南極磷蝦酶解產(chǎn)物中一種含氟多肽的研究

劉云姣，張海燕，孔 聰，樊成奇，劉淑晗，汪 宇，沈曉盛

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

南極磷蝦是地球上最大的生物類群之一，由于其儲(chǔ)藏量巨大，并且營養(yǎng)價(jià)值很高，含有人體所必需的全部氨基酸，被人們稱為未來的食品蛋白資源倉庫［1］。然而南極磷蝦具有富集氟的特性，其氟含量非常高，冷凍南極磷蝦肌肉中氟含量為325～570μg·g-1［2-3］。根據(jù)中國衛(wèi)生部發(fā)布的人口總氟攝入量健康標(biāo)準(zhǔn)，成人每日氟攝入量應(yīng)不超過3 mg［4］，這說明南極磷蝦不能直接作為食品被人類利用。然而，有研究發(fā)現(xiàn)以南極磷蝦為主要食物的南極企鵝骨骼氟含量達(dá)6448～7187μg·g-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常鳥類骨骼的氟含量，但它們并沒有出現(xiàn)氟中毒現(xiàn)象［5-6］，說明氟的毒性與其賦存形態(tài)有關(guān)。隨著對氟形態(tài)研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到生物體對不同形態(tài)氟的吸收和生物利用度存在差異［7-8］。這意味著僅分析南極磷蝦中氟的總含量不足以解釋其毒性大小，也無法科學(xué)的評估南極磷蝦的安全性，因此研究南極磷蝦肌肉中氟的賦存形態(tài)是非常有必要的。

有關(guān)南極磷蝦氟的分析方面，主要集中在對氟的總量分析上，對氟的形態(tài)分析相對較少，僅有的幾篇關(guān)于氟形態(tài)的報(bào)道也是基于土壤和巖石中氟的形態(tài)分析方法［9］，并且通過這種分析方法獲得的幾種氟形態(tài)存在交叉折疊，學(xué)術(shù)上尚存在爭議［10］。目前人們對南極磷蝦中氟形成機(jī)制尚不清楚，關(guān)于氟與蛋白存在某種形態(tài)結(jié)合以及以何種方式結(jié)合，還處于假設(shè)推斷狀態(tài)。SANDS等［11］基于氟的快速溶解特性，推斷氟可能與水溶性蛋白結(jié)合在一起，ZHANG等［12］通過對南極磷蝦氟的遷移規(guī)律研究，推斷氟可能與某種結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)。筆者在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦蛋白中存在結(jié)合態(tài)的氟，為了進(jìn)一步獲得南極磷蝦蛋白中氟的結(jié)合形態(tài)，本研究在酶解獲得蛋白肽的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)蛋白分離文獻(xiàn)［13-16］，采用超濾、凝膠過濾層析，C18高效液相色譜技術(shù)分離純化得到純化的磷蝦肽，然后通過離子色譜法對其進(jìn)行氟含量的測定，同時(shí)利用LC-MS/MS對其氨基酸序列進(jìn)行分析，將分析結(jié)果通過NCBINucleotide-Euphausiacea蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并對該蛋白結(jié)構(gòu)與特性進(jìn)行深入分析，以期可為南極磷蝦中含氟蛋白的制備提供新的技術(shù)方法，同時(shí)也為南極磷蝦中含氟蛋白的安全評價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 南極磷蝦來源

實(shí)驗(yàn)用南極磷蝦于2017年4月采自南極海域，采捕上岸后，放入-20℃的冰箱冷凍保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胰蛋白酶（≥50 000 U·g-1），購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉等其他試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；實(shí)驗(yàn)用水由超純水儀（美國Millipore公司）制備。

1.2 主要儀器設(shè)備

850 Professional IC離子色譜儀（瑞士萬通公司）；Metrosep A Supp 5-250/4.0色譜柱；高效液相色譜儀（Agilent 1260）；YMC-Pack ODS-AQ色譜柱（150 mm×4.6 mml.AQ12S05-1546WT）；LC-MS/MS（EASY-nLC1000，LTQ Orbitrap Velos Pro系統(tǒng)，Thermo Finnigan公司）；8400型Amicon?攪拌式超濾杯（美國默克公司）；Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱填料（Pharmacia公司）；玻璃層析柱Φ3×150 cm（上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠）；16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI CF公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國 Millipore公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 南極磷蝦肽的制備

1.3.1.1 粗肽的制備

參考南極磷蝦酶解多肽的制備方法［17］，準(zhǔn)確稱取100 g南極磷蝦鮮蝦肉，加入超純水500 mL，按1%酶底濃度加入胰蛋白酶，用0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH為8.0后，于45℃水浴震蕩8 h。酶解結(jié)束后，取出酶解液于100℃沸水中加熱10 min，終止酶解反應(yīng)。將滅活的酶解液冷卻至室溫，離心（5℃，5 000 r·min-1）20 min，收集上清液，待用。

1.3.1.2 磷蝦肽粉的制備

參考酶解制備多肽的分子量大?。?7］，選取30 kD超濾膜超截留未酶解完全的大分子蛋白和其他大分子物質(zhì)，控制蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速，調(diào)節(jié)超濾膜板進(jìn)口壓力為15～20 Psi，出口壓力為5 Psi，壓力差控制在15 Psi以上，收集濾出液，在-80℃冷凍后，于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥制得南極磷蝦酶解多肽粉。

1.3.2 南極磷蝦酶解多肽得率

南極磷蝦酶解多肽得率（%）=酶解磷蝦肽粉質(zhì)量（g）/鮮蝦肉粉質(zhì)量（g）×100

1.3.3 南極磷蝦多肽的分離純化

采用凝膠過濾層析與高效液相色譜對南極磷蝦多肽分離純化［13-16］。

凝膠過濾層析 取Sephadex G-25葡聚糖凝膠裝柱，用超純水平衡層析柱2 h，一次加入酶解蛋白肽濃度 0.1 g·mL-1、8～10 mL，以 2 mL·min-1勻速洗脫，收集洗脫液（5 mL·管-1）。

高效液相色譜分離 將凝膠柱洗脫液依次通過HPLC分析得到分離圖譜，根據(jù)色譜圖進(jìn)行分離純化，并將純化得到的相同多肽的層析液合并，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL左右，于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥24 h，得到不同分子量的各組分磷蝦肽粉。其分析條件如下：檢測波長：220 nm；柱溫：30℃；0.1 mL·min-1；進(jìn)樣量 80μL；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：超純水；梯度洗脫條件如下：（A/B）0～2 min，5%（等量梯度）；2～12 min，5% ～60%（線性梯度）；12～15 min，60% ～80%（線性梯度）；15～17 min，80%（等量梯度）；17～17.5 min，80% ～5%（線性梯度）；17.5～20 min，5%（等量梯度）。

1.3.4 氟的測定

采用離子色譜法進(jìn)行氟含量測定［18］：取樣品0.1 g，加入 2 mL體積比為 11∶1（水∶鹽酸）的鹽酸水溶液，密閉酸解1 h，用超純水定容至20 mL，依次過0.22μm水相針式濾膜，IC-Ag+柱，ICNa+柱，上機(jī)。色譜條件：流動(dòng)相：3.2 mmol·L-1Na2CO3-1.0 mmol·L-1NaHCO3；流速：0.700 mL·min-1；柱溫25℃；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.5 氨基酸分析及蛋白鑒定

由上海鹿鳴生物科技有限公司提供技術(shù)支持，采用LC-MS/MS對多肽進(jìn)行氨基酸分析及蛋白鑒定［13-16］，磷蝦肽經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用 LTQ Orbitrap Velos Pro質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長：90 min，檢測方式：正離子，噴霧電壓：1.8 kV，離子傳輸毛細(xì)管溫度：250℃，使用前經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)校正液校正，母離子掃描范圍：350～1 800 m/z，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下（information dependent analysis，IDA），每次全掃描（full scan）后采集最強(qiáng)的10個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），碎裂方式：碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CID），正態(tài)化能量35%，q值0.25，活化時(shí)間：30 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間：30 s，MS1在 M/Z 400時(shí)分辨率為60 000，MS2在離子阱中為單位質(zhì)量分辨。一級質(zhì)譜采用profile模式采集，二級質(zhì)譜采用centroid方式采集以降低數(shù)據(jù)文件大小。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 10.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）和 Mascot 2.3軟件（Matrix Science）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)庫為 NCBI-Nucleotide-Euphausiacea數(shù)據(jù)庫，酶選擇為無，最大缺失切割位點(diǎn)為2；固定改性為：氨基甲?；谆–）；變量修飾為：乙酰基（蛋白質(zhì) N-末端），脫酰胺基（NQ），二氧化（W），氧化（M）；對于成功鑒定，MS耐受性為±10 ppm，MS/MS耐受性為 ±0.6 Da，蛋白質(zhì)得分CI%大于95%。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行測定值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD），分別利用 Excel 97-2003、Chemist draw 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極磷蝦酶解多肽粗提物得率及其氟含量分析

在前期優(yōu)化酶解工藝的基礎(chǔ)上，采用胰蛋白酶對南極磷蝦肌肉進(jìn)行酶解。南極磷蝦酶解液離心后取上清液，用30 kD超濾膜截留未酶解完全的大分子蛋白和其他大分子物質(zhì)，離心，凍干，得到酶解粗提物，經(jīng)計(jì)算100.00 g南極磷蝦肌肉酶解后的多肽質(zhì)量為（19.98±0.41）g，即南極磷蝦多肽粗提物得率約為20%。

采用離子色譜法測定南極磷蝦肌肉酶解前后的蝦肉粉與多肽粉的氟含量分別為（864.52±0.96）μg·g-1和（731.73±1.01）μg·g-1。以多肽得率20%，并考慮到殘?jiān)蟹挠绊懀Y(jié)合酶解前后蝦肉粉與多肽粉總氟比計(jì)算，以鮮蝦肉計(jì)，粗略換算氟含量約為172.90μg·g-1，結(jié)果略高于朱蘭蘭等［19］和 PARK等［20］測得的氟含量（60～120μg·g-1），低于郭帆等［9］和 ZHANG等［12］測得的氟含量（265～325μg·g-1）。這可能與不同實(shí)驗(yàn)室所使用的南極磷蝦原料的儲(chǔ)存條件不同有關(guān)，研究表明，存儲(chǔ)條件對南極磷蝦體內(nèi)氟遷移的形態(tài)與含量有明顯的影響［21］，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長或存儲(chǔ)溫度的升高，蝦殼中的氟更容易轉(zhuǎn)變成易被肌肉吸收的離子交換態(tài)氟或水溶態(tài)氟，因此對南極磷蝦捕獲后低溫快速脫殼技術(shù)的研究也是降低肌肉氟含量的重要環(huán)節(jié)，由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室選用的南極磷蝦原料的采購廠家、存儲(chǔ)條件、捕撈海域不一樣，導(dǎo)致各個(gè)實(shí)驗(yàn)室測得的結(jié)果存在差異。

2.2 南極磷蝦酶解多肽的高效液相色譜分析

圖1是南極磷蝦肌肉酶解后多肽的高效液相色譜分析圖譜，可以看出南極磷蝦多肽主要有6個(gè)比較明顯的峰（分別命名為 F1、F2、F3、F4、F5、F6），且各個(gè)峰型良好，說明該色譜條件能較好地將南極磷蝦酶解后的多肽有效分開，色譜條件適合南極磷蝦酶解多肽的分析。

圖1 南極磷蝦肌肉酶解后的多肽高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of peptides after enzymatic hydrolysis of Antarctic krill

2.3 南極磷蝦酶解多肽的純化及各組分多肽氟含量分布

為了得到各組分多肽（F1、F2、F3、F4、F5、F6）氟的含量分布，用Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析柱分離純化后，進(jìn)行分段收集，并通過HPLC C18反相柱精制，純化后得到6個(gè)組分多肽。收集6個(gè)組分多肽，并對其進(jìn)行氟含量分析，表1是離子色譜對多肽（F1、F2、F3、F4、F5、F6）中氟含量的分析結(jié)果，從表1中可以看出，6個(gè)主要的肽段均有氟分布，但主要集中在多肽F6上，說明多肽F6的結(jié)構(gòu)更容易與氟結(jié)合。

表1 不同多肽中氟含量分布Tab.1 Distribution of fluorine content in different peptides

2.4 南極磷蝦酶解后的多肽F6的純度鑒定

為了確保多肽F6的高純度樣品，以免雜質(zhì)的存在對后續(xù)的組成、結(jié)構(gòu)和序列分析造成干擾或影響。將經(jīng)過Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱初步分離后的多肽層析液，通過HPLC進(jìn)一步分離，獲得純化樣品。圖2是多肽F6的純度鑒定結(jié)果，可以看出多肽F6的高效液相色譜峰為單一的對稱峰，說明樣品為單一組成，純度較高。

圖2 多肽F6的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of peptide F6

2.5 南極磷蝦酶解后的多肽F6的MS/MS分析

圖3 是多肽F6的 LC-MS/MS質(zhì)譜圖，分析多肽F6分子量以鑒定其氨基酸的序列，將得到的片段氨基酸序列通過NCBI-Nucleotide-Euphausiacea蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，按匹配值得分高于100分可篩選鑒定得到4種蛋白質(zhì) ［Clock，Tropomyosin，ATP synthase subunit 6（mitochondrion），Arginine kinase］，標(biāo)識(shí)符分別為：gi｜1047815850｜gb｜ANW48378.1｜，gi｜156712752｜dbj｜BAF76430.1｜，gi｜588481755｜gb｜AHK23746.1｜，說明多肽F6與這4種蛋白相關(guān)。Clock蛋白作為調(diào)節(jié)生物節(jié)律關(guān)鍵因子，可通過磷酸化修飾形成羥基磷酸鹽［22-23］，從而增強(qiáng)穩(wěn)定性，在維持生命體節(jié)律方面具有重要作用，Tropomyosin是一種細(xì)肌絲相關(guān)蛋白，它具有二聚化α-螺旋結(jié)構(gòu)，對肌肉收縮有重要的調(diào)節(jié)作用，ATPsynthase subunit 6（mitochondrion）廣泛存在于線粒體內(nèi)膜，參與光合磷酸化和氧化磷酸化，在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢的推動(dòng)下合成ATP，為生命體提供能量，Arginine kinase是磷酸原胍基化合物激酶的一種，主要存在于無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，用于迅速補(bǔ)償ATP濃度劇烈變化以及細(xì)胞內(nèi)不同部位的能量傳遞，在細(xì)胞能量代謝中起重要作用。

有研究表明，氟與羥基磷酸鹽之間的離子交換吸附是南極磷蝦富集氟的主要方式，這種結(jié)合方式是氟在機(jī)體內(nèi)最穩(wěn)定的存在方式［34］。由于鑒定出的4種蛋白中，只有Clock蛋白可以通過磷酸化修飾形成羥基磷酸鹽，Tropomyosin、ATP synthase subunit 6 （mitochondrion）、 Arginine kinase這3種蛋白在肌肉收縮、能量傳遞中有重要作用?？梢酝茰y南極磷蝦蛋白與氟的結(jié)合可能與Clock蛋白的磷酸化有關(guān)，在ATP synthase subunit 6、Arginine kinase等酶的參與下，Clock蛋白可通過磷酸化修飾形成羥基磷酸鹽，氟通過羥基磷酸鹽與氨基酸側(cè)鏈之間的離子交換吸附在南極磷蝦中積累，以維持南極磷蝦肌肉內(nèi)穩(wěn)定的氟含量。表2是Clock蛋白的氨基酸序列，藍(lán)色標(biāo)示為多肽F6與Clock蛋白的匹配序列。

3 討論

圖3 多肽F6的MS/MS質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MSspectrum of Antarctic krill peptide F6

表2 Clock蛋白的氨基酸序列Tab.2 Amino acid sequence of Clock protein

南極磷蝦作為人類最大的動(dòng)物性蛋白資源庫，其蛋白的利用對產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。然而，研究顯示，南極磷蝦肌肉中的氟含量在225～570 μg·g-1之間［2-3］，并以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的方式賦存于肌肉中。游離態(tài)氟可根據(jù)氟離子的水溶性特征進(jìn)行快速去除，但結(jié)合態(tài)氟很難通過簡單的工藝將氟除去，容易導(dǎo)致南極磷蝦蛋白粉或南極磷蝦多肽粉中氟含量超標(biāo)，影響其開發(fā)利用。參考相關(guān)文獻(xiàn)［24-26］，酶解法反應(yīng)條件溫和，整個(gè)反應(yīng)無高溫高壓強(qiáng)酸強(qiáng)堿過程，對蛋白結(jié)構(gòu)的破壞程度小。此外，生物酶具有專一性，一種酶只能催化一種反應(yīng)，作用于特定的肽鍵，如胰蛋白酶只能斷裂賴氨酸、精氨酸、組氨酸這3種堿性氨基酸所形成的肽鍵。故本文通過酶解的方式分離南極磷蝦肌肉中的含氟多肽，目的是不破壞結(jié)合態(tài)氟的賦存形式，有利于后期結(jié)合態(tài)氟的安全性以及理化特性的研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，采用酶解獲得南極磷蝦多肽粗提物是可行的，多肽通過凝膠色譜層析和反相液相色譜再次分離純化后，可成功制備出純度較高的多肽，多肽F6就是本文分離純度較高的多肽。

為了進(jìn)一步獲得多肽F6與氟結(jié)合的可能肽鏈，通過質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合氨基酸序列對多肽F6進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)氟與Clock蛋白結(jié)合的可能性最大。鑒定出的Clock蛋白是由Clock基因編碼的蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)生物節(jié)律。有研究證明，磷酸化修飾后的Clock蛋白在生物鐘的正負(fù)反饋回路中起關(guān)鍵性作用，Clock蛋白可以通過磷酸化修飾增強(qiáng)其在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定性、相互作用和活性［22-23］。Clock蛋白磷酸化是通過將ATP中的磷酸基團(tuán)磷酸化到蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的，該特定位點(diǎn)一般是指含有羥基的氨基酸即絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Lyr），它們的磷酸化氨基酸結(jié)構(gòu)如圖4所示，這3種氨基酸具有游離羥基且不帶電荷，當(dāng)磷酸化時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷［27］。鈣離子廣泛存在于細(xì)胞中，可與鈣調(diào)素結(jié)合引起鈣調(diào)素構(gòu)象的變化，從而在特定的反應(yīng)中結(jié)合特定蛋白質(zhì)，作為蛋白質(zhì)的重要輔助因子，參與磷酸化等翻譯后修飾［28］，另外細(xì)胞內(nèi)Ca2+作為調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)的第二重要信使，還參與某些類型神經(jīng)細(xì)胞中動(dòng)作電位的傳播［29］。由于鈣離子帶有正電荷，它們可以通過離子傳輸通道與帶負(fù)電荷的磷酸化Clock蛋白結(jié)合形成羥基磷酸鈣（HAP），HAP作為一種可以吸附在蛋白上的生物礦物質(zhì)，可能在促進(jìn)化學(xué)進(jìn)化上起著累積生物分子的作用［30］。因?yàn)槟蠘O磷蝦肌肉中有很多游離的氟離子，HAP具有很強(qiáng)的離子交換能力，所以O(shè)H-很容易被F-所取代，而形成吸附能力更強(qiáng)、更加穩(wěn)定的氟磷灰石（FHAP）［31-33］。南極磷蝦肌肉中氟的結(jié)合形態(tài)可能與Clock蛋白磷酸化有關(guān)，通過磷酸化來形成穩(wěn)定的生物礦物質(zhì)（FHAP），來維持機(jī)體的正常代謝與生命活動(dòng)。目前認(rèn)為南極磷蝦通過離子交換吸附，即通過Ca5（PO4）3OH+F-=Ca5（PO4）3F+OH-實(shí)現(xiàn)氟離子的聚集便是基于這個(gè)原理［34］。

4 小結(jié)

1）本研究采用胰蛋白酶酶解法制備南極磷蝦多肽的得率約為20%。

2）將南極磷蝦酶解多肽經(jīng)過超濾、Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱層析、高效液相色譜技術(shù)分離純化得到的6個(gè)組分多肽（分別命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6），并且氟主要集合在多肽 F6，多肽F6氟含量最高，可達(dá)（266.11±0.40）μg·g-1。

3）通過LC-MS/MS分析得到多肽F6的氨基酸序列，并將片段氨基酸序列通過 NCBINucleotide-Euphausiacea蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索，按匹配值得分高于100分可篩選鑒定得到4種蛋白質(zhì)［Clock， tropomyosin， ATP synthase subunit 6（mitochondrion），Arginine kinase］。通過對 4種蛋白的研究，同時(shí)結(jié)合多肽的理化特性分析，在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)下，說明南極磷蝦蛋白結(jié)合氟可能與Clock蛋白的磷酸化有關(guān)，氟以FHAP生物礦物鹽的形式與南極磷蝦蛋白結(jié)合，以維持南極磷蝦肌肉內(nèi)穩(wěn)定的氟含量，但具體結(jié)合結(jié)構(gòu)、結(jié)合機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

圖4 磷酸化氨基酸結(jié)構(gòu)式Fig.4 Phosphorylated amino acid structure