四指馬鲅泌尿系統(tǒng)胚后發(fā)育組織學研究

藍軍南，李俊偉，區(qū)又君，溫久福，李加兒，李 活，周 慧

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣州 510300；2.上海海洋大學，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，海洋動物系統(tǒng)分類與進化上海高校重點實驗室，上海 201306；3.茂名市金陽熱帶海珍養(yǎng)殖有限公司，廣東茂名 525444）

脊椎動物泌尿系統(tǒng)的主要器官是腎臟，其功能單位可以清除代謝廢物，維持體液滲透壓平衡，稱為腎單位，其中的腎小球與血管系統(tǒng)相結(jié)合，起血液濾過作用［1］。在哺乳動物中，胚胎發(fā)生過程中有3種逐漸復雜的腎臟結(jié)構(gòu)（前腎、中腎和后腎），而魚類只有前腎和中腎發(fā)育［2-3］。前腎是脊椎動物首先形成的泌尿器官，隨后中腎才開始發(fā)育形成［4］。前腎在魚類自由游動的胚胎中起著滲透調(diào)節(jié)作用，其功能齊全對存活至關(guān)重要［2］。研究表明，斑馬魚（Barchydanioreriovar.）在10 dpf（days post fertilization）從仔稚魚向幼魚過渡，這涉及到許多器官和組織的變化，包括鱗片和鰭的形成，性腺、腸道和神經(jīng)系統(tǒng)的重塑，中腎同樣在這一時期出現(xiàn)，是為了應對體質(zhì)量增加帶來的更高的滲透調(diào)節(jié)需求［5-7］。中腎的發(fā)生和發(fā)育遵循一種立體的典型模式：間充質(zhì)細胞團上皮化形成腎小泡并與集合管相接合，并通過S形小體期延長發(fā)育成一個新的腎單位［8］。近年來中國學者對淡水魚類的泌尿系統(tǒng)研究較多，如南方鯰（Silurusmeridionalis）［9］、西藏墨頭魚（Garrakempihora）［10］、貝氏高原鰍（Triplophysa bleekeri）［11］、紅唇薄鰍（Leptobotiarubrilaris）［12］、大鱗副泥鰍（Paramisgurnusdabryanus）［13］等，而海水魚類僅卵形鯧鲹（Trachinotusovatus）［14］等少數(shù)魚類有相關(guān)報道。研究魚類腎臟乃至泌尿系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)及發(fā)育對了解其排泄與滲透壓調(diào)節(jié)具有重要意義。

四指馬鲅（Eleutheronematetradactylum）隸屬于鯔形目，馬鲅亞目，馬鲅科，四指馬鲅屬，俗稱馬友、午魚、午筍等，廣泛分布于熱帶和溫帶海區(qū)，主要分布于印度洋和太平洋西部，在中國南海、東海、渤海、黃海均有分布［15-17］。其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，養(yǎng)殖前景廣闊。2012—2015年區(qū)又君等［18］對四指馬鲅進行規(guī)模化全人工繁育取得成功，并在粵、桂、閩、瓊、浙等沿海地區(qū)推廣養(yǎng)殖，現(xiàn)已成為海水魚類養(yǎng)殖的新品種。近年來對四指馬鲅的研究主要在胚胎發(fā)育、仔稚魚發(fā)育、消化系統(tǒng)發(fā)育、視網(wǎng)膜發(fā)育及環(huán)境脅迫等方面［19-24］，然而其泌尿系統(tǒng)胚后發(fā)育的相關(guān)研究在國內(nèi)外尚未見報道。本文應用石蠟組織連續(xù)切片和H-E染色技術(shù)對人工培育的四指馬鲅泌尿系統(tǒng)胚后發(fā)育進行研究，了解其組織形態(tài)發(fā)育及其結(jié)構(gòu)特征，以豐富四指馬鲅的基礎(chǔ)生物學資料，為闡明四指馬鲅的排泄及滲透壓調(diào)節(jié)特點提供理論依據(jù)，從而為苗種培育和淡化養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的四指馬鲅魚苗為2018年6—9月課題組在南海水產(chǎn)研究所珠海試驗基地培育所得。

1.2 實驗方法

魚苗孵化及培育參考區(qū)又君等［18］的方法進行。在2 dph（days post hatching）將魚苗置于1 000 L白色塑料桶中培育，放苗前水桶中預先接種小球藻和輪蟲，每天添加淡水降低鹽度0.5～1，直到鹽度降至9.0±0.5，該鹽度為后期淡化養(yǎng)殖鹽度。培育水溫（28±2）℃。7 dph投喂枝角類和橈足類幼體，25 dph投喂鹵蟲無節(jié)幼體，30 dph投喂粉狀配合飼料并逐漸過渡到投喂人工顆粒飼料。1～18 dph，每天取樣一次，每次取15尾；20～50 dph，每5 d取樣一次，每次取15尾。取樣時記錄魚苗日齡并用數(shù)顯游標卡尺（精確度0.01 mm）測量全長，置于4%多聚甲醛通用型組織固定液（BL539A）中固定24 h后轉(zhuǎn)入70%的乙醇中保存。將固定好的樣品進行流水沖洗12 h，經(jīng)50%～100%梯度乙醇脫水（50%乙醇2 h、70%乙醇 4 h、80%乙醇 2 h、85%乙醇 2 h、95%乙醇45 min×2、100%乙醇45 min×2），二甲苯透明（無水乙醇和二甲苯體積各占1/2的混合液1 h、二甲苯15 min×2），浸蠟（石蠟2 h×2），石蠟包埋，以4～6μm的厚度進行縱向和橫向連續(xù)切片，蘇木精-伊紅（haematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹脂封片。制片后用ZEISS Axio Scope.A1型光學顯微鏡觀察并攝影記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 前腎

3 dph，可觀察到原腎管前端發(fā)生扭曲，是為前腎區(qū)域，3～4個前腎小管分散排列，管壁為立方上皮，細胞排列疏松，呈粉紅色，管徑較小，管間分布有少量著色較深的未分化干細胞（圖版Ⅰ-1）。7 dph，前腎左上方有淋巴樣組織形成，前腎小管數(shù)量增多，管徑增大，管壁細胞增厚，細胞界限不清晰，管腔上皮的游離面出現(xiàn)淡紅色刷狀緣，前腎小管間有較多的紅細胞填充（圖版Ⅰ-2）。15 dph，前腎后端及脊索腹面有較多的黑色素-巨噬細胞中心出現(xiàn)，淋巴組織往前腎小管周圍填充，管徑繼續(xù)增大，管壁細胞界限較清晰，核深染，發(fā)育中的前腎小管周圍有較多的紅細胞分布（圖版Ⅰ-3）。18 dph，前腎淋巴組織增多，淋巴類細胞填充小管間隙（圖版Ⅰ-4）。20 dph，前腎主要由淋巴組織和前腎小管組成，此時少數(shù)前腎小管開始模糊退化，表明泌尿機能開始衰退（圖版Ⅰ-5）。30 dph，大量的前腎小管出現(xiàn)結(jié)構(gòu)模糊或溶解的現(xiàn)象，部分前腎小管已經(jīng)退化，淋巴組織向內(nèi)填充（圖版Ⅰ-6）。未觀察到前腎在發(fā)育過程中有腎小球等腎單位結(jié)構(gòu)形成，在前腎小管退化之前主要由前腎小管行使泌尿功能。

2.2 中腎

4 dph，中腎區(qū)域僅觀察到原腎管，結(jié)構(gòu)簡單，周圍尚未有嗜堿性細胞等出現(xiàn)（圖版Ⅱ-1）。7～16 dph，中腎導管管壁細胞增厚，嗜堿性增強，細胞核深染，呈紫紅色；緊貼中腎導管由頭至尾先后出現(xiàn)若干嗜堿性致密的腎小管原基；導管背側(cè)紅細胞出現(xiàn)并逐漸增多；間充質(zhì)細胞零星分布；導管腹側(cè)出現(xiàn)較多的黑色素-巨噬細胞團（圖版Ⅱ-2）。20 dph，中腎前端已有3～5個腎小管形成，管壁細胞排列疏松，嗜堿性強，紫紅色，管間有較多的間充質(zhì)細胞分布；腎小管末端有嗜堿性細胞團聚集，形成內(nèi)生的細胞團，為早期腎小體；周圍有較多黑色素-巨噬細胞團分布（圖版Ⅱ-3）。25 dph，中腎后端也開始出現(xiàn)早期腎小體；腎小管背側(cè)有嗜堿性細胞團分布，類似生中腎細胞團，或?qū)⒎只纱渭壞I小管；腎小管芽垂直于中腎管向背側(cè)延伸彎曲，細胞高柱狀（圖版Ⅱ-4）。30 dph，中腎背側(cè)淋巴組織形成并向內(nèi)延伸；可觀察到亞成熟的腎小體，其腎小球增大，細胞嗜堿性減弱，核質(zhì)比減小，腎小囊與腎小球的間隙變小；腎小管數(shù)量明顯增多，基本布滿腎體；腎小管管壁細胞嗜堿性減弱，核質(zhì)比減小，呈紅色；近端小管與遠端小管開始有區(qū)分，近端小管管壁細胞其核多呈低柱狀或梭形，細胞緊密排列，管腔面具有濃密的強嗜伊紅的刷狀緣將管腔閉鎖；遠端小管管壁細胞其核多呈橢圓形，管腔面的纖毛已逐漸減少或已消失（圖版Ⅱ-5）；另外，遠端小管與集合管的結(jié)合處開始貫通，且周圍有較多紅細胞分布（圖版Ⅱ-6）。40 dph，中腎淋巴組織增多，從周圍慢慢向內(nèi)部填充；腎小管數(shù)量繼續(xù)增多，小管間有較多的淋巴類細胞分布；腎小體數(shù)量有所增加，開始在中腎內(nèi)部發(fā)育（圖版Ⅱ-7）。45 dph，腎小管數(shù)量繼續(xù)增加，其管壁細胞增厚，著色加深，小管間有較多的血竇分布，紅細胞聚集（圖版Ⅱ-8）；第一近端小管和第二近端小管開始區(qū)分，第一近端小管細胞高柱狀，嗜堿性較強，核質(zhì)比高，細胞界限不清楚，腔面具較厚的刷狀緣；第二近端小管細胞柱狀，嗜堿性較弱，核質(zhì)比較低，細胞界限較清晰，腔面刷狀緣較矮；二者與遠端小管對比明顯，管間由淋巴類細胞填充，分布有較多黑色素-巨噬細胞中心（圖版Ⅱ-9）。50 dph，淋巴組織及紅細胞充滿腎小管間隙（圖版Ⅱ-10）；腎小管管壁增厚，管徑增大；早期腎小體、亞成熟腎小體以及成熟腎小體分布于中腎邊緣或內(nèi)部，總數(shù)量并不多；第一近端小管、第二近端小管及遠端小管區(qū)分明顯，未觀察到第一遠端小管和第二遠端小管區(qū)分（圖版Ⅱ-11，12），此時中腎組織結(jié)構(gòu)與成魚相接近。

2.3 輸尿管和膀胱

4～7 dph，中腎區(qū)域僅觀察到原腎管，腎管逐漸增大，管壁細胞增高，未觀察到膀胱形成（圖版Ⅲ-1）。8～9 dph，腎管后端膨大形成原始膀胱，僅由1～2層細胞組成，是為典型的輸尿管膀胱（圖版Ⅲ-2）。18 dph，中腎管管壁增厚，外層有結(jié)締組織薄膜包裹，可稱輸尿管；膀胱緊貼后腸，內(nèi)腔增大，膀胱壁增厚，黏膜層形成，向腔面伸長（圖版Ⅲ-3）。30 dph，輸尿管管壁繼續(xù)增厚；膀胱壁由黏膜層、肌肉層和漿膜層組成，黏膜層為變移上皮，肌肉層明顯，漿膜層為結(jié)締組織（圖版Ⅲ-4）。50 dph，中腎后端可觀察到兩輸尿管并行后合二為一，后接膨大的膀胱。此時輸尿管管壁增厚，由2～3層立方上皮組成，肌肉層不明顯，漿膜層較厚，中間有小血管分布（圖版Ⅲ-5）。膀胱壁仍由黏膜層、肌肉層及漿膜層組成，各層均有明顯增厚（圖版Ⅲ-6）。

觀察發(fā)現(xiàn)，出膜早期仔稚魚主要以前腎行使泌尿機能，前腎管充當輸尿管；當前腎衰退，中腎形成后則以中腎管為輸尿管，始于中腎后端，并行向后合并膨大為典型的輸尿管膀胱。

3 討論

魚類新陳代謝產(chǎn)生的代謝廢物，特別是含氮化合物及各種鹽離子主要由泌尿系統(tǒng)排出體外，它是魚類維持生命活動不可或缺的重要系統(tǒng)。硬骨魚類泌尿系統(tǒng)主要包括前腎（胚胎及仔稚魚時期）、中腎及輸導管。腎臟是魚類泌尿系統(tǒng)的主要組成部分，具有維持水鹽平衡、造血、免疫以及分泌作用，是一個結(jié)構(gòu)復雜、功能多樣的器官。四指馬鲅的腎臟發(fā)育分前腎和中腎兩個階段，與貝氏高原鰍、大鱗副泥鰍等大多數(shù)硬骨魚類基本一致［11，13］。四指馬鲅在3 dph觀察到前腎小管已經(jīng)形成，中間有未分化的干細胞分布，后經(jīng)發(fā)育前腎小管增大，數(shù)量增多，干細胞分化形成各類型細胞及淋巴組織，表明其在胚胎時期及胚后早期前腎行使泌尿機能，這與南方鯰、卵形鯧鲹等多數(shù)魚類基本類似［14，25］。7 dph前腎小管腔面出現(xiàn)游離纖毛，表明前腎小管的泌尿機能有所增強。仔稚魚在發(fā)育過程中未觀察到前腎有腎小體或血管球等結(jié)構(gòu)形成，表明四指馬鲅在發(fā)育初期代謝廢物主要經(jīng)前腎管排出體外，故濾尿效能低下。然而鯰魚（Silurusasotus）和南方鯰在2 dph就形成前腎小體［25-26］，貝氏高原鰍在6～8 dph開始形成前腎小體［11］，可見淡水魚類前腎的泌尿機能在發(fā)育早期比海水魚類更高效，溫龍嵐等［11］認為可能是由于生長環(huán)境不同所致。四指馬鲅在20 dph前腎小管開始退化，不同的魚類其前腎管退化的時間差別較大，如卵形鯧鲹在14～15 dph 就 已 經(jīng) 開 始 退 化［27］， 草 魚（Ctenopharyngodonidellus）在 17 dph開始退化［28］，鱖 （Sinipercachuatsi）在 22 dph開始退化［29］，斜帶石斑魚（Epinepheluscoioides）則在 50 dph才開始退化［30］，前腎小管的退化和減少表明前腎開始由泌尿器官向免疫器官轉(zhuǎn)變，此時泌尿功能開始減弱，中腎逐漸行使泌尿功能。

魚類的中腎發(fā)育主要研究腎單位的發(fā)育過程，早在1991年 HENTSCHEL等［31］將軟骨魚類點紋斑竹鯊（Chiloscylliumpunctatum）亞成體的腎單位發(fā)育劃分為腎原基期、S形小體期、發(fā)育期和幼稚期4個階段；岳興建等［9］將南方鯰中腎發(fā)生發(fā)育過程分為間充質(zhì)細胞聚集、中腎小泡出現(xiàn)、腎小管芽形成、腎小體發(fā)生、初級腎單位形成、初級腎單位成熟及第二、三級腎單位發(fā)生等時期，把中腎腎單位的發(fā)育分為分化前期、分化期、發(fā)育期、成熟期4個時期；而溫龍嵐等［11］將貝氏高原鰍中腎單位的發(fā)生分為腎小管原基、腎小管芽、幼稚腎單位和亞成熟腎單位4個階段。腎小管在不同的時間點分化出功能上不同的節(jié)段，近端分為近曲小管（第一近端小管）和近直小管（第二近端小管）兩段，遠端分為遠端早期（第一遠端小管）和遠端晚期（第二遠端）兩段［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，7～16 dph，四指馬鲅中腎區(qū)由前至后先后形成腎小管原基；20～25 dph腎小管芽和早期腎小體（幼稚腎單位）形成；30 dph亞成熟腎小體形成，近端小管和遠端小管開始區(qū)分；45～50 dph，第一近端小管與第二近端小管開始區(qū)分，成熟腎小體開始形成。因而把四指馬鲅腎單位的發(fā)育分成腎小管原基、腎小管芽、早期腎單位、亞成熟腎單位、成熟腎單位等5個階段。與淡水魚類相比，四指馬鲅腎小體數(shù)量較少，主要分布在中腎邊緣區(qū)域。淡水魚處于低滲環(huán)境，主要通過腎臟將過多的水分排出體外，所以腎小體發(fā)達，排尿量也比較多；而四指馬鲅屬海水魚類，生活于高滲環(huán)境，需要不斷補水，必須減少排尿保留水分，因而腎小體數(shù)量較少［33］。直至50 dph，四指馬鲅中腎小管分化為第一近端小管、第二近端小管、遠端小管以及集合管4部分，尚未區(qū)分頸段、第一遠端小管和第二遠端小管等，與卵形鯧鲹、南方鯰、大鱗副泥鰍、西藏墨頭魚等結(jié)果類似［9-10，13-14］。該部位或本已缺失，需對成體中腎進行觀察驗證。此外，四指馬鲅中腎在發(fā)育過程中可觀察到較多的黑色素-巨噬細胞中心、淋巴細胞和紅細胞，因此推測四指馬鲅發(fā)育早期中腎兼具造血、免疫、滲透壓調(diào)節(jié)以及泌尿功能。

腎臟過濾的新陳代謝廢物由腎小管匯集到輸尿管，從而貯藏于膨大的膀胱便于排出體外。研究結(jié)果表明，四指馬鲅在出膜后早期，仔稚魚主要以前腎行使泌尿機能，前腎管充當輸尿管將廢物排出體外，膀胱尚未形成；當前腎衰退，中腎形成后則以中腎管為輸尿管，符合一般硬骨魚類的發(fā)育規(guī)律［33］。中腎管沿腎臟腹面偏兩側(cè)下行，沿途有集合管匯入，輸尿管始于腎臟后端，并行向后合并膨大為膀胱，屬典型的輸尿管膀胱，與紅唇薄鰍等大多數(shù)硬骨魚類一致［12］。輸尿管在發(fā)育過程中管壁和外被的結(jié)締組織不斷增厚，至50 dph肌肉層仍不明顯，僅由立方上皮和結(jié)締組織組成。膀胱壁先是一層上皮組織，后發(fā)育出黏膜層和漿膜層，至30 dph肌肉層明顯，往后各層均逐漸增厚。四指馬鲅膀胱的組織結(jié)構(gòu)與多數(shù)魚類一致，其發(fā)達程度較高，膀胱內(nèi)腔比短體副鰍（Paracobitispotanini）等淡水魚類要大，黏膜層變移上皮較明顯，表明其具有較強的重吸收能力［34］。

綜上所述，魚類泌尿系統(tǒng)的發(fā)育與其生長環(huán)境及生活習性相適應。本研究僅闡述了四指馬鲅泌尿系統(tǒng)發(fā)育的一般規(guī)律，亟待進一步研究不同環(huán)境條件對四指馬鲅泌尿系統(tǒng)排泄及滲透壓調(diào)節(jié)功能的影響，以揭示養(yǎng)殖過程中病態(tài)多發(fā)的原因是否與之有關(guān)，這對指導苗種培育、淡化馴養(yǎng)及工廠化健康養(yǎng)殖具有重要意義。

圖版Ⅰ 四指馬鲅前腎胚后發(fā)育PlateⅠ The postembryonic development of pronephros in E.tetradactylum

圖版Ⅱ 四指馬鲅中腎胚后發(fā)育PlateⅡ The postembryonic development of mesonephros in E.tetradactylum

圖版Ⅲ 四指馬鲅輸尿管和膀胱胚后發(fā)育Plate 3 The postembryonic development of ureter and urinary bladder in E.tetradactylum