MKP-1增強(qiáng)組蛋白去乙?；敢种苿?duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞敏感性及其作用機(jī)制

孟亮羅才奎戴小琴陶亮劉山王躍飛

作者單位：430071武漢 武漢市第三醫(yī)院/武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院1神經(jīng)外科，2120救治中心，3胸外科

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，3年生存率僅為5%［1］。腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSC）具有自我更新能力，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥及治療失敗的關(guān)鍵因素［2-3］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)中參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白激酶。MAPK激活可介導(dǎo)GSC自我更新、腫瘤啟動(dòng)和放射抗性形成，是腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展和治療抗性形成的重要步驟［4］。絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶（mitogen-activated protein kinase phosphatase，MAP）受MAPK磷酸酶（MAPK phosphatases，MKPs）家族調(diào)控，能使保守基序中的蘇氨酸和酪氨酸殘基去磷酸化，從而抑制其活性。MKP-1是MKPs家族中功效最高，研究最深入的MAPKs磷酸酶。研究發(fā)現(xiàn)MKP-1在卵巢癌、肺癌及乳腺癌等發(fā)生發(fā)展和化療耐藥中起重要作用［5-6］。然而，MKP-1在腫瘤干細(xì)胞及腦膠質(zhì)瘤中的作用未知。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACi）是一類新的抗腫瘤藥物，能促進(jìn)未分化的癌細(xì)胞分化成熟。HDACi在GSC和腫瘤組織中均可發(fā)揮抗腫瘤作用，但HDACi的抗腫瘤機(jī)制尚未明了，且在不同腫瘤細(xì)胞中的抗癌機(jī)制不完全相同［7-8］。本研究探討MKP-1對(duì)HDACi殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集武漢市第三醫(yī)院神經(jīng)外科2016年1月至2018年12月收治的53例腦膠質(zhì)瘤患者的惡性膠質(zhì)瘤組織及相應(yīng)健康腦組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為世界衛(wèi)生組織定義的Ⅳ期膠質(zhì)瘤患者；⑵未接受放療、化療。排除合并精神性疾病，合并心、肺等其他主要臟器功能障礙，自身免疫疾病，以及嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良患者。其中男性35例，女性18例，年齡41～69歲，平均年齡（57.3±11.3）歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

DMEMF12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，人重組表皮生長(zhǎng)因子、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人白血病抑制因子購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司；B27購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；TRIzol試劑、RT-PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自日本Takara公司；MKP-1及內(nèi)參GAPDH引物設(shè)計(jì)和合成均由上海吉瑪科技生物有限公司完成；MTT、CCK-8、BCA試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司，CD133/2-PE購(gòu)自美國(guó)Miltenyi Biotech公司；抗Sry相關(guān)HMG-box基因家族B亞型（Sry-related HMG box2，SOX2）、抗-SOX9、p38、JNK、ERK1/2抗體及內(nèi)參GAPDH購(gòu)自美國(guó)Santa公司；酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)和PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

根據(jù)參考文獻(xiàn)［9］對(duì)腦膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行機(jī)械破碎，獲得惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以2%的胎牛血清在培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1周，然后在含10%胎牛血清和抗生素的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過形態(tài)學(xué)觀察和抗-GFAP單克隆抗體染色確定其膠質(zhì)源性。將惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞分散成單個(gè)并用含0.5%牛血清白蛋白和2 mmol/L乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖溶液重懸，以微磁珠進(jìn)行磁性標(biāo)記，然后以磁細(xì)胞分離柱分離陽(yáng)性磁細(xì)胞，CD133/2-PE染色后進(jìn)行流式分析確認(rèn)。篩選出的CD133+細(xì)胞即為GSC，以含有濃度均為20μg/L的人重組表皮生長(zhǎng)因子、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人白血病抑制因子和2% B27的DMEMF12培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持原發(fā)性腫瘤分子特征。

1.4 構(gòu)建MKP-1過表達(dá)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞模型

轉(zhuǎn)染前1 d，將膠質(zhì)瘤干細(xì)胞用不含抗生素的培養(yǎng)基以1.0×105/孔的密度鋪板。細(xì)胞用含濃度均為20μg/L的人重組表皮生長(zhǎng)因子、人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、人白血病抑制因子和2% B27的DMEMF12培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%～90%時(shí)，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為3組：MKP-1組轉(zhuǎn)染MKP-1過表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，空白組僅加入等體積的含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液。各組轉(zhuǎn)染6 h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)染后72 h進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HDACi MS-275半數(shù)抑制濃度

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKP-1組、對(duì)照組、空白組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，以5 000/孔的密度接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)無細(xì)胞的空白對(duì)照組，以梯度濃度的HDACi MS-275處理，藥物終濃度依次為1.0 nmol/mL、2.0 nmol/mL、5.0 nmol/mL、10.0 nmol/mL、20.0 nmol/mL、40.0 nmol/mL、80.0 nmol/mL、160.0 nmol/mL。48 h后，每孔加入5μg/mL MTT溶液20μL，孵育4 h后棄上清液，加入DMSO 200μL/孔，振蕩10 min，酶標(biāo)儀讀取吸光度A490值，計(jì)算HDACi MS-275的IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKP-1組、對(duì)照組、空白組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以4 000/孔的密度接種于96孔板。將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后每孔加入CCK-8溶液10μL，繼續(xù)孵育1～4 h。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值。根據(jù)吸光度值計(jì)算3組細(xì)胞增殖能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在檢測(cè)HDACi對(duì)細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)中分為HDACi組和對(duì)照組，HDACi組中各孔加入含1/2 IC50HDACi MS-275培養(yǎng)液100μL，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)液，其余步驟同上。

1.7 RT-PCR檢測(cè)MKP-1、SOX2及SOX9 mRNA的表達(dá)情況

用Trizol法提取待測(cè)細(xì)胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-PCR。PCR體系（20μL）：待測(cè)cDNA 2μL，上游引物、下游引物各0.8μL，ROX 0.4μL，TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，ddH2O 6μL；反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s、60℃34 s 40個(gè)循環(huán)。以ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，引物序列見表1。收集熒光信號(hào)，并建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，以2-△△Ct法分析，進(jìn)行半定量比較。以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOX2、SOX9、p38、JNK及ERK1/2蛋白表達(dá)情況

提取各組細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將各組蛋白與Loading buffer充分混合后于100℃煮沸5 min變性，每孔50μL并加入SDS-PAGE凝膠上樣孔進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉。加入按使用說明稀釋后的待測(cè)一抗（目的蛋白SOX2、SOX9、p38、JNK，稀釋比例均為1∶1 000，ERK1/2稀釋比例為1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（稀釋比例1∶5 000）。37℃孵育1 h，TBST清洗后以ECL發(fā)光液顯影，采用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參，分析各蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MKP-1在腦膠質(zhì)瘤組織和健康腦組織中的表達(dá)

RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中MKP-1的表達(dá)水平較對(duì)照健康腦組織明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.31±0.06 vs 1.00±0.10，P＜0.001），見圖1。

圖1 MKP-1在腦膠質(zhì)瘤組織及健康腦組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of MKP-1 in glioma tissues and healthy brain tissues

2.2 過表達(dá)MKP-1腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞構(gòu)建及對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

以MKP-1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MKP-1組中MKP-1表達(dá)較對(duì)照組和空白組明顯升高（2.46±0.43 vs 0.99±0.10 &1.01±0.10，P＜0.001），對(duì)照組和空白組MKP-1表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.99±0.10 vs 1.01±0.10，P=0.990），見圖2A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MKP-1組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組和空白組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.64±0.06 vs 1.01±0.10 & 0.99±0.11，P＜0.001），見圖2B。

圖2 轉(zhuǎn)染后腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中MKP-1的表達(dá)及細(xì)胞增殖能力Fig.2 Expression of MKP-1 in GSC and cell proliferation ability after transfection

2.3 MKP-1對(duì)HDACi作用腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HDACi MS-275處理腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的IC50為（55.12±7.31）nmol/mL。HDACi處理后，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，HDACi組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組明顯降低（0.63±0.05 vs 1.01±0.10，P＜0.001），見圖3A。RT-PCR結(jié)果顯示，HDACi組MKP-1表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（2.01±0.23 vs 0.99±0.08，P＜0.001），見圖3B。HDACi MS-275處理過表達(dá)MKP-1膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的IC50明顯較空白組和對(duì)照組降低［（33.12±6.12）nmol/mL vs 53.13±5.36）nmol/mL &（55.12±7.31）nmol/mL，P＜0.001］，見圖3C。

圖3 MKP-1對(duì)HDACi作用腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of MKP-1 on glioma stem cells treated by HDACi

2.4 MKP-1過表達(dá)對(duì)SOX2和SOX9表達(dá)的影響

RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MKP-1組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)因子SOX2、SOX9 mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組和空白組明顯降低（0.61±0.05 vs 1.01±0.11 & 0.99±0.09，P＜0.05；0.53±0.09 vs 0.98±0.09 &1.01±0.11，P＜0.005），見圖4。

圖4 MKP-1過表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中SOX2和SOX9表達(dá)的影響Fig.4 Effect of MKP-1 overexpression on SOX2 and SOX9 in glioma stem cells

2.5 MKP-1過表達(dá)對(duì)p38、JNK和ERK1/2表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MKP-1組腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中JNK和p38的表達(dá)較對(duì)照組和空白組明顯降低（P＜0.001），而ERK1/2在3組中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖5 MKP-1過表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中p38、JNK和ERK1/2表達(dá)的影響Fig.5 Effect of MKP-1 overexpression on p38，JNK and ERK1/2 in glioma stem cells

3 討論

MKP-1在各種腫瘤細(xì)胞中普遍表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄隨著生長(zhǎng)因子、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子、缺氧以及DNA損傷而迅速增加［10］。目前研究認(rèn)為MKP-1與腫瘤發(fā)生有關(guān)，但在各類腫瘤中的作用不一。有研究報(bào)道MKP-1過表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胃癌、乳腺癌和肺癌發(fā)生［11-14］。MKP-1通過誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和蛋白酶C途徑可促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展，還可調(diào)控ERK活性而影響肝細(xì)胞癌進(jìn)展［15］。其中在肝細(xì)胞癌和頭頸部腫瘤的發(fā)生中MKP-1主要發(fā)揮抑制作用［16］。本研究亦發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤組織中MKP-1表達(dá)明顯較健康腦組織降低，說明MKP-1與膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)。

HDACi是一組表觀遺傳分子，其中Bellinostat已獲FDA批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。HDACi在膠質(zhì)瘤，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的臨床前和臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景［17-18］。本研究采用HDACi MS-275作用膠質(zhì)瘤干細(xì)胞后其增殖能力明顯降低，且MKP-1表達(dá)明顯上調(diào)，在構(gòu)建的MKP-1過表達(dá)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HDACi的殺傷效果在MKP-1過表達(dá)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中更明顯。GIL-ARAUJO等［15］采用HDACi SAHA處理腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)MKP-1表達(dá)升高2～15倍。提示MKP-1有望成為監(jiān)測(cè)腦膠質(zhì)瘤對(duì)HDACi敏感性的生物標(biāo)志物。

MKP-1具有核定位，其主要底物是氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2，ERK1/2），但對(duì)這些底物的偏好取決于組織或特定細(xì)胞類型［5-6］。MKP-1可使p38和JNK通路激酶去磷酸化而失活。本研究發(fā)現(xiàn)MKP-1在GSC中過表達(dá)可降低其增殖能力，抑制腫瘤干細(xì)胞相關(guān)因子SOX2、SOX9的表達(dá)，從而導(dǎo)致GSC的自我更新能力降低，這可能是MKP-1過表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制之一。MKP-1的活性與GSC維持呈負(fù)相關(guān)，MKP-1可能調(diào)節(jié)GSC增殖、自我更新和分化之間的相互作用，除SOX因子外，這些活動(dòng)極可能由JNK激酶介導(dǎo)。本研究進(jìn)一步檢測(cè)過表達(dá)MKP-1 GSC中p38和JNK的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)高水平的MKP-1可下調(diào)p38和JNK表達(dá)。JNK活性增加是GSC誘導(dǎo)腫瘤啟動(dòng)的動(dòng)力，同樣JNK途徑的激活可使GSC維持在未成熟階段并促進(jìn)放射治療抗性［19-21］。因此HDACi的殺傷效果在MKP-1過表達(dá)的GSC中更明顯可能通過下調(diào)p38和JNK表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDACi MS-275對(duì)GSC細(xì)胞亞群具有確切的殺傷效果，MKP-1過表達(dá)時(shí)HDACi殺傷作用更明顯，這可能通過降低干細(xì)胞標(biāo)志物SOX2、SOX9表達(dá)，減少GSC的自我更新實(shí)現(xiàn)。此外，MKP-1還可降低GSC中p38和JNK的活化，這可能是其抑制GSC維持和誘導(dǎo)腫瘤啟動(dòng)能力的機(jī)制之一。后續(xù)將進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析HDACi及MKP-1表達(dá)對(duì)GSC成瘤能力的影響，探索HDACi殺傷腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制及MKP-1在其中的作用。