低溫微萃取-GCMS/MS聯(lián)用技術(shù)檢測食用油中20種持久性污染物

劉笑笑，張菁菁, 李晨曦，吳福祥，姬良亮，丁輝, 彭濤

(蘭州市食品藥品檢驗所, 甘肅 蘭州，740050)

多環(huán)芳烴(polycylic aromatic hydrocarbon, PAHs)和塑化劑(plasticizer PAEs)屬于持久性環(huán)境有機污染物，具有高毒性、易遷移性、穩(wěn)定性和生物累積性等特點[1-2]，大量存在于水、土壤、蔬菜以及動物組織中。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且很難被生物降解[3]，易被人體吸收產(chǎn)生巨大危害，可通過食物鏈放大逐級傳遞[4]。膳食暴露是PAEs，PAHs這些持久性污染物進入人體的主要途徑[5-7]，食品中持久性污染物殘留問題已受到國際社會廣泛的關(guān)注。食用油是這些持久性污染物PAHs，PAEs通過飲食進入人體的主要途徑之一[8-11], PAHs，PAEs含量水平成為評價食用油質(zhì)量安全的重要指標(biāo)[12-16]。因此，研究PAE及PAH的高效檢測方法，對更為全面地監(jiān)測和評價食用油污染狀況[17-19]，保證食用油質(zhì)量安全具有重要意義。

目前PAHs較多采用液相色譜法(HPLC)和氣相質(zhì)譜法(GC-MS)[20]，該方法時間較長，干擾較大。PAEs較多采用GC-MS法，該方法對部分復(fù)雜樣品干擾較大，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢驗標(biāo)準(zhǔn)相對單一、低效、滯后[21-22]。相較于傳統(tǒng)方法，GC-MS/MS具有較高靈敏度和分辨率，能夠更有效地消除其他雜質(zhì)的干擾，提高離子選擇性和準(zhǔn)確性[12]，并降低了檢測限度。多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring, MRM)為食用油中微量持久性污染物的檢測提供新的有效手段[23]。由于食用油樣品基質(zhì)干擾復(fù)雜，建立快速有效檢測植物油中持久性污染物PAEs和PAHs的技術(shù)很有必要。本研究使用低溫除脂微萃取技術(shù)，結(jié)合GC-MS/MS的高靈敏、高選擇性，建立了檢測食用植物油中PAHs和PAEs的新方法，并進行了實際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：6種PAEs對照品,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司:鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)99.5%、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)99.5%、鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)99.5%、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)99.4%、鄰苯二甲酸二戊酯(di-N-pentyl phthalate,DPP)99.0%、鄰苯二甲酸二己酯(di-n-hexyl phthalate,DHXP)99.5%。14種PAHs標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司: 萘(naphthalene，NAP)(2 000±20.39)mg/L,99.9%；苊烯(acenaphthylene,ANY)(2 000±7.22) mg/L,99.7%；蒽(anthracene，ANT)(2 004±20.44)mg/L,99.2%；熒蒽(fluoranthene，F(xiàn)LT)(1 999±4.48) mg/L,99.2%；菲(phenanthrene，PHE)(2 000±4.48)mg/L,99.5%；芴(fluorene，F(xiàn)LU)(2 003±10.79)mg/L,99%；苊(acenaphthene，ANA)(2 001±10.78) mg/L,99%；芘(pyrene，PYR)(2 001±4.49) mg/L,98.4%；苯并(a)蒽(benzo(a)anthracene，BaA)(2 002±20.42) mg/L,99%；(chrysene，CHR)(2 002±20.42) mg/L,98%；苯并(b)熒蒽(benzo[b] fluoranthene，BbFA)(2 000±4.48)mg/L,99.8%；苯并(k)熒蒽(benzo[k] fluoranthene，BkFA)(2 000±4.48)mg/L,99.3%；苯并(a)芘(benzo[a] pyrene，BaP)(1 998±4.48) mg/L,99.5%，二苯并(h)蒽(dibenz[a,h] anthracene，DhA)(2 001±10.78) mg/L,99.5%。

試劑：乙腈、正己烷、石油醚、甲醇、二氯甲烷(色譜純),默克公司；8000D氣相色譜-質(zhì)譜儀，安捷倫公司；ME403分析天平，梅特勒托萊多公司；GENIUS3渦旋混合儀，德國IKA公司；GVA50A氮吹儀，北京普立泰科儀器有限公司；0.1～10 mL移液槍，德國Eppendorf公司；B-400均質(zhì)儀，瑞士BUCHI公司。

1.1.2 儀器

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g食用油樣品，置于20 mL比色管中, 丙酮作為分散劑，加入10 mLV(二氯甲烷)∶V(丙酮)=1∶1溶劑，于渦旋混合器上旋渦提取(2 000 r/min)0.5 min，再超聲萃取8 min，10 000 r/min離心5 min，使溶液充分分層后，置于-20 ℃冷凍除脂60 min，將上層清液倒入氮吹管中，低溫氮吹至干，準(zhǔn)確加入二氯甲烷2 mL，渦旋5 s，轉(zhuǎn)移至進樣瓶中，上機檢測。試劑空白樣，除不加樣品外，其他操作相同。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜檢測

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱：DB-5MS 毛細管柱(Agilent19091S-433UI,30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣純度高于99.999%的高純氮氣，流速1.0 mL/min;進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，進樣體積為1μL;升溫程序：初始柱溫70 ℃，保持2 min，以 25 ℃/min 升溫至150 ℃，保持1 min， 再以3 ℃/min 升溫至200 ℃，保持1 min，以8 ℃/min 升溫至280 ℃，保持10 min。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源：電離能量70 eV，離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲5 min,燈絲電流100 μA，MRM多反應(yīng)檢測模式，其具體參數(shù)見表1。

表1 多重反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的建立

2.1.1 分散劑的選擇

考察了丙酮、乙腈、乙醇和甲醇4種分散劑對目標(biāo)物萃取效率的影響。結(jié)果表明,除了萘在乙醇作分散劑時萃取效率略微比丙酮高之外，其余19種污染物均在丙酮做分散劑時萃取效率最高，故選擇丙酮作為分散劑。

2.1.2 萃取劑的選擇

本文選用10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行加標(biāo)實驗，分別選用3種不同體系V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=1∶1、V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1、V(乙腈)∶V(丙酮)=1∶1多環(huán)芳烴萃取劑進行加速溶劑萃取試驗，如圖1所示，不同提取液提取效率不盡相同，總體呈現(xiàn)出二環(huán)、五環(huán)和六環(huán)的PAHs提取效率較低，三環(huán)和四環(huán)的 PAHs提取效率較高。其中，二氯甲烷-丙酮萃取平均回收率是82.1%～101%，對20種污染物均能達到較為滿意的萃取率，正己烷-丙酮和乙腈-丙酮萃取平均回收率分別為64.5%～88.3%、53.8%～85.6%，DMP、ANY、DEP、BkFA和BaP的回收率較低，平均萃取效果不如二氯甲烷-丙酮，綜合考慮各個目標(biāo)物定量的準(zhǔn)確性，試驗確定V(二氯甲烷)∶V(丙酮)=1∶1混合溶劑(下簡稱二氯甲烷-丙酮溶劑)作為樣品的萃取劑。

1-NAP;2-DMP;3-ANY;4-ANA;5-DEP;6-FLU;7-PHE;8-ANT;9-DIBP;10-DBP;11-FLT;12-PYR;13-DPP;14-DHXP;15-BaA;16-CHR;17-BbFA;18-BkFA;19-BaP;20-DhA

2.1.3 萃取方式的選擇

稱取1 g待測樣，加入2、5、10、12、15 mL二氯甲烷-丙酮萃取溶劑，渦旋分散30 s，再超聲1、2、5、8、15 min后提取，考察萃取劑體積和超聲萃取時間對萃取率的影響，結(jié)果如圖2所示，萃取溶劑加入量10 mL，渦旋分散30 s，再超聲萃取8 min為最佳萃取方式。

圖2 不同萃取方式對提取效果的影響

2.1.4 冷凍時間的優(yōu)化

稱取1 g待測樣，加入10 mL二氯甲烷-丙酮溶劑，渦旋分散30 s再超聲萃取8 min后，分別選擇溫度為-4、-10、-15、-20、-25 ℃，分別放置10、30、60、90、120、150、200 min冷凍除脂，考察冷凍溫度和冷凍時間對除脂凈化的影響，結(jié)果如圖3所示，-20 ℃冷凍除脂60 min為最佳冷凍條件。冷凍后，上層提取液可方便地傾入雞心瓶中，實現(xiàn)與油脂充分分離。

圖3 冷凍脫脂時間的優(yōu)化

2.1.5 反萃取劑的選擇及用量

稱取1 g待測樣，加入10 mL二氯甲烷-丙酮溶劑，渦旋分散30 s再超聲萃取8 min，高速離心等溶液分層后，置于-20 ℃冷凍除脂60 min，考慮反萃取效果，將低溫脫脂的溶劑蒸干，選擇40°水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時，當(dāng)旋蒸至近干時， NAP損失較為嚴重， ANY、ANA也有一定的損失，因此，選用低溫氮氣吹干，可有效避免上述損失。選擇常用的乙腈、甲醇、二氯甲烷、正己烷作為反萃取劑，加入量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，比較其回收率，結(jié)果如圖4所示，最終選擇用2 mL二氯甲烷對其進行反萃取。

圖4 反萃取劑的選擇

2.2 GC-MS/MS檢測技術(shù)的建立

2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以全掃的方式對20種目標(biāo)物進行掃描，獲得其總離子流圖，根據(jù)質(zhì)譜圖，選擇分子量較大，豐度較高且干擾較少的碎片作為特征離子，見圖5。

1-NAP;2-DMP;3-ANY;4-ANA;5-DEP;6-FLU;7-PHE;8-ANT;9-DIBP;10-DBP;11-FLT;12-PYR;13-DPP;14-DHXP;15-BaA;16-CHR;17-BbFA;18-BkFA;19-BaP;20-DhA

2.2.2 線性范圍與檢出限

由于持久性污染物在大自然界中普遍存在且不容易降解，在空白溶液中均有檢出，本實驗采取扣除空白樣品的方法，以消除試劑本底對檢測結(jié)果的影響，實驗發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對目標(biāo)分析物的基質(zhì)效應(yīng)既有增強也有抑制，因此采取基質(zhì)配標(biāo)來降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，以提高定性、定量的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

表2 植物油中20種PAEs和PAHs的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

續(xù)表2

序號化合物線性方程相關(guān)系數(shù)LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)6芴(FLU)Y=173 537X0.997 30.430.947菲(PHE)Y=231 534X0.996 70.460.768蒽(ANT)Y=352 436X0.995 80.500.939鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)Y=54 739.3X0.997 21.764.8910鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)Y=53 728.1X0.998 21.514.3311熒蒽(FLT)Y=32 483.4X0.998 90.411.2112芘(PYR)Y=635 849X0.995 80.441.0013鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)Y=264 748X0.998 31.364.2314鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)Y=87 629.7X0.995 91.584.5415苯并(a)蒽(BaA)Y=638 291X0.996 10.350.9116(CHR)Y=183 947X0.997 30.250.7617苯并(b)熒蒽(BbFA)Y=201 867X0.997 10.280.8718苯并(k)熒蒽(BkFA)Y=83 693.4X0.996 20.461.0219苯并(a)芘(BaP)Y=377 890X0.996 90.491.1820二苯并(h)蒽(DhA)Y=28 492.3X0.997 80.380.87

2.2.3 提取凈化方法的驗證

選取空白的植物油樣本，分別添加10、20、30 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按照前處理方法進行加標(biāo)回收和精密度試驗，結(jié)果如表3所示：平均回收率為51.34%～116.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)為0.9%～12.1%。結(jié)果表明，20種待測化合物加標(biāo)回收率均在70%～120%。

表3 20種多環(huán)芳烴和增塑劑的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5) 單位：%

2.4 食用油實際樣品檢測

應(yīng)用本方法檢測了市售8種食用油，每個樣品重復(fù)檢測2次，從表4可以看出，不同種類、不同生產(chǎn)日期、不同包裝的食用油都檢出PAEs和PAHs。8個油樣中全部檢出DBP和BaP，其含量分別在3.3～106.7 μg/kg和0.4～5.6 μg/kg。6個油樣中檢出DMP，其含量為39.3～265.1 μg/kg。所有油樣中沒有檢測出ANY，對照GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》油脂中BaP規(guī)定限量為5 μg/kg，GB 9685—2008 中規(guī)定DBP≤0.3 mg/kg，本實驗所測定的8種食用油中BaP超標(biāo)率12.5%，DBP超標(biāo)率為0，其他能檢測出的PAEs和PAHs在國家限量標(biāo)準(zhǔn)中并未列出，而歐盟委員會835/2011號文件規(guī)定油脂中BaP的最高殘留限量值為2 μg/kg，4種PAHs(BaA、CHR、BFA、BaP)之和的限量為10 μg/kg。歐盟“食品接觸塑料材料和制品法規(guī)”中規(guī)定了DBP含量≤0.05%。幾乎每種食用油中均有不同程度的PAEs和PAHs檢出，這可能與食用油包裝材質(zhì)中污染物遷移有關(guān)，也可能與油脂生產(chǎn)中所用加工助劑以及設(shè)備和管件材質(zhì)有關(guān)。

表4 不同食用油中塑化劑和多環(huán)芳烴含量的檢測結(jié)果 單位：μg/kg

注：ND為未檢出，NQ為定量限

3 結(jié)論

建立了快速測定植物油中6種鄰苯二甲酸酯(PAEs)和14種多環(huán)芳烴(PAHs)的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)分析方法。20種目標(biāo)物在5～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995，方法定量下限為1.0 μg/kg。在10、20、30 μg/kg 3個加標(biāo)水平下的平均回收率為51.34%～116.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～12.1%。說明該技術(shù)適用于20種PAHs和PAHs的檢驗前處理，方法簡便、快捷、準(zhǔn)確，可用于植物油中增塑劑和多環(huán)芳烴殘留的檢測，為植物油的質(zhì)量控制和安全評價提供了保證。對實際樣品進行檢測，均檢出PAEs和PAHs，對照國內(nèi)限量BaP超標(biāo)率12.5%。不合格率遠低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)，國家限量標(biāo)準(zhǔn)有待完善。