響應面法優(yōu)化中性蛋白酶酶解海灣扇貝副產(chǎn)物制備抗氧化酶解物研究

胡 昂，段 蕊，劉志東，林 娜，張俊杰，李 磊，蔣 玫

（1.淮海工學院海洋生命與水產(chǎn)學院，江蘇連云港 222005；2.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

我國是扇貝養(yǎng)殖大國，2018年扇貝產(chǎn)量達到2.00×106t［1］。扇貝主要由扇貝殼、閉殼肌、外套膜、消化腺、鰓等部分組成［2］。目前，扇貝的主要食用部位為貝柱等，占扇貝總重較大的外套膜、消化腺等加工副產(chǎn)物因成分復雜、加工利用難度大等原因多作為廢棄物處理。PADRAIGIN等［3］研究表明，扇貝加工副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)等可利用物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抑菌、降血壓等生物學功能。因此，扇貝加工副產(chǎn)物蛋白具有廣闊的開發(fā)利用潛力。由于資源量巨大，海灣扇貝（Argopectenirradias）產(chǎn)業(yè)每年產(chǎn)生的扇貝加工副產(chǎn)物蛋白不僅造成了優(yōu)質(zhì)生物資源的浪費，還產(chǎn)生了環(huán)境污染問題。因此，扇貝加工副產(chǎn)物蛋白的深度開發(fā)利用已經(jīng)成為扇貝產(chǎn)業(yè)亟需解決的主要問題之一。

正常情況下，人體的氧化-還原處于動態(tài)平衡狀態(tài)；當人體處于應激和疾病狀態(tài)時，這種氧化-還原平衡即被打破，人體表現(xiàn)出應激或者疾病狀態(tài)。因此，氧化應激已經(jīng)成為醫(yī)學等領(lǐng)域研究的熱點之一，進而帶動了抗氧化物質(zhì)的研究熱潮?？寡趸耐ǔＪ侵妇哂?～30個氨基酸殘基、有較強的清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化或螯合過渡金屬離子能力的生物活性肽［4］。此外，抗氧化肽還對由紫外線引起的線粒體損傷和自由基誘導的脂質(zhì)過氧化具有明顯的保護作用［5］。由于人們對人工合成抗氧化肽存在的潛在擔憂，安全性更高的天然來源抗氧化肽受到廣泛關(guān)注。田倩等［6］采用酶解法制備抗氧化肽，并對其進行分離純化，以分離組分的總抗氧化性、DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力為評價指標，研究其在化妝品中的應用效果。邱春江等［7］利用木瓜蛋白酶酶解制備文蛤多肽，以羥自由基清除能力和超氧離子自由基清除能力為評價指標評價了其抗氧化活性。目前，扇貝抗氧化活性肽的評價指標多為單一抗氧化活性指標，選用DPPH自由基清除率和還原能力作為評價指標較少。

本研究基于扇貝加工副產(chǎn)物蛋白年產(chǎn)量大且尚未充分利用、天然來源抗氧化肽應用前景廣泛的背景，以天然來源的海灣扇貝加工副產(chǎn)物為原料，采用中性蛋白酶酶解制備扇貝抗氧化酶解物。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應面實驗優(yōu)化了海灣扇貝抗氧化酶解物的制備條件，并選用DPPH自由基清除率和還原能力兩個指標（DPPH自由基清除率為主要評價指標）評價扇貝酶解物的抗氧化活性，以期為開發(fā)利用扇貝加工副產(chǎn)物蛋白和天然來源抗氧化肽提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用海灣扇貝2017年11月購自上海市楊浦區(qū)東方國際水產(chǎn)中心，中性蛋白酶（100 000 U·g-1）（上海源葉生物科技有限公司），無水乙醇、鹽酸、2 000 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 6.6）、鐵氰化鉀、三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）、三氯化鐵等購自國藥集團，均為分析純及以上。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南鞏義市予華儀器有限責任公司；AL204電子天平，上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C型pH計，上海滬西分析儀器有限公司；721N型可見分光光度計，上海市精密科學儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上海滬西分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 海灣扇貝加工副產(chǎn)物蛋白的提取

參考張莉莉等［8］方法略有改動。將海灣扇貝的貝柱取出，除貝殼外的其他物質(zhì)視為海灣扇貝加工副產(chǎn)物，和95%乙醇分別放置于4℃冰箱預冷3 h以上，將預冷的95%乙醇緩慢倒入原料中，邊加邊攪拌（速度過快會導致共沉淀，局部變性），使物料比達到1∶10。1 mol·mL-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，放入4℃冰箱保存。次日，離心（8 000 r·min-1，10 min），取沉淀，再次加入預冷的95%乙醇，攪拌并加至物料比為1∶2，4℃ 冰箱儲存。再次日，離心 （8 000 r·min-1，10 min），得到的沉淀即為海灣扇貝蛋白，于-20℃冰箱中冷藏待用。

1.3.2 海灣扇貝抗氧化酶解物的制備

海灣扇貝副產(chǎn)物蛋白溶散于蒸餾水，底物濃度為 20 mg·mL-1，攪拌溶解后用 1.0 mmol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，加入中性蛋白酶，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，開始酶解反應。水解過程中維持水解溫度55℃恒定不變。水解完成后放入100℃水浴鍋中水浴5 min滅酶。冷卻至室溫，4℃、10 000 r·min-1離心20 min取上清液，即為海灣扇貝蛋白副產(chǎn)物酶解物［9］。

1.3.3 DPPH自由基清除率的測定

參考劉媛等［10］方法略有改動。采用無水乙醇配制0.2 mmol·L-1DPPH溶液。將配制好的溶液置于避光處保存。樣品稀釋至不同濃度后備用。取樣品及等體積0.2 mmol·L-1DPPH溶液加入同一試管中，搖勻，30 min后以無水乙醇為空白對照測定吸光度Ai，同時測定 0.2 mmol·L-1DPPH溶液與等體積無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及樣品與等體積無水乙醇混合液的吸光度Aj。按下式計算：

式（1）中：Ac為未加樣品DPPH溶液的吸光度；Ai為加樣品DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品在517 nm處波長的吸光度。

1.3.4 還原能力的測定

參考ZHOU等［11］方法略有改動。在試管中分別加入0.5 mL的樣品。同時加入2.5 mL的磷酸緩沖液（0.2 mol·L-1，pH 6.6）和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液，混合后放入50℃水浴20 min，再加入2.5 mL的10%的三氯乙酸溶液，室溫靜置10 min。吸取2.5 mL反應液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL、0.1%三氯化鐵溶液。反應10 min測定700 nm處吸光度，該值越高說明樣品的還原能力越強。以0.1 mg·mL-1的BHA和BHT為陽性對照。按下式計算：

式（2）中：A0為未加樣品DPPH溶液的吸光度。

1.3.5 半清除率的測定（IC50）

抗氧化劑清除能力利用清除DPPH自由基和還原能力的半清除率（IC50值）表示。將樣品液配制成不同濃度溶液（1、2、3、4、5 mg·mL-1），測定其DPPH自由基清除率和還原能力。計算樣品液濃度質(zhì)量，按公式計算出IC50值。溶質(zhì)質(zhì)量所需濃度越低，表明半清除率越高。計算公式如下：

式（3）中：MDPPH表示測定 DPPH清除率消耗DPPH的質(zhì)量；MR表示測定還原能力消耗試劑的質(zhì)量，包括磷酸緩沖液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵；M0表示加入樣品溶液中溶質(zhì)的質(zhì)量。

1.3.6 海灣扇貝抗氧化酶解物制備的條件優(yōu)化

1.3.6.1 單因素實驗

以海灣扇貝加工副產(chǎn)物蛋白為原料，酶解步驟同1.3.2，開展單因素實驗。以DPPH自由基清除率和還原能力為指標，比較酶解溫度、酶解時間、底物濃度以及酶與底物比對海灣扇貝副產(chǎn)物蛋白酶解的影響。酶解溫度影響：在酶與底物比1.2%、底物濃度20 mg·mL-1，酶解4.0 h的條件下，考察不同酶解溫度（40、45、50、55、60℃）對海灣扇貝副產(chǎn)物蛋白酶解效果的影響。酶解時間的影響：在酶與底物比1.2%、底物濃度20 mg·mL-1、酶解溫度55℃條件下，考察不同酶解時間（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）對海灣扇貝副產(chǎn)物蛋白酶解的影響。底物濃度的影響：在酶與底物比1.2%、酶解溫度55℃、酶解4.0 h的條件下，考察不同底物濃度 （14、17、20、25、33 mg·mL-1）對海灣扇貝副產(chǎn)物蛋白酶解的影響。酶與底物比的影響：在底物濃度20 mg·mL-1、酶解溫度55℃、酶解4.0 h的條件下，考察不同酶與底物比（6.0、7.0、8.0、9.0）對海灣扇貝副產(chǎn)物蛋白酶解的影響［12］。

1.3.6.2 響應面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，采用三因素三水平響應面方法優(yōu)化酶解過程中重要參數(shù)。響應面優(yōu)化實驗選取酶與底物比、酶解時間、酶解溫度3個因素，選取-1、0、1代表自變量的3個水平，以酶解物的DPPH自由基清除率和還原能力建立響應面優(yōu)化模型，共進行17組實驗，其中12組為析因點，5組為區(qū)域中心點用于估算誤差，每個實驗重復3次。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2013、Origin 8.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果以“平均值±標準差”表示；Design Expert 8.0.6進行響應面優(yōu)化實驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 海灣扇貝抗氧化酶解物制備的單因素實驗

2.1.1 酶解溫度對海灣扇貝抗氧化酶解物制備的影響

不同酶解溫度對海灣扇貝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率和還原能力的影響如圖1所示。隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當酶解溫度低于55℃時，DPPH自由基清除率隨溫度升高逐漸上升，超過55℃時DPPH自由基清除率明顯下降。這是因為一方面升高溫度促使反應體系內(nèi)的物質(zhì)運動加快，從而提高底物與酶的接觸機會，加速反應進程；另一方面，過高的反應溫度使維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鏈斷開，導致酶活性降低，從而降低了酶解進程。酶解產(chǎn)物的抗氧化活性表明，與其他溫度相比，溫度為45℃和50℃時，酶解產(chǎn)物對抗氧化酶解物活性相對較低［13］，造成這一現(xiàn)象可能的原因：在這兩個溫度條件下酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)被破壞，酶解成氨基酸或其他小分子肽，導致抗氧化基團含量下降，所以酶解產(chǎn)物的還原能力降低。其他溫度條件下，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率在65%～75%之間，其還原能力也較接近。結(jié)果表明，在一定溫度下，酶解產(chǎn)物具有合適且穩(wěn)定的肽段長度和氨基酸比例，從而表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。不同酶解溫度的還原能力也不同，還原能力隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。綜合考慮酶解溫度對DPPH自由基清除率和還原能力的影響，確定酶解溫度為55℃。

2.1.2 酶解時間對海灣扇貝抗氧化酶解物制備的影響

不同酶解時間對海灣扇貝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率和還原能力的影響如圖2所示。酶解3.0 h和5.0 h的酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率最低；酶解3.0～3.5 h時，酶解產(chǎn)物對DPPH清除率無顯著差異；當酶解時間為4.0 h時，酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率達到最大；之后隨著酶解時間的增加，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率明顯下降。這可能是由于酶解產(chǎn)物中的抗氧化酶解物隨著酶解時間的延長，被降解成抗氧化活性較低的短肽或游離氨基酸，因此導致酶解液的抗氧化活性降低。酶解3.0 h和4.5 h的酶解產(chǎn)物還原能力最低。綜合考慮酶解時間對DPPH清除率和還原能力的影響，確定酶解時間為4.0 h。

2.1.3 底物濃度對海灣扇貝抗氧化酶解物制備的影響

不同底物濃度對海灣扇貝抗氧化酶解物DPPH自由基清除率和還原能力的影響如圖3所示。底物濃度在14～20 mg·mL-1之間，DPPH自由基清除率隨底物濃度升高而上升；在20 mg·mL-1時，DPPH自由基清除率達到最高。這是因為，隨著底物濃度的增加，酶與底物的接觸幾率增大，水解速率提高，產(chǎn)生的肽含量相應增加，從而導致DPPH自由基清除率提高。在25～33 mg·mL-1之間，海灣扇貝抗氧化酶解物對DPPH自由基清除率和還原能力的影響趨于穩(wěn)定。這是因為，隨著海灣扇貝蛋白含量的進一步增加，蛋白酶相對含量逐漸降低，酶解反應進程減慢，進而對酶解液的抗氧化活性無顯著影響，因此，在后續(xù)的優(yōu)化實驗中沒有將其作為主要影響因素考慮。在濃度為20 mg·mL-1時，DPPH自由基清除率最高為67.87%，還原能力趨于平緩，以DPPH自由基清除率為主要指標，選擇濃度為20 mg·mL-1為宜。

圖1 酶解溫度對DPPH自由基清除率和還原能力的影響Fig.1 Effects of hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

圖2 酶解時間對DPPH自由基清除率和還原能力的影響Fig.2 Effects of hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

圖3 底物濃度對DPPH自由基清除率和還原能力的影響Fig.3 Effects of substrate concentration on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

2.1.4 酶與底物比對海灣扇貝抗氧化酶解物制備的影響

海灣扇貝抗氧化酶解物不同酶與底物比對DPPH自由基清除能力和還原能力的影響如圖4所示。當酶與底物比在1.0%～1.4%時，DPPH自由基清除率隨加酶量增加而顯著上升；在1.4%時，DPPH自由基清除率達到最高。這可能是因為，隨著蛋白酶用量的增加，海灣扇貝蛋白水解就會越充分，生成的抗氧化肽就越多，從而使DPPH自由基清除率提高。當酶與底物比在1.4%～1.8%時，酶解液的DPPH自由基清除率下降。這是因為，當酶含量達到一定程度，就會因為底物不足而引起水解反應速率的下降，進而導致自由基清除率下降［13］。以DPPH自由基清除率為主要指標，酶與底物比確定為1.4%。

2.2 響應面優(yōu)化分析

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以酶解時間、酶解溫度和酶與底物比為自變量，以DPPH自由基清除率和還原能力為因變量，采用Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化抗氧化酶解物制備條件實驗（表1）。

表1 響應面設(shè)計因子水平表Tab.1 Factors and levels in the response surface analysis

2.2.1 回歸方程的建立

采用Design Expert 8.0.6軟件處理，表2是Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果。

圖4 酶與底物比對DPPH自由基清除率和還原能力的影響Fig.4 Effects of enzyme-to-substrate on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design and results

利用軟件Design Expert 8.0.6進行多元回歸擬合，得到回歸模型Y1（海灣扇貝抗氧化酶解物DPPH自由基清除率）和Y2（海灣扇貝抗氧化酶解物還原能力）。響應值Y1剔除不顯著AC、BC后對方程進行優(yōu)化得到：Y1=69.63-5.88×A-3.57×B+0.30×C-2.75×A×B-1.08×A×C+1.76×B×C+3.54×A2+4.68×B2+1.72×C2。

響應值Y2剔除不顯著AB、AC、BC后對方程進行優(yōu)化得：Y2=62.05+2.61×A-1.41×B+2.43×C-0.065×A×B-0.95×A×C-0.99×B×C-4.22×A2-3.58×B2-3.40×C2。回歸方程的方差分析結(jié)果見表3和表4。Y1的回歸模型決定系數(shù)R2為0.988 6，說明DPPH自由基清除率的實際值與預測值擬合較好；調(diào)整決定系數(shù)RAdj2為0.851 0，表明該模型能解釋85.10%的響應值變化［14］。該模型的P值小于0.001，表明該回歸模型特別顯著；模型失擬項為0.067 3，表明該模型失擬項不顯著，說明該方程擬合度高，此回歸模型可以用于預測酶解溫度、酶解時間和酶與底物比對DPPH自由基清除率的影響。Y2的回歸模型系數(shù)R2為0.954，說明還原能力的實際值與預測值擬合較好；調(diào)整決定系數(shù)RAdj2為0.796 5，表明該模型能解釋79.65%的響應值變化；該模型的P值小于0.01，表明該回歸模型極顯著；模型失擬項為0.759 0，表明該模型失擬項不顯著，說明擬合度高，此回歸模型可以用于預測酶解溫度、酶解時間和酶與底物比對酶解物還原能力的影響［15］。

表3中F值表示的是單因素對海灣扇貝抗氧化酶解物DPPH自由基清除率的影響程度，F(xiàn)值越大，表示影響越大。由3個影響因素的F值大小可以推斷出3個因素對DPPH自由基清除率影響程度排序為A＞B＞C，其中因素A（酶解時間）、B（酶解溫度）對DPPH自由基清除率影響特別顯著，A2、B2對DPPH自由基清除率影響極顯著（P＜0.01），AB對DPPH自由基清除率的影響顯著（P＜0.05），C（酶與底物比）、AC、BC、C2的P＞0.05，表明其對DPPH自由基清除率無顯著性影響。

表4中F值表示的是單因素對海灣扇貝抗氧化酶解物還原能力的影響程度，F(xiàn)值越大，表明其影響越大。由3個影響因素的F值大小可以判斷出3因素對還原能力的影響程度排序為A＞C＞B，其中A（酶解時間）、C（酶與底物比）、A2、B2、C2對還原能力的影響極顯著，AC影響顯著，B（酶解溫度）、AB、BC的P＞0.05，表明其對還原能力無顯著性影響［16］。

表3 Y1響應面實驗的方差結(jié)果分析Tab.3 Analysis of variance results of Y1 response surface test

表4 Y2響應面實驗的方差結(jié)果分析Tab.4 Analysis of variance results of Y2 response surface test

采用Design Expert 8.0.6軟件根據(jù)多元回歸擬合分析處理3個因素對海灣扇貝抗氧化酶解物DPPH清除率影響的結(jié)果見圖5～圖7，對海灣扇貝抗氧化酶解物的還原能力影響的結(jié)果見圖8～圖10。分別固定各因素中的1個因素在0水平，得出其余2個因素的交互作用對海灣扇貝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率和還原能力影響的三維響應面圖和等高線圖，三維響應面圖和等高線圖可以直觀地反映各因素對海灣扇貝酶解物抗氧化活性的影響。等高線是響應面在水平方向的投影，等高線的形狀可以反映交互作用的大小、交互作用是否顯著，橢圓等高線表示兩因素交互作用顯著，圓形等高線表示交互作用不顯著。響應面坡度越陡，表明響應面對參數(shù)的變化越敏感，該參數(shù)對實驗結(jié)果的影響越大；反之，響應面坡度較平緩，表明響應面對參數(shù)的變化不敏感，該參數(shù)對實驗結(jié)果的影響不顯著。由圖5～圖7可知，交互項中酶解時間與酶解溫度對DPPH自由基清除率的響應面坡度最陡，表明酶解時間與酶解溫度對實驗結(jié)果影響最大；時間和酶與底物比之間交互的等高線圖成圓形，表明酶解時間和酶與底物比的交互作用影響較小，這與二次回歸方程的結(jié)果相一致。

由圖8～圖10可知，交互項中酶解時間和酶與底物比對還原能力的響應面坡度最陡，說明酶解時間和酶與底物比對實驗結(jié)果影響最大；酶解溫度和酶解時間之間交互的等高線成圓形，說明酶解時間和酶解溫度的交互作用可以忽略，這與二次回歸方程的結(jié)果相一致［17］。

2.2.2 模型的優(yōu)化和驗證

基于單因素實驗，利用響應面優(yōu)化實驗得到海灣扇貝抗氧化酶解物的最佳制備條件為：酶解時間 3.82 h、酶解溫度 50℃、酶與底物比1.54%、底物濃度20 mg·mL-1，在此條件下，海灣扇貝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率為81.93%，還原能力為58.92%，DPPH自由基清除率的IC50值為0.264 mg·mL-1，還原能力的IC50為3.136 mg·mL-1，具有較高的抗氧化活性。與張一江等［18］利用海灣扇貝為原料制備扇貝酶解物（DPPH自由基清除率的IC50值為5.90 mg·mL-1）相比，DPPH自由基清除活性更高；與田友昊等［19］利用中性蛋白酶水解扇貝裙邊制備抗氧化酶解物（IC50值為1.34 mg·mL-1）相比，DPPH自由基清除活性更高，還原能力活性則略低。其原因可能是由于田友昊等［19］所用樣品的純度更高，而張一江等［18］與本實驗相似，樣品為酶解混合物。綜合考慮現(xiàn)實操作的可行性，進一步優(yōu)化海灣扇貝抗氧化酶解物的較佳制備條件為：酶解時間3.8 h、酶解溫度50℃、酶與底物比1.5%、底物濃度20 mg·mL-1。為檢驗回歸模型預測的可靠性，在此條件下重復3次進行海灣扇貝抗氧化酶解物制備驗證實驗［20-21］。海灣扇貝蛋白酶解物的DPPH自由基清除率為83.47%（n=3），與預測值誤差為1.26%；還原能力達到58.12%（n=3），與預測值誤差為0.80%；實際值與預測值較一致。實驗結(jié)果表明該回歸模型在實驗范圍內(nèi)能夠較準確的預測海灣扇貝抗氧化酶解物的制備條件。

圖5 A（時間）B（溫度）兩因素交互作用對DPPH清除率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and B（temperature）factors on DPPH radical scavenging rate

圖6 A（時間）C（酶與底物比）兩因素交互作用對DPPH清除率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and C（enzyme to substrate ratio）factors on DPPH radical scavenging rate

圖7 B（溫度）C（酶與底物比）因素交互作用對DPPH清除率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plots and contour plots of the interactive between B（temperature）and C（enzyme to substrate ratio）factors on DPPH radical scavenging rate

圖8 A（時間）B（溫度）兩因素交互作用對海灣扇貝抗氧化酶解物還原能力影響的響應面圖Fig.8 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and B（temperature）factors on the reducing capacity

圖9 A（溫度）C（酶與底物比）兩因素交互作用對海灣扇貝抗氧化酶解物還原能力影響的響應面圖Fig.9 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and C（enzyme to substrate ratio）factors on the reducing capacity

圖10 B（溫度）C（酶與底物比）兩因素交互作用對海灣扇貝抗氧化酶解物還原能力影響的響應面圖Fig.10 Response surface plots and contour plots of the interactive between B（temperature）and C（enzyme to substrate ratio）factors on the reducing capacity

3 小結(jié)與展望

本研究以DPPH自由基清除率和還原能力為響應值，在單因素實驗的基礎(chǔ)上（優(yōu)選酶解時間4.0 h、酶解溫度 55℃、酶與底物比 20 mg·mL-1、底物濃度1.5%），根據(jù)顯著性確定以酶解時間、酶解溫度和酶與底物比3個因素為自變量，采用響應面法優(yōu)化確定海灣扇貝抗氧化酶解物的最佳制備條件為：酶解時間3.8 h、酶解溫度50℃、酶與底物比1.5%、底物濃度20 mg·mL-1；海灣扇貝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率為81.93%，還原能力為58.92%，分別與預測值誤差為1.26%和0.80%；DPPH自由基清除率的IC50值為0.264 mg·mL-1，還原能力的IC50值為3.136 mg·mL-1，具有較高的抗氧化活性，實際值與預測值具有較好的一致性。結(jié)果表明該回歸模型在實驗范圍內(nèi)能夠較準確的用于預測海灣扇貝抗氧化酶解物的制備條件。目前，本研究獲得的海灣扇貝抗氧化酶解物仍是混合物，抗氧化的主要組分與結(jié)構(gòu)尚不明確，下一步將對其主要成分進行分離和純化，探討其抗氧化的作用機理。