紅棗發(fā)酵飲料的研制及電子感官技術(shù)在其貨架期評定中的應(yīng)用

王鑫，李雅麗，馬芙俊，吳逸民，段盛林，王維崗，李兵

1(河北工程大學(xué)，河北 邯鄲，056038) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 3(功能主食創(chuàng)制與慢病營養(yǎng)干預(yù)北京市重點實驗室，北京，100015) 4(清澗北國棗業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 榆林，718300)

紅棗又名華棗，是我國北方栽培發(fā)展的熱點果品之一[1]，具有“養(yǎng)陰安神、補(bǔ)中益氣、通九竅、潤心肺、治虛損”等功效[2]。紅棗口感甘甜、富含Vc等多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中干棗總糖含量高達(dá)53%～72%[3]，是乳酸菌發(fā)酵的優(yōu)良底物[4]。

目前，關(guān)于紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料報道較少，且研究主要集中在紅棗功能性成分檢測和醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用探討[5-7]。紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料的關(guān)鍵是乳酸菌利用紅棗的營養(yǎng)成分進(jìn)行大量繁殖，且在產(chǎn)品貨架期內(nèi)維持發(fā)酵菌種的較高存活率[7-9]。韓雪[10]通過研究5種乳酸菌分別對陜西狗頭棗棗漿發(fā)酵后的游離態(tài)酚酸含量、組成和總抗氧化活性的變化，得出植物乳桿菌能夠促進(jìn)游離態(tài)酚酸的釋放，有效提高棗漿生物利用率的結(jié)論。張麗華等[11]研究得出灰棗紅棗汁經(jīng)過植物乳桿菌發(fā)酵后具有一定的抗氧化和自由基清除活性的能力。本研究通過3種不同乳酸菌復(fù)合發(fā)酵技術(shù)制備一款紅棗發(fā)酵飲料，測定其活性物質(zhì)環(huán)磷酸腺苷含量，并利用電子鼻、電子舌、色差儀電子感官技術(shù)評定其貨架期質(zhì)量，為其市場流通奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清澗紅棗，市售；干酪乳桿菌(活菌數(shù)≥1.0×1011CFU/mL)、植物乳桿菌(活菌數(shù)3.0×1011CFU/mL)、鼠李糖乳桿菌(活菌數(shù)≥3.0×1011CFU/mL)，江蘇微康生物科技有限公司；NaHCO3，天津紅依食品有限公司；果膠酶(酶活力10 000 U/g)、纖維素酶(酶活力20 000 U/g),北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司； MRS瓊脂培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限公司；(NH4)2HPO4江蘇克倫多食品配料有限公司；環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),北京索萊寶科技有限公司；甲醇(色譜純)，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；KH2PO4(色譜純)，上海安普實驗科技股份有限公司。

ISO9001型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FE20型pH值計，梅特勒儀器上海有限公司；PAL-1 型數(shù)顯手持式折光糖度儀，日本 ATAGO；LD4-40型低速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；HC-3618R型高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DL-CJ2NDI型超凈工作臺，北京松聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-150B型生化培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；LC-6AD型高效液相色譜儀，島津(香港)有限公司；VORTEX-5型旋渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TS-5000Z型電子舌，日本Insent公司；Fox4000型電子鼻，法國Alpha M.O.S；SE-6000型分光色差計，日本電色公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅棗發(fā)酵飲料的制備

清澗紅棗(干棗)→揀選、清洗→預(yù)煮(95 ℃、10 min)→去核→加水打漿→pH調(diào)至4.5→酶解(50 ℃、1 h)→滅酶(95 ℃、10 min)→冷卻、離心分離(3 000 r/min、5 min)→棗原清汁pH值調(diào)節(jié)4.5→殺菌(95 ℃、10 min)→冷卻(37 ℃)制得清汁備用

挑選水分約22%～25%、無腐爛變質(zhì)、無病蟲害的干棗，清洗；紅棗與水按1∶2.5的比例置于95 ℃，水浴10 min。將預(yù)煮后的棗去核，加入預(yù)煮水進(jìn)行打漿，定容紅棗與水料液比1∶4。調(diào)節(jié)pH至4.5，分別添加1.25 g/L果膠酶和纖維素酶，50 ℃酶解1 h。升溫至95 ℃，滅酶5 min。經(jīng)3 000 r/min，5 min離心后，收集上清液。調(diào)節(jié)pH至4.5，95 ℃滅菌10 min，制得清汁備用(棗清汁初始可溶性固形物含量為15.5%)。

在無菌條件下，向滅菌后的棗清汁接種一定量的供試菌種，置于37℃培養(yǎng)箱恒溫發(fā)酵。

1.2.2 菌種發(fā)酵時間的確定

分別研究干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌，接菌量均為0.01%，發(fā)酵時間(0、12、24、48、72、96 h)，發(fā)酵溫度37 ℃；考察其對紅棗乳酸菌飲料品質(zhì)的影響，以感官評價為評價指標(biāo)，確定最適發(fā)酵時間。

1.2.3 紅棗發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗

結(jié)合前期試驗，分別研究初始可溶性固形物含量(12.5%、13.5%、14.5%、15.5%)，接菌量均為0.01%(m/m)，于37 ℃發(fā)酵48 h過程中對紅棗發(fā)酵飲料pH的影響；接種干酪乳桿菌(0.005%、0.007 5%、0.01%)、植物乳桿菌(0.001 25%、0.002 5%、0.005%)、鼠李糖乳桿菌(0.001 25%、0.002 5%、0.005%)，初始可溶性固形物含量13.5%，發(fā)酵48 h過程中對紅棗發(fā)酵飲料pH的影響。

1.2.3.2 正交試驗

在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時間、棗清汁初始可溶性固形物含量、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌菌種為考察因素，發(fā)酵時間取4個水平，初始可溶性固形物含量及3個菌種添加量各取2個水平，以pH值、感官評定為考察指標(biāo)設(shè)計L8(41×24)正交試驗(表1)，確定紅棗發(fā)酵飲料的最佳發(fā)酵工藝條件。

表1 發(fā)酵工藝因素水平表

1.3 HPLC法測定環(huán)磷酸腺苷含量

通過對比棗清汁和發(fā)酵后環(huán)磷酸腺苷含量的變化，對比乳酸菌發(fā)酵對環(huán)磷酸腺苷含量的影響。

1.3.1 環(huán)磷酸腺苷含量分析方法[12-14]

使用儀器：LC-6AD高效液相色譜儀；色譜柱：XTERRA?MS C18(4.6 mm×250mm，5 μm)；流動相：色譜純甲醇∶0.05 mol/L色譜純KH2PO4(20∶80)；流速：0.5 mL/min；檢測波長為：254 nm；柱溫：40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

用超純水溶解配制100 μg/mL的環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋配制成1、3、5、10、15 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測，均臨用新配。

1.3.3 樣品前處理

分別準(zhǔn)確吸取1 mL棗清汁和發(fā)酵棗汁于10 mL容量瓶，用超純水定容，搖勻移至15 mL離心管，旋渦振蕩混勻，經(jīng)高速離心后過0.22 μm微孔濾膜進(jìn)樣，分析測定環(huán)磷酸腺苷峰面積色譜圖，并計算出棗清汁與發(fā)酵棗汁中環(huán)磷酸腺苷含量。

1.4 貨架期評定

按1.2.3.2較優(yōu)發(fā)酵條件制備出乳酸菌發(fā)酵飲料，在4 ℃條件下貯藏28 d，結(jié)合感官評定、微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)及電子感官技術(shù)對紅棗發(fā)酵飲料貯藏期內(nèi)品質(zhì)進(jìn)行評定并以此判定產(chǎn)品貨架期。

1.4.1 人體感官評定

邀請10名感官評定者參照表1的感官評定標(biāo)準(zhǔn)，分別從色澤、口感、香氣、和澄清度為評分項目，按評分要求在給定的分?jǐn)?shù)內(nèi)逐項打分后，滿分為100分，四舍五入，以整數(shù)標(biāo)度，取其平均值作為評分結(jié)果[12]。

表2 發(fā)酵紅棗汁的感官評定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 微生物及理化指標(biāo)的測定

乳酸菌活菌數(shù)：按照GB4789.35—2016規(guī)定執(zhí)行[16]；總酸按照GB12456—2008規(guī)定執(zhí)行，采用酸堿滴定法[17]；還原糖按照GB5009.7—2016規(guī)定執(zhí)行，采用的直接滴定法[18]。

1.4.3 電子感官技術(shù)評定

1.4.3.1 電子鼻感官評定

利用電子鼻MOS 傳感器對紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料香氣的不同響應(yīng)值進(jìn)行分析，通過電子鼻AlpHa Soft 12.45 版軟件對紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料的檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

取1 mL樣品，注入到20 mL上樣頂空瓶中，密封封口，放置室溫10 min，待揮發(fā)性物質(zhì)達(dá)到平衡狀態(tài)后，采用頂空上樣法對樣品進(jìn)行檢測。檢測參數(shù)設(shè)置：采集時間120 s，潔凈空氣流速150 mL/min，進(jìn)樣量4 mL，注射速度1 000 μL/s；自動進(jìn)樣儀器參數(shù)條件設(shè)置：孵化時間120 s，孵化溫度50 ℃[19,21-22]。

1.4.3.2 電子舌感官評定

將電子舌傳感器經(jīng)過活化、自檢、校準(zhǔn)和診斷后，取樣品25 g于電子舌專用樣品杯中，室溫下放置。檢測序列采用清洗溶液和待測樣品交替進(jìn)行滋味檢測。測定方法：電極清洗90 s→緩沖液清洗120 s→緩沖液清洗120 s→穩(wěn)定化30 s→測試樣品30 s→緩沖液清洗3 s→緩沖液清洗3 s→回味測定30 s。循環(huán)測定4次，采用電子舌自帶軟件取穩(wěn)定狀態(tài)下的信號進(jìn)行分析[15,20,24]。

1.4.3.3 色差儀對顏色的評定

在貯藏0、7、14、21、28 d時，稱取20 g待測樣品于色差儀樣品池內(nèi)，測定其明亮度L*、紅綠色調(diào)a*、藍(lán)黃色調(diào)b*3個方面進(jìn)行評定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗樣品均重復(fù)3次，結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示。采用Microsoft Excel和Origin 8.6軟件處理實驗數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計分析、作圖，差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種發(fā)酵時間的確定

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間延長，3種不同菌種發(fā)酵飲料的pH均呈現(xiàn)先快后慢的下降趨勢，總酸呈現(xiàn)出緩慢升高趨勢。植物乳桿菌在發(fā)酵前24 h，pH值低于其他2菌種，總酸含量對應(yīng)高于其他2種菌種。分析原因可能是植物乳桿菌能高效利用棗汁中的碳源產(chǎn)酸，較于其他2種乳酸菌的產(chǎn)酸量高。但發(fā)酵至48 h，3個菌種發(fā)酵飲料的pH和總酸均無顯著差異(P>0.05)。在48 h至96 h，3個菌種發(fā)酵飲料pH下降速度明顯降低。結(jié)合感官評定、pH和總酸含量，綜合確定發(fā)酵終止時間為48 h。

圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵飲料pH和總酸的影響

對3種不同菌種發(fā)酵48h發(fā)酵飲料進(jìn)行感官評定，結(jié)果見表3。

表3 乳酸菌發(fā)酵飲料感官評定結(jié)果

結(jié)果表明，干酪乳桿菌發(fā)酵飲料無論從色澤、口感、香氣、澄清度得分都很高。植物乳桿菌發(fā)酵飲料在口感、香氣、澄清度方面得分較高，但顏色欠佳，試驗中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌樣品顏色暗紅，分析原因可能是植物乳桿菌在37 ℃、48 h培養(yǎng)發(fā)酵過程中使紅棗中營養(yǎng)成分產(chǎn)生了非酶褐變[25]。鼠李糖乳桿菌發(fā)酵飲料在色澤、口感、香氣方面得分均較高，但樣品澄清度欠佳。綜合分析，干酪乳桿菌宜作為主要發(fā)酵菌種，同時復(fù)配小比例植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌，在保持產(chǎn)品較佳色澤及澄清度前提下使整體風(fēng)味更加豐富飽滿。

2.2 紅棗發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 棗清汁初始可溶性固形物含量對乳酸菌發(fā)酵汁pH值影響

由圖2可知，隨著棗清汁初始可溶性固形物含量提高，干酪乳桿菌發(fā)酵飲料pH變化不顯著(P>0.05)，但植物乳桿菌及鼠李糖乳桿菌發(fā)酵飲料pH值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。說明初始可溶性固形物含量過低或過高均不利于2個菌種進(jìn)行發(fā)酵。初步篩選初始可溶性固形物含量13.5%和14.5%。

圖2 初始可溶性固形物含量對發(fā)酵飲料pH影響

2.2.2 發(fā)酵菌種及添加量對乳酸菌發(fā)酵飲料pH值影響

由圖3 可知，經(jīng)過48 h發(fā)酵，3菌種發(fā)酵飲料pH均隨菌種添加量增加而降低。

圖3 發(fā)酵菌種及添加量對發(fā)酵飲料pH值影響

干酪乳桿菌菌種添加量為0.005%、0.007 5%、0.01%時,經(jīng)過48 h發(fā)酵，發(fā)酵飲料pH值分別為4.05、3.82、3.65，即干酪乳桿菌發(fā)酵飲料pH值隨菌種添加量增加而顯著降低(P<0.05)。而干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌發(fā)酵飲料pH隨著菌種添加量增加未顯著變化(P>0.05)，即植物乳桿菌與鼠李糖乳桿菌在添加量分別為0.001 25%、0.002 5%、0.005%時,經(jīng)過48 h發(fā)酵，發(fā)酵飲料pH值差異不顯著(P>0.05)。因此，選定干酪乳桿菌添加量0.007 5%和0.01%、植物乳桿菌添加量0.002 5%和0.001 25%、鼠李糖乳桿菌添加量0.002 5%和0.001 25%作為正交實驗考察因素。

2.2.3 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行L8(41×24)正交試驗，以pH及感官評分為指標(biāo)，結(jié)果如表4所示。

通過R值計算，以pH值為考察指標(biāo)時，RA>RB>RD>RE>RC，即發(fā)酵時間>初始可溶性固形物>植物乳桿菌>鼠李糖乳桿菌>干酪乳桿菌。結(jié)合2.1結(jié)果，干酪乳酸菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵48 h時，pH值分別為3.61、3.56、3.55，此時產(chǎn)品感官得分較高。pH過高說明發(fā)酵速度太慢，pH過低口感會變差。因此選定pH在3.55～3.61范圍內(nèi)的組合為宜，即A2B1C1D2E2和A2B2C2D1E1。

以感官評定得分為指標(biāo)時，RA>RC>RD=RE>RB，即發(fā)酵時間>干酪乳桿菌>植物乳桿菌=鼠李糖乳桿菌>初始可溶性固形物含量，得出最佳工藝方案是A2B1C1D2E2，此時感官得分最高。因此最終選擇工藝方案為A2B1C1D2E2進(jìn)行發(fā)酵。

表4 正交實驗結(jié)果及極差分析

注：發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間48 h，初始pH值為4.5

2.3 HPLC測定環(huán)磷酸腺苷含量結(jié)果

環(huán)磷酸腺苷是棗中最具代表性的功能性成分，發(fā)酵過程中環(huán)磷酸腺苷含量無顯著變化，棗清汁發(fā)酵前含量為25.3 μg/mL，發(fā)酵后含量為21.4 μg/mL。說明本工藝較好保留了棗清汁的環(huán)磷酸腺苷。

2.4 貨架期評定結(jié)果

2.4.1 人體感官評定結(jié)果

由圖4可知，隨著貯藏時間的增加，感官品質(zhì)評分在貯藏21 d內(nèi)接受度較好，無顯著變化(P>0.05)，在貯藏第28天時，感官評分顯著降低(P<0.05)，因此，依據(jù)感官評定結(jié)果，初步預(yù)測貨架期為21 d。

圖4 貨架期感官評定

2.4.2 微生物及理化指標(biāo)的測定結(jié)果

由表5可知，隨著貯藏時間的增加，pH、可溶性固形物含量及還原糖含量在28 d內(nèi)趨于穩(wěn)定，發(fā)酵液的總酸含量在貯藏第21天呈現(xiàn)升高，說明乳酸菌在貨架期間未停止發(fā)酵。

表5 貯藏過程中質(zhì)量指標(biāo)的變化

注：同行數(shù)據(jù)間肩標(biāo)有*表示差異顯著(P<0.05)，無*表示差異不顯著(P>0.05)

結(jié)合圖4 感官評定結(jié)果，貯藏21 d內(nèi)，感官品質(zhì)及接受度較好，且微生物及理化指標(biāo)符合國家輕工業(yè)局推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(QB/T5356—2018果蔬發(fā)酵汁)，因此，進(jìn)一步判定紅棗發(fā)酵飲料的貨架期為21 d。

2.4.3 電子感官技術(shù)評定結(jié)果

2.4.3.1 電子鼻的測定結(jié)果

圖5是紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料香氣成分檢測中18根傳感器響應(yīng)值的變化圖，圖中曲線各代表1種傳感器，從圖5可知，各傳感器響應(yīng)值在初始15 s內(nèi)快速變化(上升或下降)趨勢，到40 s后響應(yīng)值強(qiáng)度逐漸趨于平緩。T、P型傳感器響應(yīng)值大部分在0.6～0.8 之間，能夠?qū)悠返牟町愋悦黠@表現(xiàn)出來。

圖5 傳感器響應(yīng)圖

根據(jù)圖6中傳感器響應(yīng)值繪制成的氣味指紋圖譜測定結(jié)果顯示，PA/2(乙醇、氨水、胺類化合物)、P30/1(碳?xì)浠衔锶紵a(chǎn)物)和P30/2(乙醇、燃燒產(chǎn)物)對紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料香氣響應(yīng)顯著，隨著貨架期的延長，T、P型傳感器響應(yīng)值趨于平穩(wěn)，無明顯差異。說明此貯藏條件可以讓紅棗乳酸菌發(fā)酵飲料中的香氣得到很好保留。

由圖7主成分分析 PCA1 和 PCA2 2個主軸分析結(jié)果上看，PCA第1主成分的貢獻(xiàn)率為63.42%，PCA第2主成分的貢獻(xiàn)率為 19.28%，總累積貢獻(xiàn)率為85%，說明這2組主成分包含了樣品中的絕大部分香氣的信息，且主要是PCA 第1主成分對紅棗發(fā)酵飲料貨架期氣味的區(qū)分作用。未發(fā)酵的紅棗原清汁與發(fā)酵后貯藏0～21 d內(nèi)的樣品在主成分坐標(biāo)的各區(qū)域分布較遠(yuǎn)，說明樣品間氣味區(qū)別明顯。在貯藏28 d時，主成分坐標(biāo)的不同區(qū)域界限清晰，分離較遠(yuǎn)，說明產(chǎn)品經(jīng)過28 d貯藏后氣味發(fā)生了較大變化。此結(jié)果與感官評定及微生物、理化指標(biāo)測定結(jié)果相互印證，因此，電子鼻可用于判定紅棗發(fā)酵飲料的貨架期。

圖6 貨架期氣味指紋圖譜

圖7 氣味的PCA分析圖

2.4.3.2 電子舌的測定結(jié)果

根據(jù)圖8可知，棗汁發(fā)酵后酸味顯著增加，鮮味顯著降低，其他口感變化相對不明顯。推測原因是乳酸菌在發(fā)酵過程中消耗了糖類物質(zhì)產(chǎn)生大量乳酸所導(dǎo)致。此外，推測乳酸菌在發(fā)酵過程中消耗了紅棗中部分無機(jī)鹽，使其鮮味明顯降低。其次，在21 d貯藏時間內(nèi)，味覺各項指標(biāo)未發(fā)生顯著變化；在貯藏至28 d時，紅棗發(fā)酵飲料酸味顯著增加，與感官評定結(jié)果基本一致。因此，電子舌可用于評定發(fā)酵紅棗飲料貨架期[13]。

圖8 貨架期味覺的指紋圖譜

2.4.3.3 色差儀對顏色的測定結(jié)果

貯藏過程中顏色變化如圖9所示，在28 d貯藏期內(nèi)，紅棗發(fā)酵飲料的L*值、a*值、b*值無顯著變化(P>0.05)，說明此貯藏條件下，紅棗發(fā)酵飲料的顏色穩(wěn)定性較好。

圖9 貯藏過程中顏色的變化

3 結(jié)果與討論

本研究以清澗紅棗為主要原料，制備紅棗棗清汁，進(jìn)行干酪乳酸菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌3種菌種復(fù)配發(fā)酵，通過發(fā)酵時間、初始可溶性固形物含量和菌種添加量單因素試驗和正交試驗，確定按干酪乳桿菌∶植物乳桿菌∶鼠李糖乳桿菌=6∶1∶1的比例復(fù)配發(fā)酵，接菌量為0.01%(m/m)，37 ℃發(fā)酵48 h為宜。在此條件下產(chǎn)品風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、乳酸菌含量高，為市場活菌型飲料產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

結(jié)合感官評定、微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)電子感官技術(shù)對貨架期內(nèi)品質(zhì)進(jìn)行評定。結(jié)果表明，在21 d內(nèi)其感官評分較高，接受度較好，符合標(biāo)準(zhǔn)(QB/T5356—2018果蔬發(fā)酵汁)。