)志物。

3.4 miR-129-2-3p Sun等[21]研究難治性顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy，TLE)患者的顳葉皮質(zhì)組織與血漿中所表達(dá)miRNA的相關(guān)性，首先，在手術(shù)中切除致癇灶的9例難治性TLE患者的顳葉皮質(zhì)和8例因高血壓顳葉出血而行腦出血清創(chuàng)術(shù)所獲得的顳葉皮質(zhì)中，使用Affymetrix miRNA 4.0微陣列法篩選出差異性表達(dá)的miRNAs；然后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法，在13例難治性TLE患者(包括9例用于微陣列篩選的患者)和13例無癲癇發(fā)作史及抗癲癇藥物接觸史的對(duì)照者(高血壓顳葉出血而行腦出血清創(chuàng)術(shù)的患者作對(duì)照)的顳葉皮質(zhì)腦組織中驗(yàn)證所選的差異性表達(dá)miRNAs；最后，再通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)來自25例難治性TLE患者和25例對(duì)照者血漿樣品中所選miRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-129-2-3p在難治性TLE患者的顳葉皮質(zhì)組織和血漿中均表達(dá)上調(diào)，且隨癲癇發(fā)作頻率的增加，血漿中miRNA-129-2-3p的表達(dá)水平也上調(diào)，癲癇患者的預(yù)后亦差。因此，血漿miRNA-129-2-3p或作為潛在的非侵入性生物標(biāo)志物，可用于難治性TLE的早期檢測(cè)和臨床預(yù)后評(píng)估。

3.5 miR-145 研究表明，在SH-SY5Y細(xì)胞水平miR-145表達(dá)增高，可誘導(dǎo)BCL2相互作用蛋白3(Bnip3)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，引起caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)增多，進(jìn)而線粒體自噬受抑制，最終導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[22]。Shen等[23]通過實(shí)時(shí)定量PCR分析，40例難治性顳葉癲癇患者和42例健康對(duì)照者血漿中的miR-145-5p表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-145-5p在難治性顳葉癲癇患者血漿中的表達(dá)明顯下調(diào)，而且其表達(dá)的降低程度與癲癇患者的發(fā)病年齡、癲癇發(fā)作頻率呈正相關(guān)。此項(xiàng)研究表明，血漿miR-145-5p可作為難治性顳葉癲癇早期檢測(cè)和臨床評(píng)估的潛在非侵入性生物標(biāo)志物。

3.6 miR-141 近年來，由于miR-141家族具有誘導(dǎo)神經(jīng)腫瘤細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)，而作為抑癌基因受廣泛關(guān)注[24]。在許多癌癥中，miR-141的表達(dá)水平下調(diào)，影響腫瘤細(xì)胞凋亡、衰老、增殖和浸潤(rùn)[25]。Liu等[26]通過微陣列分析和實(shí)時(shí)定量PCR方法，檢測(cè)皮下注射KA制作的SE小鼠模型血清中miR-141表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，SE組小鼠血清中miR-141顯著上調(diào)。在體外細(xì)胞癲癇模型中顯示，過表達(dá)的miR-141可促進(jìn)caspase-3、caspase-9、Bax及p53蛋白表達(dá)和降低細(xì)胞沉默調(diào)節(jié)蛋白1(silent information regulator 1，SIRT1)的表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖；而應(yīng)用miR-141拮抗劑則引起與此相反的效果。這一研究結(jié)果表明，通過對(duì)miR-141在癲癇動(dòng)物模型中表達(dá)水平的變化及其所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的進(jìn)一步探索，血清miR-141或作為癲癇診斷和治療的生物標(biāo)志物。

3.7 miR-30a 為了探究癲癇患者在癲癇發(fā)作期與癲癇發(fā)作間期循環(huán)miRNAs的表達(dá)差異，Sun等對(duì)3例癲癇患者分別在癲癇發(fā)作期和發(fā)作間期收集血清用于miRNAs表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示，與癲癇發(fā)作間期相比，在癲癇發(fā)作期患者血清中15個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，10個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。然后，在90例癲癇患者組成的擴(kuò)展隊(duì)列中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與癲癇發(fā)作間期相比，癲癇發(fā)作期患者血清中miR-30a、miR-378、miR-106b和miR-15a表達(dá)上調(diào)。其中，miR-30a的表達(dá)上調(diào)水平與發(fā)作頻率呈正相關(guān)，而與癲癇發(fā)病的性別、年齡、病史長(zhǎng)短無顯著相關(guān)性[27]。因此，血清miR-30a可有助于預(yù)測(cè)癲癇發(fā)作的預(yù)后。

4 小結(jié)及展望

到目前為止，對(duì)癲癇診斷的輔助檢查主要是基于腦電圖和影像學(xué)檢查，然而這些輔助檢查的陽性率不高，且費(fèi)用較昂貴。因此，需要尋找經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、簡(jiǎn)便易行的新型診斷生物標(biāo)志物。近年來，通過對(duì)循環(huán)miRNA表達(dá)譜的研究，在癲癇患者和癲癇動(dòng)物模型中已確定存在100多種不同miRNAs的表達(dá)變化，并有證據(jù)表明癲癇與循環(huán)miRNAs表達(dá)變化有關(guān)。然而，由于游離的循環(huán)miRNA生成具有高度異質(zhì)性，且miRNA的循環(huán)環(huán)境中存在RNA酶、pH變化等因素，這在很大程度上限制了其作為生物標(biāo)志物的潛力。如果miRNA被包裝在外泌體中，外泌體的膜結(jié)構(gòu)可以有效保護(hù)封閉的miRNA免受生物體液中存在的RNA酶的影響，從而使外泌體中的miRNA比游離的循環(huán)miRNA更可靠。與此同時(shí)，外泌體中miRNA還可直接反映來源細(xì)胞的生理、病理及其功能狀態(tài)[28]，更有助于癲癇的精準(zhǔn)診斷和治療。通過對(duì)外泌體中差異性表達(dá)的miRNA及其靶基因和相關(guān)調(diào)控通路的研究，可更好地對(duì)癲癇進(jìn)行診治。