李月月,田曉清,韓清華,樊成奇,馬麗艷,陸亞男
(1.上海海洋大學(xué),上海 201306;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090)
原甲藻(Prorocentrum)是導(dǎo)致赤潮的重要生物之一,其代表產(chǎn)物大田軟海綿酸(okadaic acid,OA)及其結(jié)構(gòu)類似物鰭藻毒素-1(dinophysistoxin-1,DTX-1)是腹瀉性貝類毒素(diarrheic shellfish poisoning,DSP)的主要組分。腹瀉性貝類毒素引起的中毒事件具有全球性,自20世紀(jì)60年代以來(lái)在歐洲、亞洲、北美洲、南非等地都曾有報(bào)道[1],DSP不僅會(huì)危害海洋生態(tài)平衡,還會(huì)通過(guò)海洋食物鏈的富集威脅人類健康[2],同時(shí)也是蛋白磷酸酶2A、1和2B的有效抑制劑,可以導(dǎo)致人體消化系統(tǒng)中癌癥的發(fā)生[3]。而利瑪原甲藻(P.lima)是原甲藻屬甲藻中主要的產(chǎn)毒藻株,可以作為腹瀉性貝毒的穩(wěn)定性來(lái)源,因此利瑪原甲藻在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)一直是人們研究的熱點(diǎn)。然而直到目前,對(duì)于利瑪原甲藻產(chǎn)毒機(jī)制方面的研究仍較少。事實(shí)上,利瑪原甲藻中生物毒素的表達(dá)水平受營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的影響很大[4],但是包括環(huán)境微生物在內(nèi)的各種因素對(duì)其產(chǎn)毒的具體影響仍未有定論。雖然目前認(rèn)為利瑪原甲藻相關(guān)細(xì)菌并不能獨(dú)立產(chǎn)生毒素[5],但是很多學(xué)者認(rèn)為其對(duì)藻毒素的產(chǎn)生有著直接或間接的影響[6]。有研究表明,細(xì)菌可能對(duì)利瑪原甲藻細(xì)胞產(chǎn)生毒素有一定的協(xié)同作用,在利瑪原甲藻的衰老階段,產(chǎn)毒水平增加,這些細(xì)菌可能開始降解利瑪原甲藻細(xì)胞,會(huì)加速微藻的衰老,裂解作用可能會(huì)增加溶解有機(jī)碳的數(shù)量,這可能為增加毒素的產(chǎn)生提供更多的資源,從而促進(jìn)毒素的生成[1]。目前,關(guān)于細(xì)菌對(duì)利瑪原甲藻產(chǎn)毒的影響只進(jìn)行了初步的探索,它們之間的相互作用機(jī)制仍然需要更深入的研究。
本文以利瑪原甲藻藻株為研究材料,通過(guò)高通量測(cè)序及微生物純培養(yǎng)技術(shù),對(duì)利瑪原甲藻PL11可能的共附生菌群的多樣性進(jìn)行分析,包括其群落的組成以及相對(duì)豐度。并通過(guò)純培養(yǎng)的方法得到9株可培養(yǎng)細(xì)菌,以期為后期繼續(xù)研究細(xì)菌在微藻產(chǎn)毒過(guò)程中的作用提供必要的生物材料及基礎(chǔ)。
生物材料:利瑪原甲藻PL11。
試劑材料:Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司);16s引物(上海生工生物有限公司);PCR擴(kuò)增體系(康為世紀(jì));PBS緩沖液(上海生工生物有限公司)。
培養(yǎng)基:f/2培養(yǎng)基,2216E培養(yǎng)基。
實(shí)驗(yàn)儀器:高壓滅菌鍋:股海申安醫(yī)療器械廠,LDZX-75KBS型;大型恒溫培養(yǎng)箱:上?;瘜W(xué)儀器有限公司,ATB-032型;超凈工作臺(tái):北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司,DL-CJ-INDII型;臺(tái)式高速離心機(jī):湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司,H-1560型;超聲儀:上海漢克科學(xué)儀器有限公司,SK250LH型;PCR儀:杭州朗基科學(xué)儀器有限公司,AG-22331型;凝膠成像系統(tǒng):上海天能科技有限公司,GIS-1600型。超純水儀:上海智巖科學(xué)儀器有限公司,Milli-QAdvantage型。
1.2.1 藻培養(yǎng)
利瑪原甲藻采用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。f/2培養(yǎng)基由4種儲(chǔ)備液配制而成,分別為75.0 g·L-1NaNO3溶液、5.0 g·L-1NaH2PO4·H2O溶液、L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution。其中 NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O、L1 Trace Metal Solution以超純水配制后,高溫滅菌放入4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆?;Vitamin Solution以高溫滅菌后的超純水配制備用。L1 Trace Metal Solution和Vitamin Solution為混合溶液,具體配方見(jiàn)表1。
f/2培養(yǎng)基配制過(guò)程如下:將超純水用鹽鹵將其鹽度調(diào)至23,分別加入1 mL NaNO3溶液、NaH2PO4·H2O溶液以及L1 Trace Metal Solution,高壓滅菌鍋高溫滅菌30 min(120℃),冷卻至20℃加入0.5 mL Vitamin Solution。利瑪原甲藻的培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為4 500~5 000 lx,光照周期為12L/12D,溫度為24℃。
表1 f/2培養(yǎng)基配方Tab.1 Medium formula of f/2
1.2.2 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析
實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)藻的密度達(dá)到1×106個(gè)·L-1后,取50 mL藻液于無(wú)菌離心管中,離心(轉(zhuǎn)速6 000 r·min-1,時(shí)間 5min),收集藻細(xì)胞,以 30 mL pH 7.2的PBS緩沖液洗滌藻細(xì)胞,重復(fù)4次放置備用。藻共附生菌總基因組DNA以Stool DNA Kit試劑盒(美國(guó)OMEGA)提取,取1mL以擴(kuò)增引物338F和806R進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,下游引物 為 806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′[7]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:模板 DNA:10 ng,BSA:0.2μL,DNA多聚酶:0.4μL,5×FastPfu緩沖液:4μL,2.5 mmol·L-1dNTPs:2μL,上游引物(5μmol·L-1):0.8μL,下游引物(5μmol·L-1):0.8μL,加入滅菌后的超純水使總體積達(dá)到50μL。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性時(shí)間5 min(95℃),進(jìn)入循環(huán),變性時(shí)間40 s(95℃),退火時(shí)間40 s(55℃),延伸時(shí)間60 s(72℃),循環(huán)30次,最后延伸15 min(72℃)。通過(guò)電泳來(lái)檢驗(yàn)PCR完成的產(chǎn)物是否合格,如條帶清晰,無(wú)降解則符合后續(xù)測(cè)序要求。如條帶不清晰或未出現(xiàn),則重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增,若再次擴(kuò)增后仍沒(méi)出現(xiàn)清晰的條帶則要重新提取?;厥誔CR產(chǎn)物樣品進(jìn)行Illumina Miseq高通量測(cè)序(上海美吉生物公司)。
數(shù)據(jù)質(zhì)控:根據(jù)paired-end reads之間的互相重疊進(jìn)行序列拼接,對(duì)reads的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控分析[8],具體操作如下:以 FLASH對(duì)每個(gè)樣品的讀長(zhǎng)進(jìn)行拼接,得到原始連接數(shù)據(jù)(raw tags),對(duì)原始連接數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的過(guò)濾以得到高質(zhì)量的連接數(shù)據(jù)(clean tags);后續(xù)進(jìn)行tags截取,截取質(zhì)量閾值為≤19,堿基數(shù)默認(rèn)長(zhǎng)度為3,得到tags數(shù)據(jù)集,過(guò)濾掉連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于tags長(zhǎng)度75% 的 tags。最后進(jìn)行去除嵌合體序列的處理,通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì),移除掉Chimera序列,得到有效數(shù)據(jù)(effective tags)[9]。
數(shù)據(jù)分析:按照序列間的距離進(jìn)行聚類分析,從中選取與代表序列相似度大于97%的序列生成操作分類單元(OTU)。選取Silva作為細(xì)菌16SrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)、RDP、Greengene為功能基因數(shù)據(jù)庫(kù),使用Qiime平臺(tái)與 RDP Classifier分別作為計(jì)算軟件及算法,設(shè)定0.7為置信度閾值[10]。菌落豐富度(community richness)指數(shù)分別為Chao和ACE;菌落多樣性(community diversity)指數(shù)為Shannon以及 Simpson。稀釋曲線(rarefaction curve)采用對(duì)序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法,以抽到的序列數(shù)與它們對(duì)應(yīng)的物種(如OTU)數(shù)目或多樣性指數(shù)來(lái)構(gòu)建。
1.2.3 可培養(yǎng)共附生菌株的分離及鑒定
取1.5 mL藻液(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)于2 mL的EP管中,離心(轉(zhuǎn)速 6 000 r·min-1,5 min)。棄去上清液,加入1.5 mL無(wú)菌超純水輕輕震蕩混勻,重復(fù)離心一次,棄上清液加入1.5 mL無(wú)菌超純水震蕩混勻,冰浴下超聲波破碎藻細(xì)胞處理10 min,然后用滅菌超純水將其稀釋10倍,分別取200μL破碎藻細(xì)胞原液與稀釋后的藻液均勻的涂布在2216E平板培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)48 h,期間不斷進(jìn)行觀察,待培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出單菌落后,在2216E平板培養(yǎng)基上再次進(jìn)行劃線純化,徹底純化后的單菌落接種到固體斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)48 h后接種到2216E液體培養(yǎng)基中并放入搖床中培養(yǎng)48 h(23℃)[10-11]。
16S rRNA測(cè)序及比對(duì):使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(日本 TaKaRa)提取基因組DNA,按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)步驟:取1 mL菌液至1.5 mL無(wú)菌離心管中,離心(轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1,時(shí)間 1 min),棄上清收集菌體。加入180μL溶菌酶溶液重懸菌液,37℃水浴30~60 min,再加入400μL Buffer Digestion,震蕩混勻,65℃水浴1 h。加入200μL Buffer PB,充分混勻,-20℃放置5 min后離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1,時(shí)間5 min),將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入1 mL異丙醇,充分混勻后離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1,時(shí)間 5 min),棄上清。加入 1 mL 75%乙醇,離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1,時(shí)間2 min),棄上清。打開離心管的蓋子倒置5~10 min使乙醇完全揮發(fā),得到所需DNA。加入50 μL TE Buffer溶解DNA,以16S rRNA擴(kuò)增通用引物27F及1492R進(jìn)行擴(kuò)增,其序列分別為上游引物 27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;下游引物 1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增體系包括:23μL的 2×TaqPCR MasterMix:,1μL上游引物,1μL下游引物,5μL模板DNA,20μL去離子水[10]。PCR擴(kuò)增程序如下:預(yù)變性時(shí)間4 min(95℃),進(jìn)入循環(huán),變性時(shí)間40 s(95℃),退火時(shí)間40 s(57℃),延伸時(shí)間2 min(72℃),循環(huán) 40次,最后延伸 10 min(72℃)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行電泳?;厥諛悠愤M(jìn)行基因測(cè)序(上海美吉生物公司),對(duì)獲得的16SrRNA基因序列進(jìn)行分析,通過(guò)EzBioCloud進(jìn)行菌株序列同源性對(duì)比,建立菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(MEGA軟件)[7]。
利瑪原甲藻PL11共附生微生物的測(cè)序結(jié)果如表2所示,通過(guò)高通量測(cè)序一共獲得42 065條序列。稀釋曲線(rarefaction curve)可以用來(lái)比較測(cè)序樣本中物種的豐富度、均一性或多樣性,也可以用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理[12]。以Shannon為多樣性指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線(圖1),樣品的曲線逐漸趨向水平,說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量已經(jīng)足夠大,可以反映樣品中的物種多樣性,樣本的測(cè)序數(shù)量是合理的。
表2 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測(cè)序樣本信息表Tab.2 Summary of the high-throughput sequencing sample from P.lima PL11
圖1 利瑪原甲藻PL11共附生菌群高通量測(cè)序樣品Shannon-Wiener曲線Fig.1 Shannon-Wiener curve of the sequencing sample from P.lima PL11
MiSeq高通量測(cè)序結(jié)果顯示,利瑪原甲藻PL11共附生菌群共68個(gè)OTU,包括5門,14綱,26目,38科及54屬。PL11共附生菌群屬水平相對(duì)豐度分布如圖2所示。其中優(yōu)勢(shì)門(>5%)3個(gè),包括變形菌門(Proteobacteria,75.5%)、擬桿菌門(Bacteriodetes,11.5%)以及浮霉菌門(Planctomycetex,8.5%)。優(yōu)勢(shì)綱(>5%)4個(gè),包括 α-變形菌綱(Alphaproteobacteria,51.7%)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria,31.8%)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria,9.9%)以及 OM190綱(8.9%);優(yōu)勢(shì)屬(>5%)6個(gè),包括侏囊菌科下未 知 屬 (norank Nannocystaceae,21.8%)、Pyruvatibacter屬(11.6%)、Phaeodactylibacter屬(9.4%)、生絲單胞菌科下未知屬(norank Hyphomonadaceae,8.5%)、OM190綱下未知屬(8.1%)以及Roseovarius屬(7.9%)。用MEGA6建立的利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見(jiàn)圖3。
從利瑪原甲藻PL11培養(yǎng)物中分離出了9株細(xì)菌,用MEGA6建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見(jiàn)圖4,通過(guò)序列同源性比對(duì)(表3)以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的結(jié)果顯示,這些菌株分屬于8個(gè)屬,如表3所示,分 別 為Ochrobactrumsp.(2株)及Microbacteriumsp.、Algoriphagussp.、Ponticoccussp.、Hoefleasp.、Labrenziasp.、Erythrobactersp.、Sphingopyxissp.各1株。其中,菌株P(guān)L11-1與已知菌株的16S rRNA基因同源性最高值為97.55%,說(shuō)明其為Ponticoccus屬潛在新種,其多相分類學(xué)鑒定分析目前正在進(jìn)行中。
圖3 利瑪原甲藻PL11共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial community associated with P.lima PL11
表3 菌株種屬的分類結(jié)果Tab.3 Classification results of strain species
圖4 基于16Sr RNA序列構(gòu)建的可培養(yǎng)共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis of 16S r RNA sequences
細(xì)菌和浮游植物之間的相互作用越來(lái)越多地被認(rèn)為是毒素產(chǎn)生和赤潮發(fā)生的重要因素[13],了解毒素的產(chǎn)生機(jī)制有利用解決其對(duì)環(huán)境以及人類健康產(chǎn)生的危害,藻菌之間的相互作用關(guān)系是了解毒素產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高通量測(cè)序技術(shù)不經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)微生物就可以分析微生物群落的多樣性,從而為優(yōu)化利瑪原甲藻共附生微生物的分離并增加其可培養(yǎng)性帶來(lái)有價(jià)值的參考。本文利用MiSeq高通量測(cè)序首次對(duì)利瑪原甲藻PL11共附生菌群多樣性進(jìn)行了分析。從獲得的68個(gè)OTU中歸類出54個(gè)屬,其優(yōu)勢(shì)屬6個(gè)。先前電子顯微鏡觀察研究表明,在無(wú)菌培養(yǎng)的利瑪原甲藻細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到細(xì)菌。通過(guò)高通量測(cè)序可以清楚的看到利瑪原甲藻PL11具有豐富且多樣的微生物群落。
此外,基于微生物純培養(yǎng)技術(shù)從利瑪原甲藻PL11中分離獲得9株細(xì)菌,包括一株潛在新株P(guān)L11-1。PL11-1屬于玫瑰桿菌簇,紅桿菌科,Ponticoccus屬;Poncticoccussp.與藻類赤潮爆發(fā)關(guān)系密切,TAN等[14]等發(fā)現(xiàn)Ponticoccus屬下一株菌在發(fā)生赤潮時(shí)能與藻類相互作用,表現(xiàn)出一定的主導(dǎo)作用。Ponticoccussp.PD-2是首次發(fā)現(xiàn)的有群體感應(yīng)的菌株,它對(duì)多種赤潮藻的生長(zhǎng)都能產(chǎn)生抑制作用[15]。從利瑪原甲藻PL11中得到的PL11-1可能與利瑪原甲藻生長(zhǎng)和產(chǎn)毒都有著密切的關(guān)系。fan3-1屬于鞘氨醇單胞菌(Sphingopyxissp.),鞘氨醇單胞菌可以降解微囊藻毒素,通常情況下同一株菌只能降解一種藻毒素,Sphingopyxis屬下一株菌卻能夠同時(shí)降解 MCYR、MC-LR和 MC-RR 3種毒素[16]。進(jìn)一步研究Ponticoccus屬下PL11-1與Sphingopyxis屬下fan3-1和利瑪原甲藻之間的相互作用關(guān)系,可以更好地了解利瑪原甲藻產(chǎn)毒或毒素降解的機(jī)理。關(guān)于利瑪原甲藻與其共附生微生物的相互作用,本團(tuán)隊(duì)其他成員正在利用獲得的菌株開展試驗(yàn)研究。
通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)首次解析了利瑪原甲藻PL11共附生微生物種類、豐度及多樣性信息,還通過(guò)分離純化獲得了純培養(yǎng)的PL11共附生細(xì)菌9株,對(duì)比發(fā)現(xiàn)純培養(yǎng)獲得的菌株種屬與高通量測(cè)序中相對(duì)豐度較高的種屬一致性不高,可能是菌株分離時(shí)的培養(yǎng)基、溫度等因素以及微生物自身的可培養(yǎng)性造成的影響。此結(jié)果對(duì)于深化對(duì)利瑪原甲藻共附生微生物多樣性的認(rèn)識(shí),指導(dǎo)其可培養(yǎng)共附生微生物的分離具有重要意義。