發(fā)酵及貯藏條件對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響及其抗氧化性研究

李 安，劉小雨，張惟廣

（西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

藍莓（Semen trigonellae）果實近球形，具有很高的營養(yǎng)價值[1-2]，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）推薦的五大最健康果品之一[3]。以新鮮的藍莓果實為原料，經(jīng)過酒精發(fā)酵等制成的藍莓果酒，口感良好獨特，營養(yǎng)價值高。王姍姍等[4]通過對藍莓果酒進行功能性研究，發(fā)現(xiàn)藍莓果酒有降血脂、促進細胞增殖等功能。

花色苷是花青素以糖苷鍵的形式與糖結(jié)合而成的一種黃酮類水溶性天然色素，具有較強的抗氧化活性，如紅樹莓花色苷的抗氧化能力均優(yōu)于維生素C（vitamin C，VC）[5]，清除自由基能力分別是VC、維生素E（vitamin E，VE）的20和50倍[5]。藍莓果酒中花色苷是評價其質(zhì)量的重要指標。但花色苷的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其穩(wěn)定性較差，羥基數(shù)目的增加則會使其穩(wěn)定性降低[6-7]。除此之外，花色苷的穩(wěn)定性還受溫度、pH、光照、金屬離子、輔色劑、糖類、二氧化硫等因素的影響[8]。周寶利等[9]通過研究茄子果皮中的花色苷，發(fā)現(xiàn)Mg2+、蔗糖、檸檬酸和苯甲酸鈉都可以提高花色苷的穩(wěn)定性，而Cu2+、VC則會破壞花色苷的穩(wěn)定性。

本研究對不同發(fā)酵工藝釀造的藍莓果酒進行花色苷含量及酒精度進行測定，綜合比較選出最適的發(fā)酵工藝參數(shù)。以pH、溫度、光照、包裝材質(zhì)、糖濃度為考察因素，以藍莓果酒花色苷保存率為評價指標，研究藍莓果酒花色苷的穩(wěn)定性。對藍莓果酒的DPPH·、·OH、O2-·清除能力以及總抗氧化能力進行測定，分析藍莓果酒的抗氧化性。以期獲得花色苷含量高、抗氧化活性強的藍莓果酒，為藍莓果酒品質(zhì)的提升及生產(chǎn)優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓（藍美一號）：浙江藍美農(nóng)業(yè)有限公司；安琪SY釀酒酵母：安琪酵母有限公司；果膠酶（酶活＞500 000 U/g）、無水乙醇（色譜純）、水楊酸、檸檬酸（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；沒食子酸、VC、二苯代苦味?；杂苫ň鶠榉治黾儯好绹鳶igma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR-2003榨汁機：飛利浦中國投資有限公司；LHS-150SC恒溫恒濕箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PB-10酸度計：德國賽多利斯集團；UV1000紫外可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍莓果酒的釀造工藝流程及操作要點

操作要點：藍莓經(jīng)挑選、清洗、自然晾干后打漿，在果漿中添加0.02%果膠酶50 ℃酶解3 h，初始糖度22°Bx，加入偏重亞硫酸鉀使SO2含量為100mg/L，加入Ca2CO3調(diào)pH為3.5，添加0.4%安琪SY釀酒酵母，在22 ℃條件下于1 L發(fā)酵罐中發(fā)酵8 d。結(jié)束后，汁渣分離取上清液，密封后于陰涼干燥處陳釀數(shù)日，得藍莓果酒。

1.3.2 藍莓果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化

發(fā)酵時間分別為6 d、7 d、8 d、9 d、10 d，發(fā)酵溫度分別為16 ℃、19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃，SO2添加量分別為0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L，初始pH值分別為3.2、3.5、3.8、4.1、4.4，酵母添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，考察發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、SO2添加量、初始pH值、酵母添加量對藍莓果酒花色苷含量及酒精度影響。

1.3.3 分析檢測

（1）酒精度

按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法進行測定。

（2）藍莓果酒中花色苷含量的測定

采用pH示差法。移取1 mL的藍莓果酒樣液，用pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液將其稀釋25倍，平衡一段時間后在波長510 nm和700 nm條件下測其吸光度值，將測得值代入以下公式計算得藍莓果酒花色苷含量[10]。

式中：A510為樣品在波長510 nm處的吸光度值；A700為樣品在波長700 nm處的吸光度值；n為稀釋倍數(shù)；449.2為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質(zhì)量；26 900：矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)；Acy為花色苷含量，mg/100 mL。

以不同條件下花色苷保存率為依據(jù)，對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性進行分析。計算公式如下：

式中：Acy0為條件處理前藍莓果酒中花色苷含量，mg/100 mL；

Acy1為條件處理后藍莓果酒中花色苷含量，mg/100 mL。

1.3.4 藍莓果酒花色苷抗氧化性分析

（1）DPPH自由基清除

根據(jù)KILANI S等[11]的方法測定，取1 mL的藍莓果酒添加2 mL的DPPH（0.2 mmol/L）溶液，并于室溫下避光30 min，以乙醇為空白，波長517 nm條件下測定其吸光度值，與VC溶液（50 μg/mL）作對比。DPPH清除能力計算公式如下：

式中：R1為DPPH自由基清除率；A為1 mL樣品液加上2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值；B為1 mL樣品液加上2 mL乙醇的吸光度值；C為1 mL乙醇加上2 mL DPPH自由基溶液的吸光度值。

（2）羥基自由基的清除

取0.5mL的藍莓果酒然后依次添加2mLFeSO4（6 mmol/L），2mL水楊酸-乙醇溶液（6mmol/L），2mLH2O2溶液（6mmol/L），37 ℃水浴30 min，以蒸餾水為空白，在波長510 nm條件下測定其吸光度值[12]，最后與VC溶液（1 mg/100 mL）進行對比?！H清除率計算公式如下：

式中：R2為·OH清除率；AX為加入待測酒樣時的吸光度值；AX0為未加入H2O2溶液的反應(yīng)液吸光度值；A0為未加入藍莓果酒樣液的反應(yīng)液吸光度值。

（3）超氧陰離子自由基的清除

采用鄰苯三酚自氧化法[13]。將0.2 mL的藍莓果酒加入到Tris-HCl（0.05mol/L、pH8.2）中，空白組添加等體積蒸餾水，于25℃保溫10min，再加入0.2mL鄰苯三酚溶液（0.01mol/L），混勻后于波長320 nm處測定吸光度值，最后與VC溶液（1 mg/100 mL）進行對比。超氧陰離子自由基清除能力計算公式如下：

式中：R2為O2-·清除率；A為不加酒樣時的反應(yīng)速率；B為加入待測酒樣時的反應(yīng)速率。

（4）總抗氧化能力

參考李影[3]所使用的方法測定藍莓果酒的總抗氧化能力。取0.1 mL藍莓果酒樣液，依次添加2 mL磷酸緩沖液（pH 6.60，2 mol/L）、2 mL鐵氰化鉀溶液（1%），混勻后于50 ℃水浴20 min，再加入1 mL三氯乙酸溶液（10%），500 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加入1 mL三氯化鐵溶液（0.05%），用蒸餾水定容至10 mL，在波長700 nm處測定其吸光度值，與VC溶液（1 g/L）進行對比，吸光度值越大，表明其總抗氧化能力越強。

1.3.5 貯藏條件對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響

在pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，溫度分別為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，糖質(zhì)量濃度分別為0、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、12 mg/L、14 mg/L，分別在室內(nèi)自然光、室外自然光、室內(nèi)避光處放置，考察pH值、溫度、糖質(zhì)量濃度、光照等因素對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝參數(shù)對藍莓果酒花色苷的影響

2.1.1 發(fā)酵時間對藍莓果酒花色苷的影響

發(fā)酵時間對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，在發(fā)酵6～11 d時，隨著發(fā)酵時間增加，藍莓果酒中的花色苷含量緩慢地降低，這可能是因為在藍莓果酒發(fā)酵的過程中醪液中的酸、糖和由微生物代謝產(chǎn)生的酶會破壞花色苷。當(dāng)發(fā)酵時間＜8 d時，隨著發(fā)酵時間的增加，酒精度逐漸增加。這主要是因為當(dāng)發(fā)酵時間比較短時，醪液中的糖等一些能源物質(zhì)比較充足，可以提供足夠的能量供釀酒酵母進行酒精發(fā)酵，將糖轉(zhuǎn)化為乙醇，并且隨著發(fā)酵時間的增加，酵母菌會將糖轉(zhuǎn)化得更加徹底。但當(dāng)發(fā)酵時間＞8 d之后，醪液中剩下的少量能源物質(zhì)會被逐漸消耗完全，酒精不會再繼續(xù)產(chǎn)生，同時一些細菌還會消耗已產(chǎn)生的酒精。因此，綜合考慮確定藍莓果酒較優(yōu)的發(fā)酵時間為8 d。

圖1 發(fā)酵時間對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on anthocyanin content and alcohol content of blueberry wine

2.1.2 發(fā)酵溫度對藍莓果酒花色苷的影響

發(fā)酵溫度對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響結(jié)果見圖2。當(dāng)發(fā)酵溫度為16～22 ℃時，花色苷的含量隨發(fā)酵溫度的升高而增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為22 ℃時，花色苷含量可以達到最大，為46.24 mg/100 mL；當(dāng)發(fā)酵溫度為22～28 ℃時，花色苷含量隨發(fā)酵溫度的升高而幾乎不變，但總體上呈下降趨勢。這可能是因為溫度的升高會使酵母的生長繁殖及代謝活動加快，酵母自身的內(nèi)部活動越活躍就越有利于花色苷的浸出，同時酒精度的升高也有利于花色苷的浸出[14]，但是當(dāng)升高至一定的溫度時，果酒的酒精度會降低，因此花色苷的含量也會隨之下降，但下降的幅度較小。藍莓果酒的酒精度隨著發(fā)酵溫度的升高先升后降，這主要是因為發(fā)酵溫度過低時，釀酒酵母的生長繁殖及代謝活動受到阻礙，起酵時間增加且發(fā)酵速率降低，產(chǎn)酒精速度下降，當(dāng)發(fā)酵溫度過高時，酵母生長繁殖活動較快，糖類的消耗速度也隨之加快，而且酵母產(chǎn)生的過多的副產(chǎn)物會使酵母發(fā)酵活動受到阻礙，導(dǎo)致酵母出現(xiàn)過早疲勞的情況，因此，綜合考慮確定藍莓果酒的最適發(fā)酵溫度為22 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on anthocyanin content and alcohol content of blueberry wine

2.1.3 SO2添加量對藍莓果酒花色苷的影響

SO2添加量對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)SO2的添加量在0～150 mg/L時，花色苷含量隨著SO2添加量的增加而增加；當(dāng)SO2的添加量150 mg/L時，藍莓果酒的花色苷含量可以達到最大，為49.23 mg/100 mL；當(dāng)SO2添加量＞150 mg/L時，花色苷含量隨著二氧化硫添加量的增加而降低。這主要的原因可能是SO2的增加能抑制雜菌生長，促使酵母更好的進行酒精發(fā)酵，因而有利于花色苷的溶出，但是當(dāng)SO2添加量過高時，會在發(fā)酵醪液酸性的環(huán)境下生成HSO3-，該物質(zhì)能夠通過與花色苷分子中的C2或C4位進行親核作用從而形成花色苷亞硫酸鹽，而該物質(zhì)無色；其次SO2還可以起到漂白劑的作用，這也會使果酒中的花色苷含量降低[15]。藍莓果酒的酒精度隨SO2添加量增加先升后降。當(dāng)SO2添加量過低時，發(fā)酵醪液容易被其他雜菌所污染，糖類損失嚴重，釀酒酵母的發(fā)酵受到一定的阻礙，導(dǎo)致果酒的酒精度降低；當(dāng)SO2添加量過高時，發(fā)酵醪液中游離的SO2增加導(dǎo)致酸度增加，這對酵母的生長繁殖及代謝較為不利，故果酒的酒精度也會有所降低。因此，綜合考慮確定SO2最適添加量為100 mg/L。

圖3 SO2添加量對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響Fig.3 Effect of sulfur dioxide addition on anthocyanin content and alcohol content in blueberry wine

2.1.4 發(fā)酵液初始pH值對藍莓果酒花色苷的影響

初始pH值對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，花色苷含量隨發(fā)酵醪液初始pH的增加而降低，當(dāng)發(fā)酵醪液初始pH為3.2時，藍莓果酒的花色苷含量達到最高，為49.21 mg/100 mL，這可能是因為藍莓果酒花色苷在pH值為3左右的環(huán)境中穩(wěn)定性較好[16]，因此損失率較小。當(dāng)發(fā)酵醪液初始pH值為3.2時，酒精度為12.3%vol，花色苷含量為49.21 mg/100 mL；當(dāng)發(fā)酵醪液的pH值為3.5時，藍莓果酒的酒精度為12.73%vol，花色苷含量為47.01 mg/100 mL，比較發(fā)酵醪液pH值為3.2和3.5時的酒精度及花色苷含量，發(fā)現(xiàn)藍莓果酒的酒精度增加0.43%vol，花色苷含量下降了2.2 mg/100 mL。從酒精度再結(jié)合花色苷含量方面考慮，藍莓果酒的發(fā)酵醪液最適初始pH值應(yīng)為3.5。

圖4 初始pH對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響Fig.4 Effect of pH on anthocyanin content and alcohol content in blueberry wine

2.1.5 酵母添加量對藍莓果酒花色苷的影響

酵母添加量對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，酵母添加量對藍莓果酒花色苷含量的影響較小，藍莓果酒花色苷含量隨著酵母添加量的變化幾乎不會出現(xiàn)顯著的變化。酵母添加量在0.1%～0.5%時，藍莓果酒的酒精度隨其增加先升后降，當(dāng)酵母添加量為0.4%時，達到最高12.8%vol。因此，綜合考慮酵母最適添加量為0.4%。

圖5 酵母添加量對藍莓果酒花色苷含量及酒精度的影響Fig.5 Effect of yeast addition on anthocyanin content and alcohol content in blueberry wine

2.2 藍莓果酒花色苷抗氧化性分析

清除自由基或阻止自由基的產(chǎn)生是花色苷抗氧化的主要機制之一，且在一定的濃度范圍內(nèi)，藍莓花色苷的自由基清除率隨藍莓果酒濃度的增加而提高[17]。因此有必要提高藍莓果酒花色苷貯藏穩(wěn)定性，盡可能減少損失。

表1 藍莓果酒的抗氧化能力Table 1 Antioxidant capacity of blueberry wine

由表1所示，通過用半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值來表示藍莓果酒及VC的抗氧化能力，IC50的數(shù)值越小，表示抗氧化能力越強。由表可知，藍莓果酒和VC的DPPH·清除IC50值分別為16.19μg/mL和13.26μg/mL，這說明藍莓果酒的DPPH·清除能力低于VC?！H有很強的氧化性，是對機體危害最大的一類活潑的活性分子。O2-·不僅自身具有危害性，而且還可以通過化學(xué)反應(yīng)生成其他全部的氧自由基，進一步危害機體，因此它也是第一個生成的氧自由基[18]。藍莓果酒的·OH和O2-·清除能力均顯著地高于VC，表現(xiàn)出比較好的抗氧化活性。

由表1可知，藍莓果酒的吸光度值為1.85，1 g/L VC的吸光度值為0.62，吸光度值越大，表明其總抗氧化能力越強，所以藍莓果酒的總抗氧化能力大于VC的總抗氧化能力。這主要是因為在花色苷的結(jié)構(gòu)中含有多個屬于羥基供體的酚羥基，可使植物組織中容易被氧化的成分得到保護，即藍莓果酒中花色苷極易被氧化，因此發(fā)酵及貯藏過程中采取隔氧措施將有利于藍莓果酒花色苷的穩(wěn)定。

2.3 貯藏過程中影響藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的因素分析

2.3.1 溫度對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響

溫度對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知，藍莓果酒花色苷的保存率隨溫度在20～70 ℃范圍內(nèi)增加而不斷地降低，其中20 ℃與30 ℃的花色苷保存率差異較小，在此范圍內(nèi)溫度提升對花色苷浸提的促進作用成為主要影響因素，這主要是因為溫度的升高會使水分子的對流速度也隨之增加，因此水分子對花色苷分子破壞作用也就相應(yīng)的增強[19]，而且這個過程還遵循動力學(xué)方程，如花色苷在50 ℃、70 ℃、90 ℃條件下的降解速率常數(shù)分別為0.026 3 h-1、0.086 4 h-1，熱降解活化能為63.61 kJ/mol[20]；當(dāng)溫度升高時，花色苷還會向著無色的查爾酮及甲醇假堿的方向轉(zhuǎn)化[21]。因此，較低溫度有助于藍莓果酒中花色苷的穩(wěn)定，貯藏溫度在30 ℃以下為宜。

圖6 溫度對藍莓果酒花色苷保存率的影響Fig.6 Effect of temperature on anthocyanin retention rate of blueberry wine

2.3.2 pH值對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響

圖7 pH值對藍莓果酒花色苷保存率的影響Fig.7 Effect of pH on anthocyanin retention rate of blueberry wine

pH值對藍莓果酒花色苷保存率的影響結(jié)果見圖7。由圖7可知，藍莓果酒花色苷的保存率隨pH值在2～6范圍內(nèi)的增加呈降低趨勢，但在pH值為3時，藍莓果酒花色苷的保存率略高于pH值為2時，所以藍莓果酒花色苷在pH為3的環(huán)境下比較穩(wěn)定。pH值對花色苷的結(jié)構(gòu)有一定影響，在pH＜2時，花色苷多以紅色的黃烊陽離子形式存在；在pH值為3～6時，由于受到水的親核攻擊，黃烊陽離子被水合，花色苷濃度也就隨之下降，此時花色苷主要是以無色的甲醇假堿和查爾酮假堿的形式存在。LUNA-VITAL D等[22]通過運用第一反應(yīng)動力學(xué)研究玉米中花色苷的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)玉米花色苷的半衰期預(yù)測值隨著pH的增加而顯著的下降，當(dāng)pH＞5時，因為色度不成線性的原因?qū)е聼o法計算玉米花色苷的半衰期[23-26]。因此綜合上述分析，藍莓果酒貯藏pH為3較為適宜。

2.3.3 光照對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響

光照對藍莓果酒花色苷的影響結(jié)果見圖8。由圖8可知，藍莓果酒花色苷的保存率在室內(nèi)避光的條件下最高，室內(nèi)自然光次之，室外自然光最低。藍莓果酒花色苷的保存率隨光照強度及時間的增加而降低，這可能是因為光照會使花色苷分子的酰基脫落，而花色苷分子上的?；梢栽黾悠浞€(wěn)定性，因此花色苷的穩(wěn)定會隨光照的增加而降低[19]。這也與李暢穎等[27]研究一致。即藍莓果酒的花色苷在避光的條件下更穩(wěn)定，因此，藍莓果酒應(yīng)避光保存。

圖8 光照對藍莓果酒花色苷保存率的影響Fig.8 Effects of illumination on anthocyanin retention rate of blueberry wine

2.3.4 蔗糖添加量對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響

圖9 蔗糖添加量對藍莓果酒花色苷保存率的影響Fig.9 Effect of sucrose addition on anthocyanin retention rate of blueberry wine

蔗糖的添加量對藍莓果酒的花色苷保存率的影響結(jié)果見圖9。由圖9可知，當(dāng)蔗糖的添加量為6 mg/L、10 mg/L時，與不添加蔗糖相比，藍莓果酒的花色苷保存率會有所增加；當(dāng)蔗糖的添加量為8 mg/L時，與不添加蔗糖的對照相比，藍莓果酒的保存率有所降低。因此，當(dāng)藍莓果酒中的蔗糖添加量為10 mg/L時，在此條件下，藍莓果酒的花色苷穩(wěn)定性最高。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，最佳藍莓果酒發(fā)酵工藝為發(fā)酵時間8 d、發(fā)酵溫度22 ℃、SO2添加量100 mg/L、pH 3.5、酵母添加量0.4%。在此優(yōu)化條件下，花色苷含量為46.47 mg/100 mL，酒精度為12.76%vol。

以藍莓果酒為研究對象，以藍莓果酒花色苷的保存率為依據(jù)，研究pH、溫度、光照及糖濃度對藍莓果酒花色苷穩(wěn)定性的影響。藍莓果酒花色苷分別在pH為3、30 ℃以下、避光、隔氧、糖濃度為10 mg/L的條件下比較穩(wěn)定。藍莓果酒的DPPH·清除能力弱于VC，但·OH和O2-·清除能力顯著地高于VC，IC50值分別為16.19μg/mL、43.61μg/mL、61.84μg/mL，總抗氧化能力強于VC，具有較強的抗氧化活性。