響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的發(fā)酵工藝

成 堃，袁雪嬌，高 星，蔡曉明，井海榮

（齊魯理工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200）

金銀花（Lonicera japonica）又名忍冬，是清熱解毒、疏散風(fēng)熱的良藥，具有抑菌、保肝、抗氧化等藥理活性[1-3]。2002年，原衛(wèi)生部印發(fā)了《既是食品又是藥品的物品名單》，明確了金銀花屬于藥食兩用物質(zhì)。以金銀花為原料研發(fā)的保健飲品兼具消暑解渴和保健的功效，如金銀花菊花甘草復(fù)合保健涼茶[4]、魚腥草金銀花涼茶[5]、決明子枸杞金銀花復(fù)合飲料[6]等。

枸杞是傳統(tǒng)的名貴中藥材，藥食兩用，具有多種藥用與營養(yǎng)價(jià)值[7]，在飲料、保健飲品、食品中有重要的用途。目前以枸杞為原料開發(fā)的產(chǎn)品有枸杞山藥百合復(fù)合飲料[8]、枸杞覆盆子果醋[9]、枸杞桂圓復(fù)合飲料[10]、枸杞菠蘿復(fù)合果酒[11]、靈芝枇杷花復(fù)方口服液[12]、桃膠枸杞新型營養(yǎng)果凍[13]等。

風(fēng)味酸奶營養(yǎng)豐富，口味多樣，尤其受到兒童、學(xué)生、都市白領(lǐng)等年輕消費(fèi)人群的喜愛。已經(jīng)報(bào)道的風(fēng)味酸奶中，根據(jù)原料的不同，主要有水果酸奶、谷物酸奶、蔬菜酸奶等。中藥是我國古代科學(xué)的瑰寶，以藥食兩用中藥為原料開發(fā)的酸奶日益增多。如方芳等[14]用蘆根、蓮子心、百合、雞內(nèi)金、天冬研制出一種功能性酸奶，極大的提高了酸奶的品質(zhì)；趙翾等[15]開發(fā)出一款火麻仁中藥型酸奶，具有通便潤腸、維持腸道菌群平衡、預(yù)防便秘的功能；張建萍等[16]研制的白果山楂酸奶營養(yǎng)豐富，具有開胃消食等功效。

本研究以金銀花、枸杞為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的發(fā)酵工藝條件，不僅增加了風(fēng)味酸奶的品種，也為金銀花的開發(fā)利用提供了一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉、枸杞、白砂糖：市售；金銀花：購于中藥店；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：齊魯理工學(xué)院化學(xué)與生物工程實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

美的WBL2521H榨汁機(jī)：廣東美的生活電器制造有限公司；HHW.21電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫(yī)療儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；GNP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花枸杞風(fēng)味酸奶發(fā)酵工藝

全脂奶（10%）→配料（金銀花汁，枸杞汁，白砂糖）→預(yù)熱，均質(zhì)→殺菌（90 ℃，10 min）→冷卻（室溫）→接種→發(fā)酵（42 ℃，5 h）→冷藏后熟（4 ℃，12 h）→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1）金銀花汁、枸杞汁的制備

稱取5 g金銀花，加入100 mL蒸餾水，電磁爐上煎煮30 min；冷卻后紗布過濾，用少量水多次洗藥渣后收集濾液，定容至100 mL。

稱取10 g枸杞，用100 mL自來水浸泡過夜，榨汁機(jī)打漿，紗布過濾得濾液。

（2）母發(fā)酵劑的制備[17]

用接種針挑取保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的適量菌體，分別接入MRS液體培養(yǎng)基試管中，37 ℃培養(yǎng)2 d，調(diào)整培養(yǎng)液的菌濃至1×106個(gè)/mL。將全脂奶（10%）分裝試管、三角瓶，115 ℃保溫30 min。向試管中接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的菌懸液各1 mL，42 ℃培養(yǎng)至全脂奶出現(xiàn)凝乳；然后按照10%的接種量向三角瓶中接入上述培養(yǎng)物，42 ℃培養(yǎng)至全脂奶酸度為70～75°T，作為母發(fā)酵劑[17]。

1.3.3 金銀花枸杞風(fēng)味酸奶發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)

選取金銀花汁添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、枸杞汁添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、白砂糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、發(fā)酵溫度（38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（3 h、5 h、7 h、9 h、11 h）、發(fā)酵劑接種量（5%、10%、15%、20%、25%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。以感官評分、酸度為評價(jià)指標(biāo)，確定各因素對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵劑接種量（C）為自變量，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件，進(jìn)行發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 金銀花枸杞風(fēng)味酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of honeysucklewolfberry flavor yoghurt

1.3.5 質(zhì)量指標(biāo)

（1）金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的感官質(zhì)量品評

金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的感官質(zhì)量品評評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。評價(jià)指標(biāo)包括色澤、組織狀態(tài)、口感、氣味四項(xiàng)。感官品評小組由10人組成，根據(jù)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對風(fēng)味酸奶打分，平均值作為風(fēng)味酸奶的得分。

表2 金銀花枸杞風(fēng)味酸奶感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt

（2）各指標(biāo)的檢測

脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、酸度、乳酸菌數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母、霉菌等指標(biāo)均按照國標(biāo)GB 19302—2010《發(fā)酵乳》進(jìn)行檢測[18]。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，利用Design-Expert version 8.0.6設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 金銀花汁添加量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響

圖1 金銀花汁添加量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of honeysuckle juice addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同金銀花汁添加量發(fā)酵的酸奶感官評分和酸度見圖1。由圖1可知，添加有金銀花汁的酸奶均黏稠，同時(shí)有少量乳清析出。當(dāng)金銀花汁添加量為5%、10%時(shí)，酸奶呈乳白色，口感酸，有淡淡的中藥味，金銀花汁添加量10%的酸奶比5%的略苦；當(dāng)金銀花汁添加量超過15%時(shí)，酸奶顏色由淡黃色逐漸變?yōu)辄S色，中藥味依次變濃，其中25%的酸奶中藥味最濃，口感最苦?？傮w上看，添加金銀花汁后，酸奶的酸度變化較小，且只有添加5%金銀花汁發(fā)酵出的酸奶有淡淡的酸奶香，口感最好。因此，金銀花汁的最適添加量為5%。

2.1.2 枸杞汁添加量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響

圖2 枸杞汁添加量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響Fig.2 Effect of wolfberry juice addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同枸杞汁添加量發(fā)酵的酸奶感官評分和酸度見圖2。由圖2可知，當(dāng)枸杞汁添加量為2%時(shí)，酸奶顏色呈乳白色，隨著枸杞汁添加量的增加，酸奶顏色逐漸變紅，當(dāng)枸杞汁添加量為10%時(shí)，酸奶顏色為淡紅色。添加了枸杞汁的酸奶均黏稠、細(xì)膩均勻無乳清析出；從風(fēng)味上看，當(dāng)枸杞汁添加量為6%時(shí)，酸奶香氣最協(xié)調(diào)、濃郁；隨著枸杞汁添加量的提高，口感依次變酸，添加10%時(shí)口感最酸，不協(xié)調(diào)。綜合色澤、組織狀態(tài)、口感、氣味等特征，枸杞汁的最適添加量為6%。

2.1.3 白砂糖添加量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響

圖3 白砂糖添加量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響Fig.3 Effect of sugar addition on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同白砂糖添加量發(fā)酵的酸奶感官評分和酸度見圖3。由圖3可知，白砂糖一方面作為碳源為微生物生長代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)也作為甜味劑調(diào)節(jié)酸奶的口感，使發(fā)酵出的酸奶酸甜可口。從試驗(yàn)結(jié)果看，添加了白砂糖發(fā)酵出的酸奶細(xì)膩且質(zhì)地均勻黏稠，酸度變化很??；就口感而言，白砂糖添加量為2%時(shí)，酸奶酸味重；當(dāng)白砂糖添加量為4%、6%時(shí)，口味比2%的略好，但是味道寡淡；當(dāng)白砂糖添加量為8%時(shí)，酸甜可口；白砂糖添加量為10%時(shí)，酸奶甜味重。因此，白砂糖的最適添加量為8%。這與楊國浩等[19-20]的報(bào)道結(jié)果相同。

2.1.4 發(fā)酵溫度對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響

圖4 發(fā)酵溫度對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同發(fā)酵溫度發(fā)酵的酸奶感官評分和酸度見圖4。由圖4可知，發(fā)酵溫度為38 ℃、40 ℃時(shí)，發(fā)酵溫度略低，酸奶口味偏甜，呈奶液狀，不夠黏稠；當(dāng)發(fā)酵溫度為42 ℃時(shí)，酸奶細(xì)膩黏稠，酸甜適中，發(fā)酵奶香中帶有淡淡的中藥香，感官評分最高；發(fā)酵溫度為44 ℃時(shí)，酸奶有少量的結(jié)塊，酸甜不適口；發(fā)酵溫度為46 ℃時(shí)，酸奶質(zhì)地不均勻，有大量乳清析出，酸味較重。綜合感官評分和酸度，確定最適發(fā)酵溫度為42 ℃。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵的酸奶感官評分和酸度見圖5。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為3 h時(shí)，發(fā)酵時(shí)間過短，酸奶呈奶液狀，無發(fā)酵乳香，口感甜；發(fā)酵時(shí)間為5 h時(shí)，酸奶質(zhì)地均勻，細(xì)膩黏稠，感官評分最高；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酸奶的酸度升高，口感逐漸變酸；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過9 h時(shí)，酸奶酸味重，有大量乳清析出。因此，最適發(fā)酵時(shí)間為5 h。

2.1.6 發(fā)酵劑接種量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響

圖6 發(fā)酵劑接種量對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶質(zhì)量的影響Fig.6 Effect of starter inoculum on honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt quality

不同發(fā)酵劑接種量發(fā)酵的酸奶感官評分和酸度見圖6。發(fā)酵劑接種量為5%、10%、15%時(shí)，酸奶均細(xì)膩均勻無雜質(zhì)，發(fā)酵劑接種量為5%時(shí)，酸奶口味淡?。唤臃N量為10%時(shí)，口感略甜；接種量為15%時(shí)，酸甜可口，口味協(xié)調(diào)，接種量超過20%時(shí)，有大量豆腐腦狀蛋白沉淀，口感粗糙有雜質(zhì)；因此，發(fā)酵劑最適接種量為15%。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6軟件，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵劑接種量（C）為自變量，設(shè)計(jì)了3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)組，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果見表4。

表3 金銀花枸杞風(fēng)味酸奶發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of yoghurt

2.2.2 模型的建立及方差分析

用Design-Expert 8.0.6軟件將模型進(jìn)行分析，得到金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的感官評分以及所選3個(gè)因素編碼值的回歸方程為：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4知，失擬項(xiàng)P=0.839 5，說明相對于純誤差失擬不顯著（P＞0.05）。模型P＜0.000 1說明模型極顯著。獲得模型決定系數(shù)R2=0.998 1，說明該模型99.81%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋。模型的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）相對較低（0.60%），說明該實(shí)驗(yàn)值有很高的精密度及可靠性。綜上所述，該模型擬合度符合數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的工藝可以用此方程預(yù)測。根據(jù)F值的大小，得出金銀花枸杞風(fēng)味酸奶感官評分受各因素的影響次序?yàn)椋喊l(fā)酵劑接種量（C）＞發(fā)酵溫度（A）＞發(fā)酵時(shí)間（B）。除了二次項(xiàng)C2對感官評分無顯著影響外，其他項(xiàng)A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的感官評分影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.3 響應(yīng)面分析與最優(yōu)工藝驗(yàn)證

利用Design-Expert 8.0.6軟件，作出以感官評分為響應(yīng)值的各因素的響應(yīng)曲面圖和等高線圖，并分析各因素的交互作用，結(jié)果見圖7。由圖7可知，發(fā)酵溫度（A）與發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（A）與母發(fā)酵劑接種量（C）、發(fā)酵時(shí)間（B）與母發(fā)酵劑接種量（C）的橢圓度都很大，說明AB、AC、BC的交互影響都極顯著（P＜0.01）；綜合分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度（A）與發(fā)酵時(shí)間（B）的交互影響最顯著。

圖7 發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與母發(fā)酵劑接種量交互作用對金銀花枸杞風(fēng)味酸奶感官評分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation temperature,time and starter inoculum on sensory score of honeysuckle-wolfberry flavor yoghurt

由軟件分析得金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間5.08 h，發(fā)酵溫度42.72 ℃，母發(fā)酵劑接種量10%；在該最優(yōu)條件下，酸奶的感官評分預(yù)測值為91.31分?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)，將最優(yōu)發(fā)酵工藝條件參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間5.1 h、發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵劑接種量10%。按優(yōu)化的發(fā)酵條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，得到酸奶的感官評分實(shí)際值為91分，說明最優(yōu)發(fā)酵工藝條件可靠。

2.3 產(chǎn)品指標(biāo)

發(fā)酵出的金銀花枸杞風(fēng)味酸奶呈淡橙色，凝乳均勻，細(xì)膩無雜質(zhì)；酸甜可口；酸奶有金銀花特有的藥香。蛋白質(zhì)含量為2.3 g/100 g，脂肪含量為2.6 g/100 g，酸度為76°T。

金銀花枸杞風(fēng)味酸奶中乳酸菌數(shù)為1.1×106CFU/mL，未檢出大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，霉菌數(shù)＜1 CFU/mL，酵母數(shù)＜1 CFU/mL。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化了金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的配方，響應(yīng)面法優(yōu)化了金銀花枸杞風(fēng)味酸奶的發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明，金銀花汁添加量為5%，枸杞汁添加量為6%，白砂糖添加量為8%，發(fā)酵溫度為43 ℃，發(fā)酵時(shí)間為5.1 h，母發(fā)酵劑接種量為10%。在此工藝條件下，發(fā)酵出的金銀花枸杞風(fēng)味酸奶感官評分為91分，酸度為76°T。金銀花枸杞風(fēng)味酸奶色澤均勻，酸甜適口，質(zhì)地細(xì)膩，有金銀花特有的藥香，感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。