線粒體鈣離子攝入蛋白1在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

何元方陳艷琴楊濤張召輝劉曉斌，4

作者單位：716000延安 1延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院；710038西安 2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院疼痛科；221004徐州 3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院普通外科；716000延安 4延安大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

腎透明細(xì)胞癌（renal clear cell carcinoma，RCCC）是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的85%～90%［1］。目前RCCC尚缺乏有效的早期篩查手段，約30%的患者在診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移［2］。由于晚期患者的手術(shù)治療效果不佳，轉(zhuǎn)移性RCCC患者的5年生存率＜10%［3］。因此，迫切需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)針對(duì)RCCC的新型分子診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)是細(xì)胞代謝和功能的關(guān)鍵控制者。研究表明線粒體Ca2+信號(hào)的異常可促進(jìn)多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。目前有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體鈣離子攝入蛋白1（mitochondrial calcium uptake 1，MICU1）在卵巢癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中異常表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)［5-8］，但其是否可作為RCCC預(yù)后標(biāo)志物仍需進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)分析MICU1在RCCC組織中的表達(dá)及其與總生存期的關(guān)系，旨在闡明MICU1在RCCC中的作用。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2016年1月—2018年12月于延安大學(xué)附屬醫(yī)院行根治性腎切除術(shù)的RCCC患者的石蠟包埋切片30例，同時(shí)選取距離腫瘤邊緣5 cm以上且經(jīng)病理檢查無(wú)癌細(xì)胞的癌旁組織為對(duì)照。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)病理證實(shí)為RCCC；⑵術(shù)前未接受化療或放療。排除在研究期間接受藥物治療以及合并其他惡性腫瘤或其他重大疾病者。本研究經(jīng)延安大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

RCCC細(xì)胞株CAKI-1購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；MICU1真核表達(dá)質(zhì)粒和干涉片段由空軍軍醫(yī)大學(xué)生理與病理學(xué)教研室提供；胎牛血清購(gòu)自BBI Life Sciences公司；青鏈霉素混合液購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司；RPMI 1640培養(yǎng)基及DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)瑞博公司；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTS細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；β-actin抗體購(gòu)自北京天德悅公司；MICU1抗體，羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司；EdU試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MICU1在RCCC組織的表達(dá)

將RCCC病理切片置于烤箱中，68℃處理20 min，常規(guī)脫蠟，采用檸檬酸高壓修復(fù)抗原，PBS沖洗，山羊血清37℃封閉20 min，滴加MICU1（1∶1 000稀釋?zhuān)┮豢狗跤?.5 h，PBS沖洗3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片顯微鏡下閱片。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)算染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞所占比例＜10%計(jì)0分，11%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度：陰性染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分，褐色計(jì)4分。結(jié)果 由2位病理技術(shù)人員在每張切片中隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（×200）進(jìn)行分析。

1.4 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MICU1 mRNA在RCCC中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

利用TCGA（https：//cancergenome.nih.gov/）搜索并下載RCCC表達(dá)譜數(shù)據(jù)，排除缺失臨床參數(shù)和生存資料患者，最終獲得517例RCCC組織的RNAseq數(shù)據(jù)及對(duì)應(yīng)的患者臨床數(shù)據(jù)。按照中位數(shù)法將RCCC樣本分為高表達(dá)組（RCCC表達(dá)水平≥17.6）和低表達(dá)組（RCCC表達(dá)水平＜17.6），分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。采用Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis）分析MICU1 mRNA表達(dá)與RCCC患者預(yù)后的關(guān)系。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

CAKI-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱條件下培養(yǎng)。按每孔約5×105個(gè)細(xì)胞鋪種于6孔板，恒溫培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度至80%左右轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑采用LipofectamineTM2000。采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法分別將MICU1干涉片段和MICU1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CAKI-1細(xì)胞中，標(biāo)記為siMICU1組和MICU1組；同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的陰性對(duì)照，標(biāo)記為siCtrl組和EV組。

1.6 Western blot法檢測(cè)MICU1蛋白的表達(dá)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAKI-1細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入RIPA裂解液，冰上孵育20 min，在4℃下12 000 r/min離心30 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定MICU1蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。按每孔55μg上樣，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入一抗MICU1抗體（1∶1 000）和β-actin抗體（1∶2 000），4℃孵育過(guò)夜；加羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL顯影。采用ImageJ軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行灰度分析，蛋白表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 MTS法檢測(cè)CAKI-1細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAKI-1細(xì)胞，以2×103/孔細(xì)胞密度加入96孔板，于5% CO2、37℃下孵育24 h；顯微鏡觀察，每孔加入20μL MTS溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值，記錄數(shù)據(jù)記為0 d，同樣方法分別于1 d、2 d、3 d、4 d檢測(cè)剩余4板樣品孔OD值并記錄，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CAKI-1細(xì)胞的增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4×104/孔接種于24孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。用細(xì)胞培養(yǎng)液1∶1 000稀釋EdU A液至50μmol/L，每孔加入500μL稀釋后的溶液，37℃孵育2 h，PBS清洗細(xì)胞2次，加500μL 4%的多聚甲醛溶液固定25 min，PBS洗滌2次；加入500μL 2 mg/mL甘氨酸孵育5 min，PBS洗滌2次；加入500μL 0.5% TritonX-100的PBS，脫色搖床孵育10 min，PBS洗滌2次；加入提前配置好的EdU工作液500μL避光孵育30 min，加入滲透劑后分別用甲醇和PBS洗滌；加1×Hoechst33342反應(yīng)液染細(xì)胞核，熒光顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較RCCC組織及其癌旁正常組織中MICU1蛋白表達(dá)水平的差異；采用χ2檢驗(yàn)分析MICU1蛋白表達(dá)水平與各臨床病理參數(shù)間的關(guān)系；采用Kaplan-Meier以及Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析；采用Cox回歸分析MICU1表達(dá)水平與RCCC患者預(yù)后的關(guān)系。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MICU1蛋白在RCCC組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)法檢驗(yàn)結(jié)果顯示，MICU1表達(dá)于細(xì)胞漿，且RCCC組織中MICU1的陽(yáng)性表達(dá)評(píng)分低于癌旁正常組織［（4.4±0.8）分vs（11.8±1.0）分，t=5.856，P＜0.001）］，見(jiàn)圖1。

圖1 MICU1蛋白在RCCC組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of MICU1 protein in RCCC tissues

2.2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MICU1 mRNA表達(dá)與RCCC患者臨床病理特征的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，MICU1表達(dá)與性別、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），但與年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MICU1表達(dá)與RCCC患者生存的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，MICU1高表達(dá)患者未達(dá)到中位死亡人數(shù)，MICU1低表達(dá)組中位生存期為71.3個(gè)月（95%CI：62.8～79.6個(gè)月），兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.290，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 MICU1表達(dá)與RCCC患者總生存期的關(guān)系Fig.2 Relationship between expression of MICU1 and overall survival in RCCC patients

2.4 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析影響RCCC患者預(yù)后的因素

單因素Cox回歸分析，年齡、TNM分期、MICU1表達(dá)可能與RCCC患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）；多因素Cox回歸分析結(jié)果，MICU1低表達(dá)是影響RCCC患者總生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.641，95%CI：1.191～2.261，P=0.002）。見(jiàn)表2。

2.5 構(gòu)建MICU1干涉和過(guò)表達(dá)細(xì)胞株

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，siMICU1組MICU1蛋白表達(dá)水平低于siCtrl組（t=5.985，P=0.004），見(jiàn)圖3A；MICU1組MICU1蛋白表達(dá)水平高于EV組（t=3.482，P=0.025），見(jiàn)圖3B。說(shuō)明過(guò)表達(dá)和干涉的MICU1細(xì)胞均構(gòu)建成功，可用于后續(xù)MICU1細(xì)胞生物學(xué)功能研究。

表1 MICU1表達(dá)與RCCC患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between expression of MICU1 and clinicopathological features in RCCC patients

2.6 干涉和過(guò)表達(dá)MICU1對(duì)RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siCtrl組和siMICU1組轉(zhuǎn)染第4天對(duì)應(yīng)的OD值分別為0.746±0.021和1.267±0.027，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.110，P=0.001），見(jiàn)圖4A；EV組和MICU1組轉(zhuǎn)染第4天對(duì)應(yīng)的OD值分別為0.903±0.038和0.620±0.034，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.587，P=0.005），見(jiàn)圖4B。

表2 影響RCCC患者總生存期的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of overall survival in patients with RCCC

圖3 Western blot檢測(cè)CAKI-1細(xì)胞中MICU1蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of MICU1 protein in CAKI-1 cells detected by Western blot

圖4 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干涉和過(guò)表達(dá)MICU1對(duì)RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of inter ference and overexpression of MICU1 on the proliferation of RCCC cells detected by MTS assay

2.7 干涉和過(guò)表達(dá)MICU1對(duì)RCCC細(xì)胞增殖的影響

EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siMICU1組和siCtrl組的細(xì)胞增殖率分別為（0.436±0.014）%和（0.288±0.019）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.307，P=0.003），見(jiàn)圖5A；MICU1組和EV組的細(xì)胞增殖率分別為（0.231±0.007）%和（0.319±0.021）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.014，P=0.016），見(jiàn)圖5B。

圖5 EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干涉和過(guò)表達(dá)MICU1對(duì)RCCC細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of interference and overexpression of MICU1 on the proliferation of RCCC cells detected by EdU assay

3 討論

基因治療是目前腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，是一種新的治療理念，其通過(guò)對(duì)某些腫瘤基因進(jìn)行特殊處理，再導(dǎo)入細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展，發(fā)揮靶向治療的作用［9］。迄今為止，關(guān)于線粒體鈣攝取蛋白的基因功能、蛋白表達(dá)及生理特性等方面的研究較多，研究表明MICU1在不同腫瘤中表達(dá)不同。MARCHI等［7］在人類(lèi)結(jié)腸癌腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)MICU1的表達(dá)水平較癌旁正常組織低。WANG等［10］研究亦發(fā)現(xiàn)MICU1在肝癌組織中呈低表達(dá)。本研究亦發(fā)現(xiàn)MICU1在RCCC組織中表達(dá)水平降低。然而，CURRY等［11］卻發(fā)現(xiàn)雌激素受體陰性基底樣乳腺癌中MICU1表達(dá)上調(diào)，這可能與不同腫瘤組織來(lái)源不同有關(guān)。另外，多項(xiàng)研究表明，MICU1表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，如在乳腺癌中MICU1低表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)［12］，而在卵巢癌中MICU1高表達(dá)與患者較低整體存活率有關(guān)［5］。本研究通過(guò)分析517例RCCC患者癌組織中MICU1表達(dá)與患者生存的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MICU1低表達(dá)患者的中位生存期低于高表達(dá)患者，與MICU1在乳腺癌作用一致，低表達(dá)的RCCC患者預(yù)后較差。

本研究還進(jìn)一步在RCCC細(xì)胞中干涉MICU1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖能力顯著增強(qiáng)，反之過(guò)表達(dá)MICU1后，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖能力顯著受抑制。然而，目前就MICU1促進(jìn)RCCC細(xì)胞增殖的機(jī)制尚未闡釋。有研究證實(shí)MICU1是MCU的負(fù)向調(diào)節(jié)因子［13］，在結(jié)直腸癌中MCU表達(dá)升高可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制是線粒體鈣水平的增加及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞能量代謝［14］。而金明朋等［15］也發(fā)現(xiàn)鈉鈣交換體NCLX表達(dá)降低可導(dǎo)致線粒體鈣水平升高，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡。另有學(xué)者［16］報(bào)道MICU1的表達(dá)缺失可誘導(dǎo)線粒體鈣超載，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，并產(chǎn)生化療藥物抗性。MARCHI等［7］研究發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中干涉MICU1可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而過(guò)表達(dá)MCIU1抑制細(xì)胞增殖，其中也伴隨著HeLa細(xì)胞中線粒體鈣水平的升高。由此可見(jiàn)，MICU1表達(dá)下降導(dǎo)致的線粒體鈣水平升高可能是MICU1低表達(dá)促進(jìn)RCCC細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。此外，MICU1表達(dá)下降還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解過(guò)程［5］以及ROS生成增加［16］，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展，這些也可能是MICU1促進(jìn)RCCC細(xì)胞增殖的原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MICU1在RCCC組織中呈低表達(dá)，MICU1低表達(dá)是影響RCCC患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，MICU1低表達(dá)可促進(jìn)RCCC細(xì)胞增殖能力。但由于本研究樣本量及臨床特征數(shù)據(jù)收集有限，故上述結(jié)論仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證，目前MICU1促進(jìn)RCCC細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的分子機(jī)制亦有待闡明。