微生物制劑發(fā)酵法脫除魚鱗膠原蛋白肽腥味工藝研究

沈瑞敏，羅 璇，李 航，王恩利

（武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205）

近年來，魚鱗膠原蛋白肽廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)[1-3]，但是魚鱗膠原蛋白肽的魚腥味嚴重影響了其在食品和化妝品中的應(yīng)用。據(jù)報道，該腥味物質(zhì)成分主要為氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）[4-6]，去腥主要手段有去除或掩蓋氧化三甲胺。目前水產(chǎn)品的生產(chǎn)中常用的去腥方法主要為基于吸附或包埋等機理的有活性炭吸附法、大孔樹脂吸附法、β-環(huán)糊精包埋法、抗氧化劑去腥法等方法[7-11]。而微生物發(fā)酵去腥是通過微生物的新陳代謝作用使小分子的腥味物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無腥味的大分子物質(zhì)，或者在微生物酶的作用下發(fā)生分子結(jié)構(gòu)的修飾轉(zhuǎn)化為無腥味物質(zhì)[12]。姚艷艷等[13-14]分別用植物乳桿菌對海帶和草魚進行了去腥研究；馬麗杰等[15-17]分別用酵母對魚下腳料、鯉魚和草魚進行了去腥研究，去腥效果優(yōu)于傳統(tǒng)方法。本試驗采用微生物制劑對魚鱗膠原蛋白肽進行去腥，旨在提高去腥效果的同時減少蛋白損失率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱魚魚鱗：武漢梁子湖水產(chǎn)品加工有限公司；甜酒曲、釀酒酵母（食品級）：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌（食品級）：北京川秀科技有限公司；氧化三甲胺標準品（＞99%）：東京化成工業(yè)株式會社；堿性蛋白酶（純度酶活20萬U/g）：丹麥諾維信公司；雷士鹽（分析純）：天津市光復(fù)精細化工研究所；硼酸、氫氧化鈉、濃硫酸、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸鉀、硫酸銅、無水乙醚、無水乙醇、丙酮、濃鹽酸（均為分析純）：天津凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）有限公司；FA2004B型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；JJ-1型數(shù)顯精密電動攪拌器：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；TS型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海世平試驗設(shè)備有限公司；KDN型消化爐：上海精隆科技有限公司；K9840型自動定氮儀：山東海能科學(xué)儀器有限公司；FE20K型精密酸度計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

魚鱗脫水→粉碎→預(yù)處理→酶解→滅酶→離心→魚鱗酶解液→去腥→過濾→檢測

（1）預(yù)處理：對魚鱗進行脫脂、脫鈣處理，脫脂條件為44 ℃、0.8 mol/L NaHCO3溶液、固液比1∶25（g∶mL）、浸泡8 h。脫鈣條件為34℃、1.0mol/L醋酸、固液比1∶20（g∶mL）、浸泡8 h。

（2）酶解：用堿性蛋白酶酶解魚鱗制備膠原蛋白肽，酶解條件為55 ℃、pH為7、底物濃度為1.2 g/100 mL、加酶量為0.012 g/100 mL、酶解5 h。

（3）去腥：采用微生物液態(tài)發(fā)酵法去腥，考察適宜的微生物去腥劑和去腥條件。

（4）檢測：通過檢測去腥前后氧化三甲胺含量以及蛋白質(zhì)含量，計算氧化三甲胺去除率和蛋白質(zhì)損失率兩個指標來衡量去腥效果。

1.3.2 去腥微生物的選擇

取50 mL酶解液3份，分別添加0.01%的甜酒曲、乳酸菌和釀酒酵母。在28 ℃、初始pH值為4.0條件下水浴振蕩2 h，過濾。比較氧化三甲胺去除率及蛋白損失率以確定去腥微生物制劑的選擇。

1.3.3 去腥條件優(yōu)化

利用1.3.2中去腥效果最好的微生物對酶解液進行去腥，分別取50 mL酶解液于水浴振蕩器中進行微生物接種量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）、去腥時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min）、去腥初始pH（3.5、3.8、4.0、4.3、4.7、5.0）和去腥溫度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃、42 ℃）的單因素試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用4因素3水平L9（34）雙指標正交試驗優(yōu)化去腥工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 魚鱗膠原蛋白肽腥味脫除工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for deodorization process optimization of fish scale collagen peptide

1.3.4 測定方法

取5 mL過濾后的樣品，檢測蛋白質(zhì)含量，取10 mL過濾后的樣品檢測氧化三甲胺含量，分別計算蛋白損失率和氧化三甲胺去除率。氧化三甲胺的檢測參考黃國霞等[19-20]的雷士鹽分光光度法進行測定；蛋白質(zhì)含量的檢測采用凱氏定氮法。

氧化三甲胺去除率的計算公式如下：

式中：Y1為氧化三甲胺去除率；X為去腥后酶解液中氧化三甲胺的含量，mg/mL；X1為原始酶解液中氧化三甲胺的含量，mg/mL。

蛋白質(zhì)損失率的計算公式如下：

式中：Y3為蛋白質(zhì)損失率；z為酶解液中總氮含量，g/100 g；z1為去腥后酶解液中總氮含量，g/100 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 去腥微生物的確定

圖1 不同微生物的去腥效果比較Fig.1 Comparison of deodorization effect of different microorganisms

由圖1可知，甜酒曲、乳酸菌和釀酒酵母三種微生物對氧化三甲胺去除率差別不大，分別為47.24%、48.33%和42.22%；但是對魚鱗膠原蛋白肽的蛋白損失率影響較大，其中甜酒曲去腥時的蛋白損失率遠遠小于其他兩種微生物，只有（21.43±1.86）%。原因可能是這3種微生物都能利用氧化三甲胺或代謝出酒精、醋酸、乳酸等去腥物質(zhì)，但是由于甜酒曲的粒徑較乳酸菌和釀酒酵母大，比表面積小，同時產(chǎn)生的吸附作用較小，進而使得蛋白損失率相對較小。綜合考慮氧化三甲胺的去除率和蛋白損失率，選擇甜酒曲作為魚鱗膠原蛋白肽的去腥微生物較好。

2.2 甜酒曲對魚鱗酶解液去腥工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 甜酒曲接種量對去腥效果的影響

圖2 甜酒曲接種量對去腥效果的影響Fig.2 Effect of sweet Jiuqu inoculum on deodorization

由圖2可知，隨著甜酒曲接種量的增加，氧化三甲胺的去除率也不斷增加。甜酒曲接種量為0.08%時，氧化三甲胺去除率較高為（89.93±0.34）%，蛋白損失率相對較小為（19.43±1.9）%。當添加量＞0.08%時，氧化三甲胺去除率增加緩慢；同時，蛋白損失率也逐漸增大。原因可能是甜酒曲代謝協(xié)同吸附作用，接種量越大，利用的氧化三甲胺越多，使得三甲胺去除率越大；同時，吸附面積也越大，吸附能力也越強，導(dǎo)致蛋白損失率越大[21]?？紤]去腥效果兼顧蛋白損失率，選擇合適的甜酒曲接種量為0.08%。

2.2.2 去腥時間對去腥效果的的影響

圖3 去腥時間對去腥效果的影響Fig.3 Effect of deodorization time on deodorization

由圖3可知，隨著甜酒曲去腥時間的增加，氧化三甲胺的去除率先快速增加，到脫腥時間達到30 min后時，變化不大；同時，蛋白損失率也逐漸增大。原因可能是，魚鱗膠原蛋白肽酶解液中的氧化三甲胺（1.39 mg/mL）比蛋白質(zhì)（2.05 g/100 g）少的多，此時液態(tài)發(fā)酵的速度遠大于吸附速率，故氧化三甲胺的去除率很快趨于穩(wěn)定，而蛋白損失率卻還在繼續(xù)增加?？紤]去腥效果兼顧蛋白損失率，選擇合適的甜酒曲去腥時間為30 min。

2.2.3 去腥初始pH對去腥效果的影響

圖4 去腥初始pH值對去腥效果的影響Fig.4 Effect of deodorization initial pH on deodorization

實驗用甜酒曲主要菌種為根霉菌，其適宜的pH范圍為3.5～5.0。由圖4可知，在試驗范圍內(nèi)，隨著去腥初始pH的增加，氧化三甲胺去除率先減小后増大，但總體變化不大，均＞86%；而蛋白損失率卻一直有所增加，當pH值增加至4.7后，蛋白損失率急劇增加到（25.56±2.1）%。原因可能是，試驗pH值均在甜酒曲的最適pH范圍內(nèi)，所以氧化三甲胺去除率影響不大；而由于魚膠原蛋白的等電點為4.7～5.0，故當pH到達4.7后，部分蛋白質(zhì)變性，會造成蛋白質(zhì)損失率迅速增加。因此，選擇適宜的去腥初始pH為3.5。

2.2.4 去腥溫度對去腥效果的影響

圖5 去腥溫度對去腥效果影響Fig.5 Effect of deodorization temperature on deodorization

由圖5可知，隨著去腥溫度的升高，氧化三甲胺去除率先增大后減小，當溫度為32 ℃時，氧化三甲胺去除率達到最大，高達（93.1±0.54）%；同時，蛋白損失率一直隨溫度增加而增加。原因可能是，32 ℃時甜酒曲中微生物的代謝能力最強；而根據(jù)吸附動力學(xué)原理，溫度不太高時，隨著溫度的增加，吸附能力增強。綜合考慮氧化三甲胺去除率和蛋白損失率選擇適宜的去腥溫度為32 ℃。

2.2.5 甜酒曲發(fā)酵去腥雙指標正交試驗結(jié)果

表2 魚鱗膠原蛋白肽腥味脫除工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for deodorization process optimization of fish scale collagen peptide

續(xù)表

通過表2知，以氧化三甲胺為評價指標分析，影響甜酒曲發(fā)酵去腥效果的主次因素為甜酒曲接種量（A）＞去腥初始pH（C）＞去腥溫度（D）＞去腥時間（B），發(fā)酵去腥的最佳工藝條件組合為A1B3C3D1，即甜酒曲接種量為0.06%、去腥時間為40min、去腥初始pH為4.0、去腥溫度為28℃。以蛋白質(zhì)損失率為評價指標分析，影響甜酒曲發(fā)酵脫腥效果的主次因素為去腥時間（B）＞甜酒曲接種量（A）=去腥初始pH（C）＞去腥溫度（D），發(fā)酵去腥的最佳工藝條件組合為A2B3C3D1。即甜酒曲接種量為0.08%、去腥時間為40 min、去腥初始pH為4.0、去腥溫度為28 ℃。

根據(jù)綜合平衡原則：若某指標為主要影響因素，取其作為主因素時的優(yōu)水平，應(yīng)優(yōu)先滿足相對重要的指標的因素優(yōu)水平的選取，對于影響不顯著的因素，其水平的選取則應(yīng)考慮成本。本試驗重點考察三甲胺去除率，故甜酒曲發(fā)酵去腥最佳工藝條件組合為A1B3C3D1，即甜酒曲接種量為0.06%，去腥時間40 min，去腥初始pH為4.0，去腥溫度為28 ℃。

由驗證試驗可知，甜酒曲發(fā)酵法處理魚鱗膠原蛋白去腥工藝條件A1B3C3D1下氧化三甲胺去除率為（95.85±0.26）%，高于正交試驗中的任何一組，蛋白損失率為（5.95±2.86）%，僅低于6號試驗，但6號試驗的三甲胺去除率太低只有（87.61±0.35）%，故該去腥工藝的最優(yōu)條件為A1B3C3D1。

3 結(jié)論

本研究對比分析了幾種微生物對魚鱗膠原蛋白肽脫腥的效果，優(yōu)選出最佳去腥微生物制劑為甜酒曲；進而通過單因素試驗和雙指標正交試驗優(yōu)化出甜酒曲發(fā)酵去腥的最佳工藝條件：甜酒曲接種量為0.06%、去腥時間40 min、去腥初始pH為4.0、去腥溫度為28 ℃。在此優(yōu)化條件下，氧化三甲胺去除率可達（95.85±0.26）%，蛋白質(zhì)損失率為（5.95±2.86）%。優(yōu)于傳統(tǒng)的活性炭吸附法對魚鱗膠原蛋白肽的去腥結(jié)果，氧化三甲胺去除率（89.81±0.40）%，蛋白損失率（11.77±1.44）%。實現(xiàn)了本次研究的目的，在腥味物質(zhì)去除率最高的主要條件下，盡可能減少蛋白質(zhì)損失率。