超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜快速篩查中成藥、保健品中26種非法添加化合物

王雨晴，王雨辰，陳亮，周明，王越群，谷瑞增，冀峰，鄭鋅*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015) 2(島津企業(yè)管理(中國)有限公司，北京，100020)

對保健食品中非法添加物的檢測，已經(jīng)從單一化合物檢測，逐步發(fā)展為多種功效成分同時定性定量分析，并且涉及的非法添加化合物的品種呈遞增趨勢。與低分辨的三重四極桿質(zhì)譜不同，高分辨飛行時間質(zhì)譜能夠獲得高分辨率的一級質(zhì)譜信息，以及特征的二級質(zhì)譜圖，目標(biāo)化合物數(shù)量不受限制。利用二級質(zhì)譜信息建立私人數(shù)據(jù)庫，擴(kuò)展性強，無需標(biāo)準(zhǔn)品即可實現(xiàn)對多種未知非法添加物的篩查。此外，高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)還可進(jìn)行回溯研究，實現(xiàn)樣品一針進(jìn)樣，樣品信息全部記錄，后期可依據(jù)不同數(shù)據(jù)庫篩選更多目標(biāo)物質(zhì)。

常見的化學(xué)添加物主要有二甲雙胍類降糖藥、胰島素增敏劑、那非類藥物等[1-3]。國家市場監(jiān)督管理總局(原食品藥品監(jiān)督管理局)發(fā)布的《保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測》[2017年第138號][4]、《食品中那非類物質(zhì)的測定》[2018年第14號][5]等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及補充檢驗方法，覆蓋了市面上主要的非法添加藥物種類。對于中成藥、保健品中的非法添加藥物的定性檢測，已有相關(guān)的文獻(xiàn)報道[6-9]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種主流的檢測手段[10-11]，此外，液相色譜法、核磁[12-13]、氣質(zhì)聯(lián)用法[14]等也被廣泛用于非法添加物的定性分析。但是，以上方法需要大量的標(biāo)準(zhǔn)品、或者制備出純度較高的樣品，分析成本高、研究延續(xù)性不強，無法應(yīng)對日益增加的非法添加品種。也有研究采用液相色譜-高分辨質(zhì)譜法對保健品中的非法添加物進(jìn)行分析[15-19]。于泓等[19]建立了食品中多種那非類化合物的高分辨質(zhì)譜定性方法，但靈敏度低、沒有建立二級質(zhì)譜庫，方法通用性不強。依據(jù)未知峰的高分辨質(zhì)荷比及同位素豐度比，可獲得化合物元素組成信息。對于未知化合物結(jié)構(gòu)信息，可根據(jù)其二級質(zhì)譜進(jìn)一步判斷或進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。常見的公共數(shù)據(jù)庫，如Chemspider，包含多達(dá)7 000余種化合物的分子式、結(jié)構(gòu)等信息，分子式檢索結(jié)果多，命中率低，無法借助二級質(zhì)譜信息縮小篩選范圍。因此，自建二級質(zhì)譜圖庫，可有效應(yīng)對同類化合物、同樣前處理方式的指定范圍的篩查，尤其適用于非法添加的定性分析。

本文基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種高通量定性檢測26種降糖或抗疲勞藥物非法添加物的方法，創(chuàng)建了相應(yīng)的二級質(zhì)譜庫。并將該方法應(yīng)用于保健品的快速篩查，方法學(xué)指標(biāo)滿足相關(guān)法規(guī)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈，均為色譜純，德國MERCK公司；甲酸(色譜純)，天津Dikma公司；乙酸銨(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；超純水(18.2 MΩ·cm)，法國Millipore制水機(jī)制備。

鹽酸丁二胍、鹽酸苯乙雙胍、馬來酸羅格列酮、鹽酸吡格列酮、格列吡嗪、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、格列齊特、格列波脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮，美國Sigma-Aldrich公司，純度均>95%；去甲基卡波地那非、鹽酸伐地那非、那紅地那非、紅地那非、枸櫞酸羥基豪莫西地那非、枸櫞酸西地那非、豪莫西地那非、丙氧基艾地那非、氨基他達(dá)那非、羥丙基去甲基他達(dá)那非、N-乙基他達(dá)那非、偽伐地那非、那末西地那非、N-去甲基西地那非，德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度均>95%。

1.2 儀器與設(shè)備

Nexera超高效液相色譜儀系統(tǒng)—LCMS-9030四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(配備ESI電離源和LabSolutions Ver 5.96色譜工作站)，日本島津公司；渦旋混合儀，美國VORTEX GENIE公司；Beckman 高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取26種對照品約10.0 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成0.289 9～1.254 6 mg/mL的單標(biāo)貯備液。以乙腈為溶劑，將26種單標(biāo)貯備液稀釋為1 000倍，即得0.289 9～1.254 6 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用乙腈逐級稀釋，系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度分別為L1(0.002 3～0.009 8 mg/L)、L2(0.004 5～0.019 6 mg/L)、L3(0.009 1～0.039 2 mg/L)、L4(0.018 1～0.078 4 mg/L)、L5(0.036 2～0.156 8 mg/L)、L6(0.072 5～0.313 7 mg/L)、L7(0.145 0～0.627 3 mg/L)和L8(0.289 9～1.254 6 mg/L)。

1.3.2 前處理方法

稱取0.1 g保健品(片劑研磨粉碎)，用1 mL超純水溶解，振搖1 min，靜置10 min，加入4 mL乙腈，超聲10 min，12 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.3.3 液相色譜—質(zhì)譜條件

色譜條件：流動相：A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液；流速0.4 mL/min；色譜柱：Phenomenex Kinetex C18(2.1 mm I.D. ×100 mm L, 2.6 μm)；柱溫40℃；洗脫方式為梯度洗脫，B相初始濃度為10%(0～0.3 min)，40%～95%(4.0～5.5 min)，95%(7.5 min)，10%(7.6～10 min)，進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI(+)；接口電壓4.5 kV；霧化氣3.0 L/min；加熱氣流量10.0 L/min；干燥氣流量10.0 L/min；接口溫度300 ℃；DL管溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；校準(zhǔn)方法：外標(biāo)法校準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)(調(diào)諧液為NaI,質(zhì)量濃度400 mg/L)，分辨率>30 000，質(zhì)量誤差<2×10-6；掃描模式：MS全掃描m/z100～600、MS/MS(DDA)采集m/z50～600。

1.3.4 線性范圍及檢出限、定量限的確定

對系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，以一級提取離子流色譜圖峰面積(Y)對濃度(X)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用LabSolutions軟件進(jìn)行線性擬合，記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程及線性相關(guān)系數(shù)。以信噪比S/N=3、S/N=10分別計算方法的檢出限、定量限。依據(jù)測定結(jié)果確定線性范圍。

1.3.5 準(zhǔn)確度和精密度試驗

以標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度L6(0.072 5～0.313 7 mg/L)點連續(xù)分析6次，考察儀器條件的重復(fù)性，并記錄保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations, RSD)。

以阿卡波糖片為空白樣品，添加適量的單標(biāo)貯備液，配制成濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線L5(0.036 2～0.156 8 mg/L)和L7(0.145 0～0.627 3 mg/L)相同的加標(biāo)樣品，按照1.3.2制備，每個樣品平行6份。標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算空白添加樣品的濃度，并以此計算加標(biāo)回收率及精密度。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫的建立

在上述色譜分離條件下對26種非法添加化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，獲得26種化合物的保留時間、精確分子質(zhì)量以及離子化方式。采集不同碰撞能量(10、20、30、40和50 V)下的目標(biāo)化合物的二級質(zhì)譜圖，在ACD Labs/2012軟件中輸入每種化合物的名稱、分子式、CAS號、精確相對分子質(zhì)量和保留時間以及二級質(zhì)譜圖，建立二級質(zhì)譜庫，用于未知物二級質(zhì)譜圖相似度評分。

1.3.7 方法的實際應(yīng)用

選用市售3份保健品或中成藥，其樣品前處理和檢測方法參照1.3.2和1.3.3，以此評價該方法的實際應(yīng)用效果。

利用本文建立的前處理和色譜、質(zhì)譜條件，對3份市售的保健品及中成藥(保健品2份，中成藥1份)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析

根據(jù)待測化合物的結(jié)構(gòu)特征，選擇正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。格列苯脲等26種非法添加化合物均能形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。26種化合物的分子式、精確質(zhì)荷比等信息如表1所示，其中偽伐地那非與那末西地那非互為同分異構(gòu)體，經(jīng)過單標(biāo)確認(rèn)，偽伐地那非、那末西地那非保留時間分別為5.52、5.98 min，可實現(xiàn)色譜基線分離。鹽酸伐地那非在溶液中呈現(xiàn)離子狀態(tài)，脫掉了鹽酸基團(tuán)，與豪莫西地那非互為同分異構(gòu)體，一級精確質(zhì)荷比均為489.227 85，伐地那非和豪莫西地那非保留時間分別為3.46 min和4.05 min，實現(xiàn)了完全的基線分離。通過精確分子量軟件計算26種目標(biāo)化合物的理論[M+H]+峰，實測質(zhì)荷比與理論值的偏差均小于2×10-6，優(yōu)于定性的一般要求(<5×10-6)。26種目標(biāo)化合物的一級提取離子流圖(extracted ion chromatogram,XIC)如圖1所示，26種降糖或抗疲勞類化合物分離度良好，通道無干擾。

表1 26種非法添加化合物保留時間、理論質(zhì)量數(shù)、實測質(zhì)量數(shù)和質(zhì)量數(shù)偏差

1-鹽酸丁二胍;2-鹽酸苯乙雙胍;3-馬來酸羅格列酮;4-去甲基卡波地那非;5-鹽酸伐地那非;6-鹽酸吡格列酮;7-那紅地那非;8-紅地那非;9-枸櫞酸羥基豪莫西地那非;10-枸櫞酸西地那非;11-豪莫西地那非;12-丙氧基艾地那非;13-氨基他達(dá)那非;14-羥丙基去甲基他達(dá)那非;15-格列吡嗪;16-甲苯磺丁脲;17-瑞格列奈;18-N-乙基他達(dá)那非；19-偽伐地那非；20-格列齊特；21-格列波脲；22-格列本脲；23-格列美脲；24-那末西地那非；25-格列喹酮；26-N-去甲基西地那非

通過以上條件的確認(rèn)，建立了26種非法添加化合物的定性方法。Formula Predictor分子式預(yù)測軟件可以實現(xiàn)基于一級精確質(zhì)荷比、同位素豐度比的匹配定性，得分在70分以上，可以判定為疑似非法添加物。以格列喹酮為例，設(shè)定Formula Predictor軟件的誤差范圍為5×10-6，元素組成為C、H、O、N、S以及元素數(shù)量分別為300、150、12、12、1，加和模式為[M+H]+。結(jié)果顯示，C27H33N3O6S評分第一，匹配得分95.60，與格列喹酮的元素組成一致。圖2為格列喹酮的XIC圖。

圖2 格列喹酮一級提取離子流圖

按照“1.3.6數(shù)據(jù)庫的建立”項下的條件，建立26種化合物的二級質(zhì)譜圖庫。將樣品的碎片離子信息與二級質(zhì)譜圖庫中的碎片離子信息進(jìn)行匹配，ACD Labs/2012軟件根據(jù)匹配結(jié)果，給出相似度得分。通常，二級匹配得分大于60的非法添加物可判定為目標(biāo)物。圖3為格列喹酮的二級質(zhì)譜匹配結(jié)果，樣品主要的特征碎片與譜庫中二級質(zhì)譜圖匹配良好，格列喹酮二級匹配得分為70.38。因此，可以確定樣品中含有格列喹酮。根據(jù)歐盟SANTE/11945/2015指導(dǎo)文件[20]，當(dāng)使用高分辨質(zhì)譜時，每個離子可以獲得2個定性得分。本實驗通過全掃描+數(shù)據(jù)依賴碎片掃描模式獲得了一級的精確質(zhì)荷比和豐富的二級碎片離子信息，格列喹酮二級質(zhì)譜有16個定性得分，可實現(xiàn)精準(zhǔn)確證。

a-樣品二級質(zhì)譜；b-二級質(zhì)譜庫格列喹酮

2.2 線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

本試驗采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，26種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限見表2。

表2 26種非法添加化合物的校準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

在各自線性范圍內(nèi)，26種目標(biāo)化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均達(dá)到0.99以上，檢出限為0.000 1～0.010 9 mg/L，定量限為0.000 1～0.036 1 mg/L。

2.3 重復(fù)性實驗

標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度L6(0.072 5～0.313 7 mg/L)點按照1.3.3條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示，面積的RSD小于5%(表3)，除了二甲雙胍類降糖藥保留較弱，出現(xiàn)了一些保留時間漂移，其余化合物保留時間的RSD均小于1.6%。

表3 26種非法添加化合物的保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4 回收率及精密度實驗

將不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)液添加至阿卡波糖片中，制備不同添加濃度的樣品，采用UHPLC-Q-TOF-MS法檢測樣品中26種目標(biāo)物的回收率及RSD，每個濃度平行測定6次。結(jié)果顯示，26種目標(biāo)物的回收率為75.8%～128.4%之間，6份平行樣品濃度的RSD均小于4%，具體結(jié)果見表4。

2.5 方法的實際應(yīng)用

為證實本方法的實際應(yīng)用價值，選用3份樣品為研究對象，其中2份陰性對照和1份陽性對照作為本試驗的質(zhì)量控制樣品。試驗結(jié)果(圖4)表明，陽性樣品中m/z475.2122通道色譜峰保留時間為3.979 min，初步判斷含有西地那非。二級質(zhì)譜庫檢索，與西地那非相似度得分77.13，匹配度較高，說明該陽性對照檢出西地那非。

表4 空白加標(biāo)的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖4 m/z為475.212 2的樣品提取離子流圖

3 結(jié)論

本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，建立了26種降糖及抗疲勞藥物的篩查方法。結(jié)果表明，26種降糖或抗疲勞類化合物分離度良好，通道無干擾。在各自線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均達(dá)到0.99以上，檢出限為0.000 1～0.010 9 mg/L，定量限為0.000 1～0.036 1 mg/L?；厥章蕿?5.8%～128.4%之間，6份平行樣品濃度的RSD均小于4%，確認(rèn)了目標(biāo)化合物一級精確質(zhì)荷比、保留時間、同位素豐度比等信息，建立了二級譜庫，并應(yīng)用于實際樣品的分析。該方法回收率高、精密度良好、準(zhǔn)確度高，可以滿足降糖和抗疲勞類中成藥和保健食品的非法添加物的篩查。本方法對于中成藥和保健食品的質(zhì)量安全控制具有重要意義。