慢性缺氧促心肌耐受急性缺血再灌注損傷的研究

缺血性心臟病是常見的心血管疾病，其中紫紺型先天性心臟病患者長期處于嚴(yán)重乏氧狀態(tài)[1-3]，在手術(shù)中進(jìn)行體外循環(huán)時提倡高濃度給氧，以保證氧供給，但高濃度補氧會加重心肌損害，不利于心肌功能恢復(fù)[4]。調(diào)節(jié)心肌血氧平衡、降低心肌負(fù)荷可緩解缺血再灌注后心肌損傷[5]。慢性缺氧處理是降低心肌缺血再灌注損傷的有效方法，心肌細(xì)胞會發(fā)生一系列慢性缺氧適應(yīng)性變化，但具體機制尚未明確。本研究探討慢性缺氧對心肌耐受缺血再灌注損傷的影響，以期為缺血性心臟病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、設(shè)備及試劑

60只體質(zhì)量為140～180 g的雄性SD大鼠由成都醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。高頻彩色超聲儀(Vevo 2100)、呼吸機(DH-150)購自加拿大VisualSonic公司；Langendorff灌流系統(tǒng)、多功能生理記錄儀、全自動生化分析儀購自美國BIOPAC公司。戊巴比妥鈉、肝素鈣購自江蘇常州千紅生化制藥股份有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒購自重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠。

1.2 動物分組

將60只SD大鼠隨機等分為實驗組和對照組，每組30只；再根據(jù)在體實驗及離體實驗分別將實驗組、對照組隨機等分，分為在體實驗組、在體對照組、離體實驗組和離體對照組，每組15只。4組大鼠均給予同質(zhì)飼料及飲用水，喂養(yǎng)28 d。實驗組大鼠在模擬海拔5 000 m的動物低壓低氧艙(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供)中生活，艙內(nèi)條件：大氣壓54 kPa，氧分壓11.33 kPa，溫度25 ℃。動物在艙內(nèi)自由攝食飲水，每3～4 d將艙內(nèi)氣壓調(diào)整1次，至相當(dāng)于海拔3 000 m，時間1 h。對照組大鼠在正常氧環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建在體缺血再灌注損傷模型

予以大鼠面罩吸氧，連接呼吸機，頻率50次/min，潮氣量2 mL/kg，吸呼比1∶2。備皮后，經(jīng)左側(cè)第3肋間隙進(jìn)入并撐開胸腔，仔細(xì)暴露心臟并辨別出左冠狀動脈前降支，將帶針縫線從前降支下穿過，在血管上方放置直徑1～2 mm聚乙烯管后打結(jié)。結(jié)扎后遠(yuǎn)端血管支配的區(qū)域顏色變蒼白，表明成功結(jié)扎血管并致心肌組織缺血。0.5 h后剪斷縫線，撤去聚乙烯管，觀察心臟缺血區(qū)域顏色恢復(fù)為粉紅色，關(guān)閉胸腔、復(fù)蘇大鼠。

造模24 h后行超聲心動圖檢測，隨后立即開腹，通過下腔靜脈注射100 IU肝素鈣并采血5 mL以檢測心肌酶，迅速摘除心臟，拭凈血液后稱重。

1.4 超聲心動圖檢測在體大鼠心功能

造模前24 h及造模后24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉大鼠，對大鼠稱重并固定于動物手術(shù)臺上，采用高頻彩色超聲儀13～24 MHz超聲探頭(MS250)檢測大鼠心率(HR)、舒張期室間隔厚度(IVSd) 、收縮期室間隔厚度(IVSs)、舒張期左室后壁厚度(LVPWd)、收縮期左室后壁厚度(LVPWs)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)，計算出每搏輸出量(SV)，SV=LVEDV-LVESV。

1.5 構(gòu)建離體心臟再灌注損傷模型

連接Langendorff灌流系統(tǒng)和多功能生理記錄儀，將壓力換能器與球囊相連接。向K-H溶液中通入95%O2、5%CO2混合氣體，使K-H溶液pH值維持在7.4左右，用K-H溶液沖洗整個Langendorff灌流系統(tǒng)。稱重SD大鼠，3%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)腹腔注射麻醉后開腹，經(jīng)下腔靜脈注射100 IU肝素鈣后取出心臟，在4 ℃ K-H溶液中洗凈殘余血液，迅速掛在Langendorff 灌流系統(tǒng)中，以80 cmH2O壓力行主動脈逆行灌注。待心臟復(fù)跳后，將壓力換能器和球囊經(jīng)左心耳放入左心室，緩緩向球囊內(nèi)注水，使左室舒張末期壓力維持在4～10 mmHg，記錄心室內(nèi)壓力變化。待心跳穩(wěn)定、心率>200次/min并持續(xù)20 min后，記錄心臟灌流液流出量，取500 μL灌流液置于EP管中，于-80 ℃冰箱保存，停止心臟灌注。30 min后打開灌流系統(tǒng)進(jìn)行再灌注，每10 min記錄一次心室內(nèi)壓力，60 min時取500 μL灌流液于EP管中，于-80 ℃冰箱保存待測，并摘除心臟。

1.6 心肌TTC染色和心肌梗死面積評估

TTC染色步驟：對心室進(jìn)行切片，厚度約為0.5 cm，將心肌片放入1% TTC溶液中，37 ℃恒溫水浴加熱20 min、10%多聚甲醛固定30 min后取出照相。采用ImageJ軟件測量，心肌梗死面積=心肌片梗死面積/心室肌總面積。

1.7 LDH和CK-MB活性檢測

將血液標(biāo)本及灌流液標(biāo)本3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清液作為檢測樣品。采用全自動生化分析儀檢測LDH和CK-MB活性，操作嚴(yán)格按照試劑盒檢測說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng) Kolmogorov-SmirnovD檢驗分析均為正態(tài)分布，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性缺氧對在體心臟缺血再灌注損傷的影響

2.1.1 在體實驗組與在體對照組大鼠缺血再灌注損傷前后超聲心動圖指標(biāo)比較 缺血再灌注前，在體實驗組HR、LVESV均明顯大于在體對照組(P均<0.05)，IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVFS、LVEDV、SV均明顯小于在體對照組(P均<0.05)。在體實驗組和在體對照組經(jīng)歷缺血再灌注后大鼠的心功能均有不同程度損傷。在體實驗組缺血再灌注后HR、IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEDV、LVESV均有不同程度上升(P均<0.05)，而LVEF、LVFS、SV有不同程度下降(P均<0.05)；在體對照組缺血再灌注處理后HR、LVEDV、LVESV有不同程度上升，IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVFS、SV較缺血再灌注前明顯下降(P均<0.05)。 缺血再灌注后，在體實驗組HR、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVFS均明顯大于在體對照組(P均<0.05)，IVSd、LVEDV、LVESV、SV均明顯小于在體對照組(P均<0.05)。見表1。

2.1.2 在體實驗組與在體對照組大鼠缺血再灌注損傷后心肌梗死面積及血清心肌酶水平比較 TTC染色后可見實驗組大鼠心肌梗死面積較對照組明顯減少[(0.07±0.02)%對(0.16±0.01)%，P<0.05]，見圖1。與對照組相比，實驗組CK-MB活性明顯降低[(176.14±20.82)IU/L對(658.83±74.18)IU/L，P<0.05]；兩組LDH活性無統(tǒng)計學(xué)差異[(610.86±72.20)IU/L對(574.67±63.35)IU/L]。

2.2 慢性缺氧對離體心臟缺血再灌注損傷的影響

2.2.1 離體實驗組與離體對照組大鼠離體心臟缺血再灌注損傷前后心室壓力指標(biāo)比較 壓力換能器測定缺血再灌注損傷前后心室內(nèi)壓力變化指標(biāo)大鼠左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末期壓力(LVEDP)變化情況，以及最大收縮速率[max(dp/dt)]、最大舒張速率[min(dp/dt)]的變化。缺血再灌注損傷前，離體實驗組LVDP低于離體對照組(P均<0.05)，兩組LVEDP的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)歷缺血再灌注損傷，離體實驗組及離體對照組LVDP均較缺血再灌注前下降，LVEDP均較缺血再灌注前上升(P均<0.05)；缺血再灌注損傷后，離體實驗組LVDP明顯高于離體對照組，LVEDP明顯低于離體對照組，(P均<0.05)。缺血再灌注損傷前，離體實驗組反映心室內(nèi)壓力變化快慢的指標(biāo)max(dp/dt)、min(dp/dt)均明顯低于離體對照組(P均<0.05)；經(jīng)歷缺血再灌注損傷后離體實驗組及離體對照組max(dp/dt)、min(dp/dt)均有不同程度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；缺血再灌注損傷后，離體實驗組max(dp/dt)、min(dp/dt)均明顯高于離體對照組(P均<0.05)。見表2。

表1 兩組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較

注：與在體對照組缺血再灌注前比較，(1)P<0.05；與在體對照組缺血再灌注后比較，(2)P<0.05；與在體實驗組缺血再灌注前比較，(3)P<0.05

注：灰白色區(qū)域為心肌梗死區(qū)，上圖為在體對照組，下圖為在體實驗組

表2 缺血再灌注前后兩組大鼠離體心室壓力指標(biāo)比較

注：與離體對照組缺血再灌注前比較，(1)P<0.05；與離體實驗組缺血再灌注前比較，(2)P<0.05；與離體對照組缺血再灌注后比較，(3)P<0.05

2.2.2 離體實驗組與離體對照組組大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后心肌梗死面積、LDH活性比較 TTC染色可見實驗組心肌梗死面積較對照組明顯減少[(0.08±0.01)%對(0.13±0.02)%，P<0.05]；實驗組LDH活性較對照組明顯降低[(4.00±0.37)IU/L對(7.33±0.99)IU/L，P<0.05]。

3 討論

心肌慢性缺氧是紫紺型先天性心臟病、肺源性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌肥厚等疾病的共同病理生理過程，研究慢性缺氧心肌的適應(yīng)性反應(yīng)及機制，對上述疾病的治療具有重要意義。

慢性缺氧不僅可以使心肌細(xì)胞超纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致心肌重構(gòu)及心臟收縮功能下降，還可以促進(jìn)血管活性物質(zhì)分泌，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，使肺動脈壓力升高，導(dǎo)致右心衰竭，引起慢性缺氧相關(guān)性心肌病。心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，缺氧會導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，但心肌細(xì)胞有較強的自我適應(yīng)及修復(fù)能力，可在應(yīng)激狀態(tài)下促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，維持心肌細(xì)胞數(shù)量，保存心臟功能。1986年，Murry等[6]首次提出慢性缺氧適應(yīng)是心肌一種重要的自我適應(yīng)能力，缺氧預(yù)處理可預(yù)防缺血和缺血再灌注損傷等對心肌造成的傷害。慢性缺氧時心肌細(xì)胞產(chǎn)生一系列結(jié)構(gòu)、功能、代謝變化，能增強心肌對急性缺氧導(dǎo)致的心肌梗死、收縮功能不良、室性心律失常等的耐受力[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧可增加血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)及線粒體數(shù)量，提高心肌組織供血及能量合成，使心肌能最大程度利用有限氧[9-10]。肖穎彬等[11]研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧時，心肌細(xì)胞可調(diào)節(jié)代謝相關(guān)激酶的活性，增加葡萄糖利用并減少脂肪酸利用；Peng等[12]研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧大鼠心肌細(xì)胞可以通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。通過以上多種適應(yīng)機制，慢性缺氧增強心肌細(xì)胞耐受應(yīng)激的能力。

再灌注雖可以增加缺血心肌的血流，挽救心肌，但同時又可造成不可逆轉(zhuǎn)的附加損傷[13]。研究表明，長時間的缺血再灌注損傷會導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡及功能障礙[14]，探究缺血再灌注損傷機制，對減少心肌損傷、降低缺血性心臟病的發(fā)生有重要意義。再灌注損傷的具體機制尚未明確，很多學(xué)者認(rèn)為其主要通過氧化應(yīng)激、線粒體功能異常導(dǎo)致心肌能量代謝異常和炎性反應(yīng)，從而造成心肌細(xì)胞功能障礙[15]。研究表明，缺血再灌注損傷時氧自由基增多[16]，心肌細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)受到破壞，蛋白質(zhì)功能受到抑制，其核酸和染色體也受到損害[17]，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能改變，引起心肌損傷。同時，缺血再灌注損傷可使線粒體功能受損，細(xì)胞色素氧化酶活性受抑，氧自由基生成增加[18]。缺血時心肌細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)迅速減少，再灌注時由于氧自由基的損傷，阻礙了心肌細(xì)胞氧化磷酸化的過程[19]，雙重作用下心肌耐受能力降低，從而造成細(xì)胞損傷。

臨床上缺血再灌注損傷比較常見，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)、非體外循環(huán)下冠狀動脈旁路移植術(shù)等均發(fā)生了在體缺血再灌注損傷的病理生理過程。常規(guī)體外循環(huán)下心臟手術(shù)停跳復(fù)跳過程是典型的缺氧-復(fù)氧過程，相當(dāng)于離體缺血再灌注損傷的病理生理過程。因此，本研究分別制作了大鼠在體、離體缺血再灌注損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧預(yù)處理能使缺血再灌注損傷后心肌梗死面積減少，心功能改善，從而減少心肌細(xì)胞在缺血再灌注后的損傷，維持心肌細(xì)胞更高的存活率。研究表明，再灌注時氧分壓越高，產(chǎn)生的氧自由基就越多，對心肌的損傷也越大；低氧分壓能使再灌注末的缺血心肌產(chǎn)生較少的氧自由基，顯著提高細(xì)胞抗氧化酶活性，使線粒體等超微結(jié)構(gòu)的損害減輕[20]。因此，我們認(rèn)為低氧減輕缺血再灌后心肌的損傷是由于低氧狀態(tài)下氧自由基生成減少，但其中涉及的具體信號通路尚未明確，需進(jìn)一步研究。