高脂飲食對結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的影響及作用機制

郭世奎張劍李錦媛包維民張鵬黃映光凌平王勇志趙泉

作者單位：650032昆明 1云南省第一人民醫(yī)院/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外一科；650500昆明 2昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率在全球惡性腫瘤中均位于前三位［1］。臨床數(shù)據(jù)表明，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，其中肝臟是最常見的轉(zhuǎn)移靶器官［2］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，肥胖導(dǎo)致的慢性低度炎癥、胰島素抵抗、脂肪來源激素失衡和腸道微生物群等均是已知的促進結(jié)腸癌發(fā)病的因素［3］，而高脂飲食可直接或通過誘導(dǎo)肥胖增加結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險［4］。也有研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食可通過誘導(dǎo)上調(diào)結(jié)腸癌中K-Hcy的表達而抑制DNA損傷修復(fù)，從而促進結(jié)腸癌發(fā)展［5］。然而高脂飲食能否促進結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移及其作用機制仍未知。基質(zhì)細胞衍生因子-l（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是CXC趨化因子家族成員，通過結(jié)合并激活受體CXCR4而參與調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移［6-7］。近年在結(jié)直腸癌研究中亦發(fā)現(xiàn)CXCR4高表達可促進腫瘤細胞淋巴結(jié)和遠端轉(zhuǎn)移［8-10］。本研究通過建立高脂飲食的結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，探討高脂飲食對結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的影響及其是否通過SDF-1/CXCR4信號通路發(fā)揮作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

人結(jié)腸癌細胞系DLD1購自中國科學(xué)院上海細胞所，用含有10%胎牛血清和10μg/mL的青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37℃恒溫條件下培養(yǎng)。30只NSI第三代免疫缺陷裸鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心（許可證號：SCXK〔粵〕2016-0029），雌性，體重18～20 g，4～12周齡。普通飼料和高脂飼料購自上海達燊實業(yè)有限公司，高脂飼料主要成分為酪蛋白、L-Cystine胱氨、玉米淀粉、麥芽糊精、蔗糖、纖維素、豆油、豬油、復(fù)合礦物質(zhì)、磷酸氫鈣、碳酸鈣、檸檬酸鉀、復(fù)合維生素、酒石酸氫膽堿。CXCR4拮抗劑AMD3100購自Sigma公司；CXCR4和兔抗人單克隆抗體購自Abcam公司；BCA試劑盒、裂解液RIPA購自生工生物工程（上海）股份有限公司；總RNA提取試劑盒（TRIzol法）購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；血清瘦素檢測試劑盒購自上海通蔚生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；SDF-1一抗、CXCR4一抗、β-actin一抗和HRP標記的二抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。

1.2 結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建及分組

取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌DLD1細胞制成1×107/mL細胞懸液，取100μL細胞懸液注射至裸鼠脾臟下，建立裸鼠移植瘤模型。將30只荷瘤裸鼠隨機分成對照組、高脂飲食組和高脂飲食+AMD3100組，每組10只。其中，對照組裸鼠以普通飼料喂養(yǎng)（3 g/次，2次/d）；高脂飲食組裸鼠以高脂飼料喂養(yǎng)（3 g/次，2次/d）；高脂飲食+AMD3100組裸鼠以高脂飼料喂養(yǎng)（3 g/次，2次/d）同時腹腔注射0.1 mmol/L的AMD3100 100μL，每天腹腔注射1次，持續(xù)12周。本研究經(jīng)昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準。動物實驗根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院動物護理和使用指南進行。

1.3 裸鼠基本情況檢測

實驗期間每隔2 d于同一時間點稱量裸鼠體重，12周后以頸椎脫臼方式處死。處死前，采用眼球取血法收集各組裸鼠血液，3 000 r/min離心15 min，收集上層血清；按照血清瘦素檢測試劑盒使用說明書測定裸鼠血清瘦素濃度。剝離裸鼠腎周脂肪組織、游離附睪墊脂肪組織和肝臟組織，稱量脂肪重量和肝臟重量。收集肝臟組織，進行HE染色，選取不同切面的5個切片，觀察各組裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移情況；利用游標卡尺測定腫瘤長直徑和短直徑并計算腫瘤體積。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積=長直徑×短直徑2/2。

1.4 Western blot檢測SDF-1和CXCR4蛋白表達情況

取移植瘤組織（約85mm3）用無菌1×PBS沖洗2次，加入0.5 mL細胞裂解液RIPA，勻漿器切割，室溫放置30 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清蛋白液。根據(jù)BCA試劑盒說明書進行蛋白定量。取100μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入SDF-1、CXCR4一抗，4℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗，37℃孵育1 h，加入ECL超敏發(fā)光液進行X線片曝光，采用Image J軟件測定灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白。實驗重復(fù)3次。

1.5 RT-qPCR檢測SDF-1和CXCR4 mRNA表達情況

按照總RNA提取試劑盒說明書（TRIzol法）提取結(jié)腸癌組織總RNA，測定RNA濃度和純度。取上述提取的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行RT-qPCR。RT-qPCR按照SYBR Green Master Mix說明書進行，反應(yīng)體系：qPCR mastermix 10μL，上、下游引物各0.6μL，RNase-Free ddH2O補充至20μL；反應(yīng)條件：95℃40 s，95℃5 s，60℃30 s。引物序列：SDF-1上游為5'-C CGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3'，下游為5'-CCTGTTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3'；CXCR4上 游為5'-AGCTGTTGGCTGAAAAGGTGGTCTATG-3'，下游為5'-GCGCTTCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3'；β-actin上游為5'-CACCAACTGGGACGACATGG-3'，下游為5'-CCAGGGTACATGGTGCC-3'。以β-actin為內(nèi)參。采用2-△△Ct法計算SDF-1和CXCR4 mRNA的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad Prism統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料采用n（%）表示，比較采用Fisher精確檢驗；計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對結(jié)腸癌移植瘤裸鼠體質(zhì)的影響

30只NSI第三代免疫缺陷裸鼠脾臟注射結(jié)腸癌DLD1細胞5 d后均成瘤，成瘤率100.0%。裸鼠生長狀態(tài)良好，飲食和飲水無異常。12周后，高脂飲食組裸鼠體重、肝臟重量、脂肪重量和血清瘦素濃度均高于對照組（P＜0.05）。高脂飲食+AMD3100組裸鼠體重、肝臟重量、脂肪重量和血清瘦素濃度則低于高脂飲食組（P＜0.05）。見圖1、表1。

2.2 高脂飲食對結(jié)腸癌移植瘤裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移的影響

對照組、高脂飲食組裸鼠發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移的比例分別為30.0%（3/10）、80.0%（8/10），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.035）。高脂飲食組裸鼠的腫瘤體積及肝臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯高于對照組［（3.83±0.42）mm3vs（1.00±0.15）mm3，P＜0.001；（4.33±0.58）個vs（1.33±0.58）個，P=0.002）］，見圖2。

圖1 高脂飲食對結(jié)腸癌移植瘤裸鼠體質(zhì)的影響Fig.1 Effect of high-fat diet on constitution of colon cancer xenografts in nude mice

表1 高脂飲食對結(jié)腸癌移植瘤裸鼠體質(zhì)的影響Tab.1 Effect of high-fat diet on constitution of colon cancer xenografts in nude mice

高脂飲食+AMD3100組裸鼠發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移的比例為40.0%（8/10），與高脂飲食組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（40.0% vs 80.0%，P=0.085）。高脂飲食+AMD3100組裸鼠的腫瘤體積及肝臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著低于高脂飲食組［（1.96±0.15）mm3vs（3.83±0.42）mm3，P＜0.001；（2.33±0.58）個vs（4.33±0.58）個，P=0.002）］，見圖2。

圖2 高脂飲食對結(jié)腸癌移植瘤裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移的影響Fig.2 Effect of high-fat diet on liver metastasis of colon cancer xenografts in nude mice

2.3 高脂飲食對結(jié)腸癌移植瘤組織中SDF-1和CXCR4表達的影響

Western blot和RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，高脂飲食組結(jié)腸癌移植瘤組織中的SDF-1蛋白和mRNA的表達水平均較對照組上調(diào)（2.27±0.21 vs 1.00±0.12，P＜0.001；3.11±0.23 vs 1.00±0.09，P＜0.001），見圖3；CXCR4蛋白和mRNA的表達水平亦較對照組上調(diào)（2.41±0.26 vs 1.00±0.15，P＜0.001；2.90±0.14 vs 1.00±0.10，P＜0.001），見圖4。

高脂飲食+AMD3100組結(jié)腸癌移植瘤組織的SDF-1蛋白和mRNA的表達水平分別為1.59±0.12和1.92±0.13，較高脂飲食組比較明顯下調(diào)（1.59±0.12 vs 2.27±0.21，P=0.009；1.92±0.13 vs 3.11±0.23，P＜0.001），見圖3。高脂飲食+AMD3100組結(jié)腸癌移植瘤組織中的CXCR4蛋白和mRNA的表達水平分別為1.48±0.08和1.77±0.11，與高脂飲食組比較亦明顯下調(diào)（1.48±0.08 vs 2.41±0.26，P=0.002；1.77±0.11 vs 2.90±0.14，P＜0.001），見圖4。

圖3 高脂飲食對結(jié)腸癌組織中SDF-1蛋白和mRNA表達的影響Fig.3 Effect of high-fat diet on the protein and mRNA expression of SDF-1 in colon cancer

圖4 高脂飲食對結(jié)腸癌組織中CXCR4蛋白和mRNA表達的影響Fig.4 Effect of high-fat diet on the protein and mRNA expression of CXCR4 in colon cancer tissues

3 討論

大量研究報道高脂飲食在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中扮演重要角色［11-13］。BEYAZ等［14］發(fā)現(xiàn)高脂飲食可增強腸道祖細胞的干性和致瘤性，從而促進結(jié)直腸瘤發(fā)生。肝臟是結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的主要靶向器官，然而高脂飲食能否促進結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移還未知。本研究將人結(jié)腸癌DLD1細胞接種至裸鼠脾臟構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，建模5 d后30只裸鼠均成瘤，成瘤率100.0%。采用高脂飼料和普通飼料持續(xù)喂養(yǎng)荷瘤裸鼠12周后，發(fā)現(xiàn)高脂飲食組裸鼠體重、脂肪重量、肝臟重量、血清瘦素濃度均高于對照組，說明高脂飲食調(diào)整了移植瘤裸鼠的機體生理狀況，有助于腫瘤轉(zhuǎn)移。瘦素在抑制食欲、增加能量消耗、減少能量攝取以及抑制脂肪合成方面發(fā)揮調(diào)控作用［15-16］。因此，高脂飲食組移植瘤裸鼠血清瘦素濃度增加可能是裸鼠對高脂飲食的負反饋調(diào)節(jié)，使之恢復(fù)正常體重。此外，高脂飲食組移植瘤裸鼠的腫瘤體積、發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移的比例及肝臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)目均明顯高于對照組，說明高脂飲食可以促進結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移。

有研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1參與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移調(diào)控［9］。CXCR4是SDF-1的受體，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4高表達可促進結(jié)直腸癌細胞淋巴結(jié)和遠端轉(zhuǎn)移［7-9］。研究表明SDF-1/CXCR4軸的激活能促進腫瘤細胞趨化遷移［9，17］，但是高脂飲食在這一過程中的調(diào)控作用尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，高脂飲食組裸鼠移植瘤組織中，SDF-1、CXCR4的蛋白和mRNA表達均較對照組明顯上調(diào)，提示高脂飲食可能通過SDF-1/CXCR4信號通路促進結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移。

為進一步驗證高脂飲食是否通過SDF-1/CXCR4信號通路促進結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移，本研究同時對高脂飲食喂養(yǎng)的移植瘤裸鼠注射AMD3100。AMD3100是一種CXCR4的拮抗劑，可通過阻斷SDF-1與CXCR4的結(jié)合，從而抑制SDF-1/CXCR4信號通路激活，目前已進入臨床Ⅱ期試驗［18-19］。本研究在高脂飼料喂養(yǎng)下進一步給予裸鼠注射AMD3100，結(jié)果AMD3100處理12周后裸鼠體重、脂肪重量、肝臟重量和血清瘦素濃度均低于高脂飲食組。高脂飲食后，裸鼠發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移的比例明顯增加，而經(jīng)AMD3100處理后發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移的裸鼠比例則明顯減少，肝臟轉(zhuǎn)移灶數(shù)量及腫瘤體積亦明顯降低。此外，經(jīng)AMD3100處理后，移植瘤組織中SDF-1、CXCR4的蛋白和mRNA表達水平均低于高脂飲食組。以上結(jié)果表明，高脂飲食可能通過激活SDF-1/CXCR4信號通路而促進結(jié)腸癌的肝臟轉(zhuǎn)移。

綜上所述，高脂飲食可能通過激活SDF-1/CXCR4信號通路而促進結(jié)腸癌的肝臟定向轉(zhuǎn)移，對防治結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，提高患者預(yù)后具有重要意義，但具體機制還有待進一步研究。