副豬嗜血桿菌流行病學(xué)調(diào)查及兩株分離株耐藥性和致病性分析

邱文彬，于 江，張玉玉，沈文慧，楊 杰，陳 智，孫文博，陳 蕾，張 凡，張麗麗，楊桂文*，吳家強(qiáng)*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟(jì)南250100；3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250100；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；5.煙臺市牟平區(qū)動物疫病預(yù)防與控制中心，山東 煙臺 264100)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是一種革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴性，常引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎以及腦膜炎等癥狀[1]。該病的發(fā)病率通常為10%～15%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)40%，死亡率可高達(dá)50%[2-4]。另外，由于病毒性疾病的入侵和流行造成豬群免疫力下降，免疫抑制性的疾病(如豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等)經(jīng)常與HPS發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，使疾病的預(yù)防與治療變得更為復(fù)雜，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。

按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)血清分型法, 目前可將HPS分為15個(gè)血清型,另有約15.2%～41%的菌株不能分型。HPS在世界各國流行的血清型不盡相同，不同血清型的HPS毒力也有很大差異，引起豬的臨床癥狀亦有差別[7-11]。

目前已有對HPS敏感性藥物的篩選及耐藥性的相關(guān)研究，不同菌株的藥物敏感性各有差異[12-16]。劉德成進(jìn)行的特定菌株牛津杯藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明HPS分離株對乳酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考敏感性高，對頭孢噻呋鈉、氨芐西林、阿莫西林產(chǎn)生了耐藥性[12]。魏海林等研究發(fā)現(xiàn)HPS分離株對阿莫西林(56.7%)、氨芐西林(63.9%)、青霉素(74.2%)產(chǎn)生了較高的耐藥性[13]。由此可見該菌極易產(chǎn)生耐藥性，而且不同分離株之間也有差異，抗生素治療方案面臨諸多問題。

本研究采用細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)合PCR鑒定的方法對2016-2018年山東省12個(gè)地區(qū)送檢的103個(gè)發(fā)病豬的病料進(jìn)行HPS的分離鑒定，并進(jìn)一步確定其血清型，同時(shí)分析該病的發(fā)生與季節(jié)和豬日齡的關(guān)系，以了解副豬嗜血桿菌病的流行情況。通過對HPS分離株LZ株和LC株的培養(yǎng)特性觀察、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)以及動物攻毒試驗(yàn)，確定其最小發(fā)病劑量，為該病疫苗研制和防治提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 2016年-2018年山東省12個(gè)地區(qū)(包括聊城、淄博、濰坊、臨沂、萊蕪等)送檢發(fā)病豬的病料(包括肺臟、血液、心包液、關(guān)節(jié)液等)，共103份。來自山東省臨淄、聊城兩個(gè)大型養(yǎng)豬場的HPS分離株分別被命名為LZ株和LC株。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)為美國BD公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)為Sigma公司產(chǎn)品；新生牛血清購自濟(jì)南勁牛公司；微量生化鑒定試劑和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；HPS標(biāo)準(zhǔn)菌株及陽性血清、金黃色葡萄球菌由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000購自大連寶生物工程有限公司。恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物 3～4周齡健康易感仔豬購自山東省濱州市某豬場。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采集疑似副豬嗜血桿菌病的發(fā)病豬病料(肺臟、血液、心包液、關(guān)節(jié)液等)，接種于TSA培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察細(xì)菌菌落特征，挑取圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠樣菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，將鏡檢為可疑的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)特性試驗(yàn) 將分離菌分別水平劃線接種于鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板，再挑取金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線接種，37 ℃培養(yǎng)后觀察細(xì)菌生長狀況。將分離菌分別接種于含0.001% NAD的鮮血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)后觀察有無溶血現(xiàn)象。

1.2.3 生化鑒定試驗(yàn) 挑取具有“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”且不溶血的單菌落純化培養(yǎng)后，接種于含NAD的硝酸鹽還原、氧化酶、接觸酶、吲哚、蔗糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖、甘露醇等微量生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)，觀察其生化特性。

1.2.4 PCR鑒定 采用直接煮沸法從HPS分離株培養(yǎng)物中提取DNA[17]，根據(jù)Oliveira等[18]報(bào)道合成1對特異引物，上游引物為5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′，下游引物為5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′,該引物擴(kuò)增編碼16SrRNA長度約為822 bp，由上海生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增方法按文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。

1.2.5 血清學(xué)鑒定 根據(jù)蔡旭旺[17]方法制備各分離菌株的血清學(xué)分型抗原，以各血清型標(biāo)準(zhǔn)血清對各分離株進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，以確定各分離株的血清型。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 將HPS LZ株和LC株的純培養(yǎng)物制成菌懸液，用滅菌棉簽均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，選取多種抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48 h，測量抑菌環(huán)直徑。

1.2.7 動物攻毒試驗(yàn) 將HPS LZ株和LC株密集劃線接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，將菌液涂布于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)20～24 h后，收集細(xì)菌并將菌液的活菌數(shù)調(diào)整為約3.0×109CFU/mL。參照蔡旭旺的研究結(jié)果[20]，采用腹腔注射攻毒，應(yīng)用4個(gè)攻毒劑量進(jìn)行動物攻毒試驗(yàn)。選取3～4周齡健康易感仔豬90頭，隨機(jī)分成9組，每組10頭，4個(gè)組別分別以1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL 4個(gè)不同劑量腹腔注射LZ株菌液(約3.0×109CFU/mL)和LC株菌液(約3.0×109CFU/mL)，另外1組腹腔注射PBS 2.5 mL作為對照。連續(xù)觀察2周，記錄各組動物體溫變化和臨床表現(xiàn)，剖檢后觀察病理變化。同時(shí)取病變組織接種培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離及PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 山東地區(qū)副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)調(diào)查和血清型鑒定結(jié)果

共分離獲得29株HPS分離株。采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對29株HPS分離株進(jìn)行血清學(xué)分型，結(jié)果如表1所示，28株分離菌株可以確定血清型，1株不與15種血清型當(dāng)中任何血清型發(fā)生反應(yīng)。血清學(xué)分型結(jié)果顯示，在山東省以血清4型(27.6%)和5型(20.7%)最為流行，其次是血清1型(13.8%)、12型(13.8%)、13型(10.3%)，而血清2、10、14型各分離到1株，血清3、6、7、8、9、11、15型目前尚未分離到菌株。來自山東臨淄、聊城兩個(gè)大型養(yǎng)豬場的LZ株和LC株的血清型分別為血清型5型和1型。

統(tǒng)計(jì)顯示發(fā)病時(shí)間主要集中于每年的3、4、10、11月份(表2)，發(fā)病豬中有8例日齡為0～30 d，18例日齡為31～50 d，3例日齡為51～80 d。

表1 HPS分離菌株血清型鑒定結(jié)果Table 1 Results of serotype of HPS strains identified

注：陽性率=(陽性數(shù)/分離株數(shù))×100%。下同。

Note：Positive rate = (number of positive isolates / total number of isolates) × 100%.The same below.

表2 不同月份HPS分離菌株的檢出情況Table 2 The detection of HPS strains identified

2.2 分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

用HPS特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從菌液和病豬組織中均獲得了長度為822 bp的DNA片段，與試驗(yàn)預(yù)期吻合(圖1)。PCR產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行測序，所得序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，同源性達(dá)到98%以上。可確定29株分離株均為HPS。

2.3 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

分離株在TSA固體培養(yǎng)基上，可長出較多的圓形、光滑濕潤、無色透明的露珠狀小菌落(圖2)。取上述菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢觀察，細(xì)菌為革蘭氏陰性的細(xì)小桿菌，呈球桿狀、短桿狀、長桿狀、間或絲狀等多種形態(tài)(圖2)。

2.4 培養(yǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果

LZ株和LC株在鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板上均不生長，但在鮮血瓊脂平板上與金黃色葡萄球菌同時(shí)培養(yǎng)時(shí)，均在金黃色葡萄球菌線兩側(cè)長出針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落，呈現(xiàn)出“衛(wèi)星生長現(xiàn)象”。在含NAD的鮮血瓊脂平板上也可形成灰白色透明、針尖大小且不溶血的微小菌落。

2.5 生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明LZ株和LC株對硝酸鹽還原、接觸酶、葡萄糖、果糖的發(fā)酵結(jié)果均為陽性；對吲哚、氧化酶、甘露醇的發(fā)酵結(jié)果均為陰性。其余發(fā)酵結(jié)果均為部分陽性。該試驗(yàn)結(jié)果表明LZ株和LC株均符合HPS的生化特性。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示多種抗生素可使LZ株和LC株產(chǎn)生抑菌環(huán)(圖3)，其中LZ株對青霉素類、頭孢類等藥物高度敏感，對慶大霉素、卡那霉素等中度敏感，對林可霉素、鏈霉素低度敏感；LC株對青霉素類、頭孢類等藥物高度敏感，對慶大霉素、林可霉素等中度敏感，對卡那霉素、鏈霉素低度敏感(表3)。

2.7 動物攻毒試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 攻毒仔豬的臨床癥狀 用不同劑量的LZ株和LC株對仔豬分別攻毒后，大部分仔豬體溫在攻毒第2日或第3日開始升高，持續(xù)2～5 d后，體溫逐漸恢復(fù)正常(圖4)。HPS的攻毒劑量越大，試驗(yàn)豬的最高體溫越高，死亡越快。對照組仔豬體溫均正常。攻毒后的大部分仔豬不同程度地出現(xiàn)被毛粗亂、精神不振、食欲減退等癥狀，部分攻毒仔豬還伴有咳嗽、嘔吐，以及后肢膝關(guān)節(jié)腫脹、右后肢跛行、臥地不起、臨死前側(cè)臥轉(zhuǎn)圈或前肢呈劃水樣等臨床癥狀(表4)。向仔豬注射相同攻毒劑量的LZ株和LC株菌液后，注射LZ株菌液的仔豬發(fā)病更早，并且死亡率更高。

表3 常見抗生素對HPS LZ株和LC株的抑菌圈大小Table 3 Inhibition circle size of common antibiotics against HPS LZ strain and LC strain mm

2.7.2 攻毒仔豬體內(nèi)HPS的分離鑒定 取發(fā)病死亡仔豬的心包積液、胸腔積液、腹腔積液和心血分別接種于TSA培養(yǎng)基上，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24～48 h后，長出菌落后經(jīng)革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌。經(jīng)PCR鑒定，從攻毒后發(fā)病豬分離出的細(xì)菌分別與LZ株和LC株一致，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖5。

2.7.3 攻毒仔豬的病理特征及不同濃度菌液的致病率比較 LZ株和LC株均能引起嚴(yán)重的纖維素性滲出，解剖發(fā)病豬可見經(jīng)典的“絨毛心”和腹膜炎癥狀(圖6)，除此之外部分發(fā)病豬還出現(xiàn)心臟和肺臟粘連、淋巴結(jié)腫大、腹腔粘連、關(guān)節(jié)液增多、肺臟出血、腦膜出血、腦膜炎、漿膜炎、胸腔和心包內(nèi)積液且渾濁、肺臟肉變、肺臟表面有出血點(diǎn)、心臟表面或胸腹腔內(nèi)有纖維素性滲出物、關(guān)節(jié)液增多等病理特征。不同劑量LZ株和LC株對仔豬進(jìn)行攻毒，其發(fā)病率和死亡率見表5。試驗(yàn)仔豬的發(fā)病率和死亡率隨著HPS攻毒劑量的加大而增高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，LZ株選用1.5 mL菌液(約3.0×109CFU/mL)進(jìn)行攻毒可使100%仔豬發(fā)病，LC株選用2.0 mL菌液(約3.0×109CFU/mL)進(jìn)行攻毒可使100%仔豬發(fā)病。

表4 LZ株、LC株不同攻毒劑量仔豬的臨床癥狀Table 4 Clinical symptom of piglets injected with different doses of LZ and LC strains

圖5攻毒發(fā)病豬分離的細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果
M.DL2000 DNA Marker；1～5.LZ株攻毒；
8～12.LC株攻毒；6.陰性對照；7.陽性對照
Fig. 5 PCR identification of bacteria isolated from infected pigs
M.DL2000 DNA Marker; 1～5.Infected with LZ strains;
8～12.Infected with LC strains; 6.Negative control;
7.Positive control

圖6LZ株和LC株引起的剖檢變化
A，C.胸膜炎和絨毛心；B,D.腹膜炎
Fig. 6 Changes in necropsy caused by LZ and LC strains
A，C. Pleurisy and villus heart; B, D. Peritonitis

因此，本次動物攻毒試驗(yàn)中，LZ株菌液的最小發(fā)病量為4.5×109CFU，LC株菌液的最小發(fā)病量為6.0×109CFU。

3 討 論

副豬嗜血桿菌病為危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，在世界范圍內(nèi)引起了廣泛重視。本研究對103份疑似病料進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示HPS的分離率約為28.16%。不同地域和養(yǎng)殖環(huán)境中，HPS的各種血清型的流行情況也不盡相同，雖然流行情況各有差異，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明4型和5型HPS最為流行[6,17]。本研究確定了當(dāng)前山東地區(qū)流行的HPS主要是血清4型和5型，其次是1、12型，說明目前該病的血清型流行情況相對穩(wěn)定。

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在菌，正常條件下不致病，但在斷奶、通風(fēng)不良、氣溫劇變、混群、長途運(yùn)輸?shù)雀鞣N應(yīng)激因素的作用下，破壞其上呼吸道的防御機(jī)制，引起上呼吸道粘膜的損傷，從而導(dǎo)致敏感豬發(fā)生全身感染。該病一年四季均可發(fā)生，但在早春(3、4月份)和深秋(10、11月份)由于晝夜溫差大及通風(fēng)不良等原因，更易暴發(fā)流行。副豬嗜血桿菌易感2周齡到4月齡的豬，但以5～8周齡的斷奶保育仔豬最為多見。本研究也發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬多集中于31～50日齡，這與仔豬的早期斷奶養(yǎng)殖模式及其母源抗體的消長規(guī)律有關(guān)。

抗生素的不合理使用以及抗菌藥物的選擇壓力等因素加重了細(xì)菌的耐藥性[21]，據(jù)國內(nèi)外研究表明，HPS耐藥性廣泛，對不同藥物的敏感性亦有地域性差異。大多數(shù)HPS已經(jīng)對林可霉素、四環(huán)素和紅霉素產(chǎn)生抗性[22]。劉玉英[14]的研究結(jié)果表明HPS對氯霉素和頭孢噻柄敏感,對阿莫西林和氨芐青霉素等產(chǎn)生了耐藥性。Martín de la Fuente等[15]的研究結(jié)果表明所有英國HPS分離株均對青霉素、頭孢噻呋、紅霉素、替米考星、恩諾沙星和氟苯尼考敏感，所有西班牙分離株僅對氟苯尼考敏感，對青霉素等耐藥率較高。Zhou等[23]對此也進(jìn)行過研究報(bào)道，HPS對恩諾沙星產(chǎn)生抗性，對頭孢噻肟、頭孢噻呋、阿奇霉素、氯霉素、氟苯尼考和替米考星等敏感，可用于副豬嗜血桿菌病的治療。Aarestrup等[16]進(jìn)行耐藥性研究試驗(yàn)中的所有HPS分離株均對氨芐西林、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、紅霉素等沒有抗性，其中兩種分離株對甲氧芐氨嘧啶+磺胺甲惡唑有耐藥性，部分分離株對環(huán)丙沙星和TMP+磺胺甲惡唑的敏感性降低。另外，Sun等[24]發(fā)現(xiàn)馬波沙星對HPS具有抗菌活性，并測定了198株HPS分離株的最小抑菌濃度(MIC50為2 mg/L，MIC90為8 mg/L)。本研究中，LZ株和LC株均對青霉素類、頭孢類等藥物敏感性高，LZ株對林可霉素、鏈霉素敏感性低，LC株對卡那霉素、鏈霉素低敏，菌株耐藥性與上述研究結(jié)果部分吻合，但亦有差異，為HPS不同菌株的防治提供了依據(jù)?？股胤N類繁多，HPS各菌株對不同種類抗生素的耐藥性差異較大，而且同一種菌株的耐藥性也會發(fā)生變化，因此對HPS菌株的耐藥性進(jìn)行及時(shí)、廣泛和精準(zhǔn)的檢測對副豬嗜血桿菌病的治療尤為重要。

表5 LZ株、LC株不同攻毒劑量仔豬的發(fā)病和死亡情況Table 5 Incidence and mortality of piglets injected with different doses of LZ and LC strains

注：a.出現(xiàn)食欲減退、精神沉郁、咳嗽、呼吸困難和被毛粗亂等臨床癥狀；b.體溫升高0.5 ℃以上，并持續(xù)2～5 d；c.剖檢出現(xiàn)心包積液、腹水增多、胸腔或腹腔內(nèi)有纖維素性滲出物，肺臟出血或肉變、淋巴結(jié)腫大、后肢關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液增多等病理變化。

Note：a. indicates that the attacked pig has clinical symptoms such as anorexia，mental depression，cough，dyspnea and the coat is rough and disorder；b. indicates that the body temperature rises above 0.5 ℃ and lasts for 2 to 5 days；c. indicates the results of the necropsy，including the pericardial effusion，ascites increased，fibrinous exudate in the thoracic or cavum abdominis，pulmonary hemorrhage or sarcoidosis，lymphadenectasis，increased synovial fluid in the Hindlimb articular cavity，and so on.

王樂等[11]進(jìn)行的豚鼠和仔豬HPS毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，12和14型毒力最強(qiáng)(LD50低于3.5×108CFU)，其次是血清型5型，13型毒力最弱，4型菌株間有差異，研究結(jié)果與國外研究報(bào)道部分相一致[25]，說明部分血清型與毒力之間可能存在一定的聯(lián)系，也有研究表明HPS的血清型和致病型與基因組水平的差異有關(guān)[26]，基因組水平的差異對毒力起決定性影響。本試驗(yàn)用不同劑量的LZ株和LC株對仔豬分別攻毒，解剖病理特征與尹秀鳳[8]、Zhang等[27]的研究發(fā)現(xiàn)部分相吻合，攻毒后仔豬的臨床癥狀包括體溫明顯升高、被毛粗亂、精神不振、呼吸困難、咳嗽、臥地不起等，解剖發(fā)病豬的病理特征包括“絨毛心”和腹膜炎等。本研究還確定了LZ株和LC株的動物攻毒試驗(yàn)的最小發(fā)病量，證明兩者都具有較強(qiáng)的毒性，對分離株的致病性進(jìn)行研究有著重要意義，可為該病的疫苗研制和綜合防治提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究對山東省12個(gè)地區(qū)的發(fā)病豬場的副豬嗜血桿菌病進(jìn)行了流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查，并用其分離株LZ株和LC株進(jìn)行了生物特性和動物致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示山東地區(qū)確有副豬嗜血桿菌病的流行(分離率為28.16%)，其中4型和5型血清型最為流行。研究發(fā)現(xiàn)LZ株和LC株毒力較強(qiáng)，且均對青霉素類、頭孢類等藥物有較高的敏感性。本研究為副豬嗜血桿菌病菌病的診斷與防治提供了重要依據(jù)，具有一定的臨床應(yīng)用和理論價(jià)值。