大鼠深低溫停循環(huán)抑制Akt信號通路影響認知功能

深低溫停循環(huán)(DHCA) 作為心臟外科手術(shù)中的一項重要輔助方式，于1953年最早應用于成人心臟外科領(lǐng)域[1]。DHCA可為術(shù)者提供清晰視野，降低患者機體代謝率，延長缺血缺氧耐受時間，在主動脈弓部手術(shù)及復雜先天性心臟病的矯治手術(shù)中成為必不可少的輔助措施。近年來，隨著DHCA技術(shù)的迅猛發(fā)展以及術(shù)者手術(shù)操作水平的提高，DHCA相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率及術(shù)后患者的死亡率明顯下降。然而，腦神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥仍然是DHCA的嚴重并發(fā)癥，DHCA輔助下半弓置換術(shù)新發(fā)腦血管事件的發(fā)生率為5.4%[2]，DHCA術(shù)后患者暫時性神經(jīng)功能障礙的發(fā)生率高達25%[3]。DHCA心臟手術(shù)后12周內(nèi)神經(jīng)心理功能障礙的發(fā)生率更可高達55%[4]。本文通過建立大鼠DHCA模型，探究大鼠DHCA術(shù)后腦組織病理及認知功能等變化情況及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年雄性清潔級SD大鼠16只，體質(zhì)量350～450 g。隨機分為假手術(shù)組及DHCA組，每組8只。

1.2 DHCA模型構(gòu)建

SD大鼠術(shù)前禁食12 h，應用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)通過腹腔注射麻醉。取頸部正中切口，用14G套管針經(jīng)氣管穿刺插管，連接呼吸機，調(diào)整呼吸頻率在60～70次/min，潮氣量2 mL/100 g，根據(jù)血氣分析結(jié)果調(diào)整參數(shù)以維持PaO2>60 mmHg，PaCO230～50mmHg，停循環(huán)期間暫停機械通氣。左側(cè)股部切開暴露股淺動脈，用24G靜脈留置針穿刺置管，注射150 IU肝素抗凝，連接體外循環(huán)動脈灌注端。暴露右側(cè)頸外靜脈，用自制多孔14G套管針穿刺置管，連接體外循環(huán)靜脈回流端。暴露右側(cè)頸外動脈，用24G靜脈留置針穿刺置管，連接多導生理監(jiān)護儀監(jiān)測生命體征，溫度計潤滑后插入大鼠肛門監(jiān)測體溫。

體外循環(huán)由儲血器、小動物膜肺、蠕動泵、氧氣源、硅膠管道、輸液管、變溫水箱組成。管道預充液：6%羥乙基淀粉8 mL、5%碳酸氫鈉1 mL、肝素1 mL(100 IU/mL)[5]。管路自循環(huán)排氣。體外循環(huán)30 min降溫至18 ℃，停循環(huán)1 h，再灌注復溫30 min使體溫達到34 ℃，逐漸減少流量，停機撤除體外循環(huán)。繼續(xù)機械通氣至大鼠基本恢復正常自主呼吸，拔除氣管插管，縫合各切口，置于富氧環(huán)境中觀察。假手術(shù)組只進行插管操作，不進行體外循環(huán)及DHCA。于體外循環(huán)前、降溫20 min時、復溫20 min時、停止體外循環(huán)前采集動脈血行血氣分析。

1.3 Western blot法檢測海馬組織相關(guān)蛋白表達

再灌注4 h后，每組取4只SD大鼠處死，取腦組織保存于-80℃冰箱。分離出海馬組織勻漿，采用BCA法進行蛋白定量，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗過夜，孵育熒光二抗后分別檢測兩組海馬組織中絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、B淋巴細胞瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、活化胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表達水平，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 Morris 水迷宮實驗

每組取4只SD大鼠于術(shù)后第1天開始行Morris水迷宮實驗，以評估空間學習記憶及運動功能。水迷宮由直徑150 cm、高60 cm的圓形水池及相應攝像機和數(shù)據(jù)分析軟件組成，向水池中注入適當清水，并加入墨汁使其呈不透明狀態(tài)，將水池平均分為4個象限，每個象限內(nèi)壁畫有固定參照物，選擇其中1個象限中央放入直徑12 cm、高50 cm的黑色圓形平臺，低于水面約2 cm，且保持位置不變[6]。水迷宮實驗由兩部分組成，術(shù)后第1天為預實驗，選擇一固定位置將大鼠放入水中，自由游泳120 s，使其適應環(huán)境并初步檢驗運動能力。術(shù)后第2～5天為定位航行實驗，每天將大鼠面向池壁分別從4個不同象限參照物位置放入水中，記錄大鼠找到隱藏平臺的時間，該時間稱為逃避潛伏期。如果找到平臺，讓其在平臺上停留4 s，如果在120 s內(nèi)未找到平臺，則逃避潛伏期記為120 s，并由實驗人員將其牽引至平臺位置停留4 s。術(shù)后第6天為空間探索實驗，撤去隱藏平臺，任選同一象限，將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在120 s內(nèi)跨越平臺位置的次數(shù)及運動速度。

1.5 形態(tài)學檢測海馬組織病理損傷

每組取4只SD大鼠于術(shù)后第7天處死，經(jīng)主動脈灌流后取完整腦組織于4%多聚甲醛中固定24 h，沿冠狀面切取海馬組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋。制備成5 μm厚的石蠟切片用于HE染色及尼氏染色，光學顯微鏡下觀察海馬組織CA1區(qū)的病理形態(tài)學變化。HE染色后于400倍放大視野下觀察異常細胞占總體的比例，病理學評分：0分=無損傷；1分=0%～12.5%損傷；2分=12.5%～25%損傷；3分=25%～50%損傷；4分=50%以上損傷[7]。尼氏染色后于400倍放大視野下計數(shù)存活神經(jīng)元的個數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，符合正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布的計量資料采用秩和檢驗。逃避潛伏期組間比較采用兩因素重復測量的方差分析。HE染色病理學評分采用曼-惠特尼U檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生理指標比較

DHCA組8只大鼠均順利脫離體外循環(huán)，并恢復自主呼吸。各組生理指標如表1所示。兩組大鼠術(shù)前體質(zhì)量、平均動脈壓、心率、體溫、pH值、PaO2、PaCO2的差異無統(tǒng)計學意義。在降溫及復溫期間，DHCA組的平均動脈壓及心率低于假手術(shù)組(P均<0.05)，在停機前，DHCA組平均動脈壓及心率仍低于假手術(shù)組(P均<0.05)，可能因停循環(huán)對心功能產(chǎn)生影響，導致術(shù)后心率、血壓未能立刻恢復至術(shù)前狀態(tài)。在反映大鼠機體酸堿平衡的指標中，DHCA組的pH值在降溫及復溫過程中均低于假手術(shù)組(P<0.05)，呈現(xiàn)一定程度的酸中毒。DHCA組PaCO2在體外循環(huán)期間低于假手術(shù)組(P均<0.05)，停機前與假手術(shù)組無統(tǒng)計學差異。

表1 假手術(shù)組與DHCA組大鼠生理指標比較

注：與假手術(shù)組比較，(1)P<0.05

2.2 兩組海馬組織相關(guān)蛋白表達水平的比較

在大鼠海馬組織中，DHCA組與假手術(shù)組Akt的蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異，DHCA組p-Akt蛋白表達水平、p-Akt/Akt的比值較假手術(shù)組明顯降低(P均<0.05)。DHCA組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯低于假手術(shù)組，促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3的表達水平明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)。見圖1、表2。

2.3 兩組Morris水迷宮結(jié)果比較

在定位航行實驗的第1、2、4天，假手術(shù)組的逃避潛伏期均小于DHCA組(P均<0.05)，第3天兩組的逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異。經(jīng)過4 d的訓練，兩組第4天的逃避潛伏期均小于第1天(P均<0.05)，假手術(shù)組第4天與第1天的差異較DHCA組更明顯?？臻g探索實驗中，DHCA組大鼠跨越原有平臺位置的次數(shù)較假手術(shù)組明顯減少，運動速度明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)。見表3。

圖1 Western blot檢測兩組大鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達情況

表2 兩組大鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達水平比較

注:與假手術(shù)組組相比，(1)P<0.05

表3 兩組大鼠Morris水迷宮結(jié)果比較

注:與假手術(shù)組相比，(1)P<0.05

2.4 兩組形態(tài)學結(jié)果比較

術(shù)后第7天對兩組大鼠的腦組織海馬CA1區(qū)進行組織病理學評估。HE染色可見假手術(shù)組的神經(jīng)細胞形態(tài)正常，細胞核形態(tài)清晰，細胞膜及胞漿結(jié)構(gòu)完整；DHCA組部分神經(jīng)元胞體腫脹，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞呈現(xiàn)病理改變，主要包括核固縮、三角形核形態(tài)、神經(jīng)細胞皺縮、嗜酸細胞漿變化等，正常神經(jīng)細胞比例低于假手術(shù)組，病理評分明顯高于假手術(shù)組[(2.50±0.58)分對(0.50±0.58)分，P<0.05]。兩組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)細胞排列整齊，細胞形態(tài)及層次清晰，尼氏體染色較深、分布均勻；DHCA組細胞排列紊亂，尼氏體淡染，正常神經(jīng)細胞數(shù)目明顯少于假手術(shù)組[(48.25±3.50)個對(68.25±2.63)個，P<0.05]。見圖2。

圖2 兩組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色、尼氏染色結(jié)果

3 討論

本研究通過建立大鼠DHCA模型評估術(shù)后腦損傷，在大鼠損傷程度最輕的情況下還原手術(shù)中DHCA的降溫、停循環(huán)、復溫過程，以減少其他因素對大鼠腦組織的影響。DHCA腦損傷本質(zhì)上是一種全腦的缺血再灌注損傷，海馬是對缺血較敏感的區(qū)域[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DHCA組大鼠中，顯微鏡下可見海馬CA1區(qū)部分神經(jīng)細胞出現(xiàn)病理形態(tài)學改變，正常神經(jīng)細胞數(shù)目少于假手術(shù)組，提示DHCA對大鼠腦組織造成了損傷。

研究表明，低溫可降低腦組織的氧消耗，相對減輕腦組織的能量消耗，DHCA后腦神經(jīng)元壞死并非主要病理改變，線粒體功能障礙和其觸發(fā)的神經(jīng)元凋亡才是腦缺血再灌注損傷的主要機制[9]。凋亡是細胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的程序性死亡，但凋亡過多則是病理現(xiàn)象，可引起持續(xù)性腦損傷，海馬回、齒狀回神經(jīng)元凋亡與創(chuàng)傷后的認知缺陷、行為改變關(guān)系密切[10]。Bcl-2家族在細胞凋亡中起重要作用[11]，其成員包括抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL和促凋亡因子Bax、Bad、Bid[12]，Bcl-2與Bax的相對平衡與細胞的凋亡和存活密切相關(guān)[13]，Bcl-2通過抑制細胞凋亡促進細胞存活，Bax則誘導細胞凋亡。下調(diào)Bax/Bcl-2的比值可以抑制腦缺血所致海馬神經(jīng)元損失，并提高認知功能[14]。Bax可能是Bcl-2家族中最重要的促凋亡因子，Bax與Bcl-2結(jié)合后形成的異二聚體是發(fā)揮Bcl-2抗凋亡作用的關(guān)鍵。Caspase是導致細胞凋亡的蛋白酶家族，作為凋亡的執(zhí)行者發(fā)揮重要作用[15]。腦缺血后，caspase-9可激活線粒體介導的神經(jīng)細胞凋亡[16]，在死亡受體介導的凋亡通路中，caspase-8被激活[17]。二者均可使caspase-3前體裂解，產(chǎn)生具有活性的caspase-3片段，進而促進DNA修復蛋白、細胞骨架蛋白等裂解，最終導致細胞凋亡。本研究中，DHCA組大鼠經(jīng)過腦缺血再灌注損傷，海馬中的Bcl-2蛋白表達減少，Bax及cleaved caspase-3蛋白表達增加，提示DHCA組大鼠抗凋亡能力下降，DHCA通過誘導細胞凋亡引發(fā)腦損傷。

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號通路與腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)細胞凋亡密切相關(guān)。Akt處于該信號通路的核心位置，介導多種生物學效應，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子[18]。Akt磷酸化后成為p-Akt，通過多條信號通路抑制細胞凋亡，促進細胞存活[19]。在腦神經(jīng)系統(tǒng)中，p-Akt可作用于下游的Bcl-2家族[20- 21]、caspase家族[22-23]等與凋亡直接相關(guān)的因子，使其磷酸化并失去活性，進而促使抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄和表達，促進細胞存活。本研究中，DHCA組海馬組織中p-Akt/Akt減少，提示大鼠經(jīng)過DHCA后，抗凋亡調(diào)節(jié)因子p-Akt表達減少，抗凋亡能力下降，進而加重術(shù)后神經(jīng)細胞凋亡，引起腦損傷。p-Akt表達的變化趨勢與上述Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達的變化趨勢相對應，進一步說明DHCA通過Akt信號通路影響下游相關(guān)靶蛋白的表達，促使神經(jīng)細胞凋亡，引起腦損傷。

記憶學習功能是大腦的高級功能之一，認知及學習能力下降是腦損傷的重要標志，而海馬組織在學習、記憶、空間感知中發(fā)揮著極其重要的作用[24]。本研究利用DHCA對海馬組織造成缺血再灌注損傷，采用Morris水迷宮測試大鼠在DHCA術(shù)后的學習記憶及空間感知功能。研究發(fā)現(xiàn)，DHCA組大鼠的逃避潛伏期延長，說明DHCA組大鼠在學習記憶方面存在缺陷，有一定程度的損傷。在最后一天的空間探索實驗中，DHCA組大鼠經(jīng)過原有平臺的次數(shù)明顯減少，運動速度下降，說明DHCA對大鼠的空間感知能力、運動能力有一定影響。

綜上所述，本研究證實神經(jīng)細胞凋亡是DHCA缺血再灌注后腦損傷的主要機制，DHCA可能通過抑制p-Akt，影響下游凋亡相關(guān)因子的表達，從而對大鼠的學習記憶、空間感知、運動能力造成損傷。增加p-Akt的表達可能抑制神經(jīng)細胞凋亡，對DHCA的腦損傷產(chǎn)生保護作用。