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    利瑪原甲藻PL11共附生菌多樣性研究

    2020-03-26 05:13:34李月月田曉清韓清華樊成奇馬麗艷陸亞男
    海洋漁業(yè) 2020年1期

    李月月,田曉清,韓清華,樊成奇,馬麗艷,陸亞男

    (1.上海海洋大學(xué),上海 201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室,上海 200090)

    原甲藻(Prorocentrum)是導(dǎo)致赤潮的重要生物之一,其代表產(chǎn)物大田軟海綿酸(okadaic acid,OA)及其結(jié)構(gòu)類似物鰭藻毒素-1(dinophysistoxin-1,DTX-1)是腹瀉性貝類毒素(diarrheic shellfish poisoning,DSP)的主要組分。腹瀉性貝類毒素引起的中毒事件具有全球性,自20世紀(jì)60年代以來在歐洲、亞洲、北美洲、南非等地都曾有報道[1],DSP不僅會危害海洋生態(tài)平衡,還會通過海洋食物鏈的富集威脅人類健康[2],同時也是蛋白磷酸酶2A、1和2B的有效抑制劑,可以導(dǎo)致人體消化系統(tǒng)中癌癥的發(fā)生[3]。而利瑪原甲藻(P.lima)是原甲藻屬甲藻中主要的產(chǎn)毒藻株,可以作為腹瀉性貝毒的穩(wěn)定性來源,因此利瑪原甲藻在很長一段時間內(nèi)一直是人們研究的熱點。然而直到目前,對于利瑪原甲藻產(chǎn)毒機制方面的研究仍較少。事實上,利瑪原甲藻中生物毒素的表達水平受營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響很大[4],但是包括環(huán)境微生物在內(nèi)的各種因素對其產(chǎn)毒的具體影響仍未有定論。雖然目前認為利瑪原甲藻相關(guān)細菌并不能獨立產(chǎn)生毒素[5],但是很多學(xué)者認為其對藻毒素的產(chǎn)生有著直接或間接的影響[6]。有研究表明,細菌可能對利瑪原甲藻細胞產(chǎn)生毒素有一定的協(xié)同作用,在利瑪原甲藻的衰老階段,產(chǎn)毒水平增加,這些細菌可能開始降解利瑪原甲藻細胞,會加速微藻的衰老,裂解作用可能會增加溶解有機碳的數(shù)量,這可能為增加毒素的產(chǎn)生提供更多的資源,從而促進毒素的生成[1]。目前,關(guān)于細菌對利瑪原甲藻產(chǎn)毒的影響只進行了初步的探索,它們之間的相互作用機制仍然需要更深入的研究。

    本文以利瑪原甲藻藻株為研究材料,通過高通量測序及微生物純培養(yǎng)技術(shù),對利瑪原甲藻PL11可能的共附生菌群的多樣性進行分析,包括其群落的組成以及相對豐度。并通過純培養(yǎng)的方法得到9株可培養(yǎng)細菌,以期為后期繼續(xù)研究細菌在微藻產(chǎn)毒過程中的作用提供必要的生物材料及基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    生物材料:利瑪原甲藻PL11。

    試劑材料:Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司);16s引物(上海生工生物有限公司);PCR擴增體系(康為世紀(jì));PBS緩沖液(上海生工生物有限公司)。

    培養(yǎng)基:f/2培養(yǎng)基,2216E培養(yǎng)基。

    實驗儀器:高壓滅菌鍋:股海申安醫(yī)療器械廠,LDZX-75KBS型;大型恒溫培養(yǎng)箱:上海化學(xué)儀器有限公司,ATB-032型;超凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司,DL-CJ-INDII型;臺式高速離心機:湖南湘儀離心機儀器有限公司,H-1560型;超聲儀:上海漢克科學(xué)儀器有限公司,SK250LH型;PCR儀:杭州朗基科學(xué)儀器有限公司,AG-22331型;凝膠成像系統(tǒng):上海天能科技有限公司,GIS-1600型。超純水儀:上海智巖科學(xué)儀器有限公司,Milli-QAdvantage型。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 藻培養(yǎng)

    利瑪原甲藻采用f/2培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。f/2培養(yǎng)基由4種儲備液配制而成,分別為75.0 g·L-1NaNO3溶液、5.0 g·L-1NaH2PO4·H2O溶液、L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution。其中 NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O、L1 Trace Metal Solution以超純水配制后,高溫滅菌放入4℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆?;Vitamin Solution以高溫滅菌后的超純水配制備用。L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution為混合溶液,具體配方見表1。

    f/2培養(yǎng)基配制過程如下:將超純水用鹽鹵將其鹽度調(diào)至23,分別加入1 mL NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O溶液以及L1 Trace Metal Solution,高壓滅菌鍋高溫滅菌30 min(120℃),冷卻至20℃加入0.5 mL Vitamin Solution。利瑪原甲藻的培養(yǎng)條件:光照強度為4 500~5 000 lx,光照周期為12L/12D,溫度為24℃。

    表1 f/2培養(yǎng)基配方Tab.1 Medium formula of f/2

    1.2.2 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

    實驗室培養(yǎng)藻的密度達到1×106個·L-1后,取50 mL藻液于無菌離心管中,離心(轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1,時間 5min),收集藻細胞,以 30 mL pH 7.2的PBS緩沖液洗滌藻細胞,重復(fù)4次放置備用。藻共附生菌總基因組DNA以Stool DNA Kit試劑盒(美國OMEGA)提取,取1mL以擴增引物338F和806R進行擴增。上游引物為338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下游引物 為 806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[7]。PCR擴增反應(yīng)體系如下:模板 DNA:10 ng,BSA:0.2μL,DNA多聚酶:0.4μL,5×FastPfu緩沖液:4μL,2.5 mmol·L-1dNTPs:2μL,上游引物(5μmol·L-1):0.8μL,下游引物(5μmol·L-1):0.8μL,加入滅菌后的超純水使總體積達到50μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性時間5 min(95℃),進入循環(huán),變性時間40 s(95℃),退火時間40 s(55℃),延伸時間60 s(72℃),循環(huán)30次,最后延伸15 min(72℃)。通過電泳來檢驗PCR完成的產(chǎn)物是否合格,如條帶清晰,無降解則符合后續(xù)測序要求。如條帶不清晰或未出現(xiàn),則重新進行PCR擴增,若再次擴增后仍沒出現(xiàn)清晰的條帶則要重新提取?;厥誔CR產(chǎn)物樣品進行Illumina Miseq高通量測序(上海美吉生物公司)。

    數(shù)據(jù)質(zhì)控:根據(jù)paired-end reads之間的互相重疊進行序列拼接,對reads的質(zhì)量和拼接的效果進行質(zhì)控分析[8],具體操作如下:以 FLASH對每個樣品的讀長進行拼接,得到原始連接數(shù)據(jù)(raw tags),對原始連接數(shù)據(jù)進行進一步的過濾以得到高質(zhì)量的連接數(shù)據(jù)(clean tags);后續(xù)進行tags截取,截取質(zhì)量閾值為≤19,堿基數(shù)默認長度為3,得到tags數(shù)據(jù)集,過濾掉連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于tags長度75% 的 tags。最后進行去除嵌合體序列的處理,通過與數(shù)據(jù)庫的比對,移除掉Chimera序列,得到有效數(shù)據(jù)(effective tags)[9]。

    數(shù)據(jù)分析:按照序列間的距離進行聚類分析,從中選取與代表序列相似度大于97%的序列生成操作分類單元(OTU)。選取Silva作為細菌16SrRNA數(shù)據(jù)庫、RDP、Greengene為功能基因數(shù)據(jù)庫,使用Qiime平臺與 RDP Classifier分別作為計算軟件及算法,設(shè)定0.7為置信度閾值[10]。菌落豐富度(community richness)指數(shù)分別為Chao和ACE;菌落多樣性(community diversity)指數(shù)為Shannon以及 Simpson。稀釋曲線(rarefaction curve)采用對序列進行隨機抽樣的方法,以抽到的序列數(shù)與它們對應(yīng)的物種(如OTU)數(shù)目或多樣性指數(shù)來構(gòu)建。

    1.2.3 可培養(yǎng)共附生菌株的分離及鑒定

    取1.5 mL藻液(對數(shù)生長期)于2 mL的EP管中,離心(轉(zhuǎn)速 6 000 r·min-1,5 min)。棄去上清液,加入1.5 mL無菌超純水輕輕震蕩混勻,重復(fù)離心一次,棄上清液加入1.5 mL無菌超純水震蕩混勻,冰浴下超聲波破碎藻細胞處理10 min,然后用滅菌超純水將其稀釋10倍,分別取200μL破碎藻細胞原液與稀釋后的藻液均勻的涂布在2216E平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)48 h,期間不斷進行觀察,待培養(yǎng)基上生長出單菌落后,在2216E平板培養(yǎng)基上再次進行劃線純化,徹底純化后的單菌落接種到固體斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)48 h后接種到2216E液體培養(yǎng)基中并放入搖床中培養(yǎng)48 h(23℃)[10-11]。

    16S rRNA測序及比對:使用細菌基因組DNA提取試劑盒(日本 TaKaRa)提取基因組DNA,按照試劑盒的說明書進行具體實驗步驟:取1 mL菌液至1.5 mL無菌離心管中,離心(轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1,時間 1 min),棄上清收集菌體。加入180μL溶菌酶溶液重懸菌液,37℃水浴30~60 min,再加入400μL Buffer Digestion,震蕩混勻,65℃水浴1 h。加入200μL Buffer PB,充分混勻,-20℃放置5 min后離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1,時間5 min),將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入1 mL異丙醇,充分混勻后離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1,時間 5 min),棄上清。加入 1 mL 75%乙醇,離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1,時間2 min),棄上清。打開離心管的蓋子倒置5~10 min使乙醇完全揮發(fā),得到所需DNA。加入50 μL TE Buffer溶解DNA,以16S rRNA擴增通用引物27F及1492R進行擴增,其序列分別為上游引物 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物 1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系包括:23μL的 2×TaqPCR MasterMix:,1μL上游引物,1μL下游引物,5μL模板DNA,20μL去離子水[10]。PCR擴增程序如下:預(yù)變性時間4 min(95℃),進入循環(huán),變性時間40 s(95℃),退火時間40 s(57℃),延伸時間2 min(72℃),循環(huán) 40次,最后延伸 10 min(72℃)。PCR擴增結(jié)束后進行電泳?;厥諛悠愤M行基因測序(上海美吉生物公司),對獲得的16SrRNA基因序列進行分析,通過EzBioCloud進行菌株序列同源性對比,建立菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹(MEGA軟件)[7]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 樣品信息統(tǒng)計

    利瑪原甲藻PL11共附生微生物的測序結(jié)果如表2所示,通過高通量測序一共獲得42 065條序列。稀釋曲線(rarefaction curve)可以用來比較測序樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性,也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理[12]。以Shannon為多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線(圖1),樣品的曲線逐漸趨向水平,說明測序數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠大,可以反映樣品中的物種多樣性,樣本的測序數(shù)量是合理的。

    表2 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測序樣本信息表Tab.2 Summary of the high-throughput sequencing sample from P.lima PL11

    圖1 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測序樣品Shannon-Wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve of the sequencing sample from P.lima PL11

    2.2 利瑪原甲藻的共附生菌多樣性分析

    MiSeq高通量測序結(jié)果顯示,利瑪原甲藻PL11共附生菌群共68個OTU,包括5門,14綱,26目,38科及54屬。PL11共附生菌群屬水平相對豐度分布如圖2所示。其中優(yōu)勢門(>5%)3個,包括變形菌門(Proteobacteria,75.5%)、擬桿菌門(Bacteriodetes,11.5%)以及浮霉菌門(Planctomycetex,8.5%)。優(yōu)勢綱(>5%)4個,包括 α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,51.7%)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,31.8%)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria,9.9%)以及 OM190綱(8.9%);優(yōu)勢屬(>5%)6個,包括侏囊菌科下未 知 屬 (norank Nannocystaceae,21.8%)、Pyruvatibacter屬(11.6%)、Phaeodactylibacter屬(9.4%)、生絲單胞菌科下未知屬(norank Hyphomonadaceae,8.5%)、OM190綱下未知屬(8.1%)以及Roseovarius屬(7.9%)。用MEGA6建立的利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖3。

    2.3 利瑪原甲藻可培養(yǎng)共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育進化分析

    從利瑪原甲藻PL11培養(yǎng)物中分離出了9株細菌,用MEGA6建立的系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖4,通過序列同源性比對(表3)以及系統(tǒng)發(fā)育進化樹的結(jié)果顯示,這些菌株分屬于8個屬,如表3所示,分 別 為Ochrobactrumsp.(2株)及Microbacteriumsp.、Algoriphagussp.、Ponticoccussp.、Hoefleasp.、Labrenziasp.、Erythrobactersp.、Sphingopyxissp.各1株。其中,菌株P(guān)L11-1與已知菌株的16S rRNA基因同源性最高值為97.55%,說明其為Ponticoccus屬潛在新種,其多相分類學(xué)鑒定分析目前正在進行中。

    3 討論

    圖3 利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial community associated with P.lima PL11

    表3 菌株種屬的分類結(jié)果Tab.3 Classification results of strain species

    圖4 基于16Sr RNA序列構(gòu)建的可培養(yǎng)共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis of 16S r RNA sequences

    細菌和浮游植物之間的相互作用越來越多地被認為是毒素產(chǎn)生和赤潮發(fā)生的重要因素[13],了解毒素的產(chǎn)生機制有利用解決其對環(huán)境以及人類健康產(chǎn)生的危害,藻菌之間的相互作用關(guān)系是了解毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高通量測序技術(shù)不經(jīng)過分離培養(yǎng)微生物就可以分析微生物群落的多樣性,從而為優(yōu)化利瑪原甲藻共附生微生物的分離并增加其可培養(yǎng)性帶來有價值的參考。本文利用MiSeq高通量測序首次對利瑪原甲藻PL11共附生菌群多樣性進行了分析。從獲得的68個OTU中歸類出54個屬,其優(yōu)勢屬6個。先前電子顯微鏡觀察研究表明,在無菌培養(yǎng)的利瑪原甲藻細胞中沒有檢測到細菌。通過高通量測序可以清楚的看到利瑪原甲藻PL11具有豐富且多樣的微生物群落。

    此外,基于微生物純培養(yǎng)技術(shù)從利瑪原甲藻PL11中分離獲得9株細菌,包括一株潛在新株P(guān)L11-1。PL11-1屬于玫瑰桿菌簇,紅桿菌科,Ponticoccus屬;Poncticoccussp.與藻類赤潮爆發(fā)關(guān)系密切,TAN等[14]等發(fā)現(xiàn)Ponticoccus屬下一株菌在發(fā)生赤潮時能與藻類相互作用,表現(xiàn)出一定的主導(dǎo)作用。Ponticoccussp.PD-2是首次發(fā)現(xiàn)的有群體感應(yīng)的菌株,它對多種赤潮藻的生長都能產(chǎn)生抑制作用[15]。從利瑪原甲藻PL11中得到的PL11-1可能與利瑪原甲藻生長和產(chǎn)毒都有著密切的關(guān)系。fan3-1屬于鞘氨醇單胞菌(Sphingopyxissp.),鞘氨醇單胞菌可以降解微囊藻毒素,通常情況下同一株菌只能降解一種藻毒素,Sphingopyxis屬下一株菌卻能夠同時降解 MCYR、MC-LR和 MC-RR 3種毒素[16]。進一步研究Ponticoccus屬下PL11-1與Sphingopyxis屬下fan3-1和利瑪原甲藻之間的相互作用關(guān)系,可以更好地了解利瑪原甲藻產(chǎn)毒或毒素降解的機理。關(guān)于利瑪原甲藻與其共附生微生物的相互作用,本團隊其他成員正在利用獲得的菌株開展試驗研究。

    通過高通量測序技術(shù)首次解析了利瑪原甲藻PL11共附生微生物種類、豐度及多樣性信息,還通過分離純化獲得了純培養(yǎng)的PL11共附生細菌9株,對比發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)獲得的菌株種屬與高通量測序中相對豐度較高的種屬一致性不高,可能是菌株分離時的培養(yǎng)基、溫度等因素以及微生物自身的可培養(yǎng)性造成的影響。此結(jié)果對于深化對利瑪原甲藻共附生微生物多樣性的認識,指導(dǎo)其可培養(yǎng)共附生微生物的分離具有重要意義。

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