細(xì)胞蠟塊技術(shù)在晚期肺癌惡性胸水中的應(yīng)用價(jià)值*

彭麗姿 周 兵 張 菁

（九江市第一人民醫(yī)院病理科 江西九江 332000）

肺癌臨床癥狀不典型，部分發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期病例，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)［1］。肺癌的傳統(tǒng)治療，組織學(xué)分型及分期起著決定性的作用。因此，合并有惡性胸水的病例，細(xì)胞蠟塊技術(shù)結(jié)合免疫組化的精準(zhǔn)診斷就顯得尤為重要。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制的不斷研究，分子靶向治療改變了肺癌傳統(tǒng)治療［2］。相對(duì)傳統(tǒng)治療，其具備特異性高，不良反應(yīng)低等特點(diǎn)。2016年中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變檢測(cè)專家共識(shí)推薦所有的非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)［3］。該實(shí)驗(yàn)選取肺癌的惡性胸水細(xì)胞學(xué)蠟塊和對(duì)應(yīng)的組織學(xué)標(biāo)本為研究對(duì)象，探討細(xì)胞蠟塊在晚期肺癌惡性胸水患者中的診斷及分子檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值及臨床意義。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年9月-2019年9月九江市第一人民醫(yī)院收治的30例組織學(xué)確診并伴有惡性胸水的晚期肺癌患者，其中男19例，女11例，年齡35～83歲，中位年齡65歲，吸煙患者12例，不吸煙患者18例。

1.2 儀器及試劑

RM2235切片機(jī)及ASP300s組織脫水機(jī)為萊卡公司產(chǎn)品，熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，HZ18液基離心制片機(jī)、BX-IX生物組織包埋機(jī)為孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司產(chǎn)品；免疫組化試劑：CK7、TTF-1、p40、NapsinA、CD56、CgA、Syn、p63等抗體為中山金橋公司產(chǎn)品，DNA提取試劑盒為凱杰公司產(chǎn)品，人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒為武漢友芝友醫(yī)療公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞蠟塊及免疫組化

新鮮胸水室溫下靜置30min，棄上清液后，2000r／min離心10min；棄上清液，取細(xì)胞沉渣，加中性福爾馬林固定6h左右，用紗布包裹后放入包埋盒，脫水，制成細(xì)胞蠟塊。

胸水細(xì)胞蠟塊、組織活檢標(biāo)本按3μm厚度切片，經(jīng)驗(yàn)豐富技師采用Envision system二步法并按試劑說(shuō)明嚴(yán)格操作，高年資病理醫(yī)師按試劑說(shuō)明的陽(yáng)性定位進(jìn)行判讀。

1.4 DNA提取

胸水細(xì)胞蠟塊及對(duì)應(yīng)的組織活檢標(biāo)本常規(guī)10μm切片5張，60℃烤箱30min，常規(guī)脫蠟，經(jīng)病理評(píng)估后用蓋玻片刮取腫瘤組織密集區(qū)域轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，按照試劑盒說(shuō)明書提取DNA，并用分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度。

1.5 EGFR基因突變的檢測(cè)

用ARMS法檢測(cè)EGFR基因18-21號(hào)外顯子G719X、S768I、T790M、L858R、L861Q、Ins、Del的突變情況。按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作：計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需反應(yīng)數(shù)，將PCR反應(yīng)液移至PCR反應(yīng)管中，準(zhǔn)備樣本：DNA濃度稀釋至15ng／μL以下，加入1.8μL酶混合液，用8種PCR反應(yīng)液分別檢測(cè)每個(gè)樣本。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)對(duì)細(xì)胞蠟塊與組織活檢標(biāo)本EGFR突變率差異，p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞蠟塊切片

胸水細(xì)胞蠟塊經(jīng)HE切片后，相對(duì)與細(xì)胞學(xué)玻片腫瘤細(xì)胞更加集中，玻片更易觀察，異型腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，部分存在明顯的腺腔樣結(jié)構(gòu)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 腺癌胸水細(xì)胞蠟塊切片HE染色（×100）

2.2 免疫組織表達(dá)情況

胸水細(xì)胞蠟塊中有25例主要表達(dá)TTF-1（見(jiàn)圖2）、NapsinA和CK7腺癌標(biāo)記。3例主要表達(dá)p40和p63鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)記。2例表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌特異性標(biāo)記CD56、Syn、CgA小細(xì)胞癌標(biāo)記，同時(shí)TTF-1也有部分表達(dá)。與之對(duì)應(yīng)的組織學(xué)標(biāo)本比較顯示兩組表達(dá)情況較為一致。

圖2 腺癌細(xì)胞TTF-1標(biāo)記，細(xì)胞核陽(yáng)性呈棕黃色（×40倍）

2.3 EGFR基因突變檢測(cè)

25例腺癌胸水細(xì)胞學(xué)蠟塊中EGFR基因突變率為48%（12／25），包括7例19號(hào)外顯子缺失突變（見(jiàn)圖3）和5例21號(hào)外顯子點(diǎn)突變L858R（見(jiàn)圖4），未檢出18號(hào)外顯子G719X突變、20號(hào)外顯子T790M、S768I和Ins突變及21號(hào)外顯子L861Q突變。對(duì)應(yīng)的25例腺癌活檢組織學(xué)標(biāo)本突變率為52%（13／25），包括7例19號(hào)外顯子缺失突變和6例21號(hào)外顯子點(diǎn)突變L858R，未檢出18號(hào)外顯子G719X突變、20號(hào)外顯子T790M、S768I和Ins突變及21號(hào)外顯子L861Q突變，兩種肺腺癌標(biāo)本EGFR突變結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），詳見(jiàn)表1。余下3例鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞蠟塊和組織學(xué)標(biāo)本均未檢出突變。

圖3 細(xì)胞蠟塊19外顯子del突變圖

圖4 細(xì)胞蠟塊21外顯子L858R點(diǎn)突變

表1 腺癌胸水細(xì)胞蠟塊與組織活檢的EGFR突變結(jié)果比較

3 討論

胸腔積液是晚期肺癌患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，脫落細(xì)胞學(xué)涂片，是檢測(cè)胸水脫落細(xì)胞學(xué)的重要方法［4］。但常規(guī)的細(xì)胞學(xué)涂片收集的細(xì)胞少，易重疊，易掉片，不能長(zhǎng)期保存［5］。而細(xì)胞蠟塊技術(shù)的發(fā)展彌補(bǔ)了這些不足，其利用收集新鮮胸水后反復(fù)離心聚集、固定后用石蠟包埋，制作成細(xì)胞學(xué)蠟塊，不僅具備可反復(fù)切片，保存方便等特點(diǎn)，還可以作為免疫組化和后續(xù)的分子學(xué)診斷材料，大大的提升了診斷的靈敏度和準(zhǔn)確性［6］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究，以分子靶向?yàn)橹鲗?dǎo)的個(gè)體化治療具有特異性高，不良反應(yīng)低等特點(diǎn)，徹底改變了肺癌的治療策略，正成為目前研究的熱點(diǎn)［7］。針對(duì)腫瘤細(xì)胞中EGFR突變的特異性分子治療非小細(xì)胞肺癌的靶向藥物已被研究并廣泛應(yīng)用于臨床［8］。EGFR能通過(guò)調(diào)節(jié)酪氨酸激酶（TK）下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。2004年首次研究報(bào)道酪氨酸激酶-ASE抑制劑（TKIs）治療NSCLC的療效與EGFR基因18-21號(hào)外顯子的突變狀態(tài)密切相關(guān)［9］。此后多項(xiàng)研究表明，對(duì)于敏感性EGFR突變的肺腺癌患者，應(yīng)用TKIs治療在反應(yīng)率（ORR）、無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和生活質(zhì)量上均優(yōu)于傳統(tǒng)化療［10］。該研究制作脫落細(xì)胞蠟塊后免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果顯示腺癌作為惡性胸水最常見(jiàn)的腫瘤來(lái)源，占惡性胸腔積液的絕大部分，這和既往的研究結(jié)果類似，TTF-1和NapsinA被證實(shí)為標(biāo)記肺II型肺泡上皮最可靠的標(biāo)記，兩者聯(lián)合應(yīng)用被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移性肺腺癌的確診依據(jù)［11］。肺鱗癌為胸部常見(jiàn)的腫瘤，但一般為中央型且較少產(chǎn)生積液，聯(lián)合鱗狀上皮特有的標(biāo)記物P40和CK5／6可以確診。小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌目前也不少見(jiàn)，具有惡性程度高，侵襲能力強(qiáng)的特點(diǎn)，特異性表達(dá)CD56、Syn、CgA等神經(jīng)內(nèi)分泌抗體。該實(shí)驗(yàn)中，所有的病理診斷類型和細(xì)胞蠟塊表型與對(duì)應(yīng)的組織學(xué)診斷無(wú)差異。在EGFR基因檢測(cè)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，腺癌細(xì)胞蠟塊標(biāo)本和組織活檢標(biāo)本均檢出了19號(hào)外顯子缺失突變和21號(hào)外顯子L858R突變這兩種最常見(jiàn)的突變類型，這與既往的多量研究一致，相對(duì)于歐美人15%的突變率，亞裔肺腺癌的EGFR突變率較高，約40%的患者能檢測(cè)到EGFR基因突變，而其中L858R點(diǎn)突變更常見(jiàn)，而對(duì)于那些無(wú)吸煙史的肺腺癌亞洲女性患者，這項(xiàng)比例高達(dá)50～60%［12］。該研究中，細(xì)胞蠟塊標(biāo)本和組織活檢標(biāo)本突變率分別為48%和52%，后者較前者多檢出1例，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與脫落細(xì)胞學(xué)蠟塊腫瘤細(xì)胞含量較少無(wú)法提取足夠的DNA樣本有關(guān)，證實(shí)兩者都為合適的分子檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源。

綜上所述，對(duì)于無(wú)法進(jìn)行手術(shù)又難以獲得病理組織活檢標(biāo)本的臨床晚期肺癌患者，胸水細(xì)胞蠟塊可以替代組織活檢標(biāo)本，為患者的病理診斷及分子檢測(cè)提供依據(jù)。