牛樟芝提取物對四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護作用

魏文增，王 宮*，吳華嵩，李世強

（1.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州350003；2.康力生技股份有限公司，臺灣 高雄80743）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）多以慢性病為基礎(chǔ)致肝臟持續(xù)受損，引起肝臟纖維結(jié)締組織以及以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）合成過多或降解減少，在肝內(nèi)過度沉積［1-2］。 HF 是慢性肝病重要的病理特征，對患者的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅［3］，對治療慢性肝病至關(guān)重要。 若缺乏有效治療，將發(fā)展為肝硬化，嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)展為肝癌［4］。有研究表明，HF 經(jīng)積極治療可延緩甚至逆轉(zhuǎn)［5］，但目前國內(nèi)外尚無理想的抗肝纖維化藥物。 因此，尋找有效藥物阻斷、延緩及逆轉(zhuǎn)HF 的發(fā)生和發(fā)展在肝病的治療中有重要意義［6］。 較理想的抗肝纖維化藥物應(yīng)具有良好耐受性，對肝臟有特異的靶效應(yīng)，無毒或低毒［7］，天然藥物及中草藥在這方面具有得天獨厚的優(yōu)勢。 大量的研究資料和民間用藥基礎(chǔ)表明牛樟芝具有防治HF 的作用［8-10］，因此本課題組開展牛樟芝提取物防治大鼠HF 的實驗研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SD 大鼠，雄性，SPF 級，體質(zhì)量（250±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005；飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級動物飼養(yǎng)室，使用合格證：SYXK（閩）2014-005。

1.2 實驗藥物 秋水仙堿（云南西雙版納藥業(yè)有限公司，批號：170306）；牛樟芝［康力生技股份有限公司（臺灣）公司］，牛樟芝提取物為實驗室自制［11］。

1.3 實驗試劑 四氯化碳（CCl4，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20151109）；水合氯醛（源葉生物科技有限公司，批號：Z03D6Y7011）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批 號：20180117）、谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶（AST，批 號：20180118），南京建成生物工程研究所；大鼠透明質(zhì)酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（批號：1803201）、大鼠層粘蛋白酶聯(lián)免疫（批號：1804202）、大鼠Ⅲ型前膠原肽C 端免疫（批號：1803202）、大鼠Ⅳ型膠原酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒（批號：1804162），上海西塘生物技術(shù)有限公司；花生油（山東魯花集團有限公司，批號：20170325）。

1.4 實驗儀器 POCH-100IV diff 全自動動物血液分析儀［希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司］；64R臺式冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN 公司）；MDL 光學(xué)顯微鏡（德國LECIA 公司）。

2 實驗方法

2.1 造模、給藥及干預(yù) 將SD 大鼠隨機分為正常對照組、模型組、牛樟芝提取物低劑量組（低劑量組）、牛樟芝提取物中劑量組（中劑量組）、牛樟芝提取物高劑量組（高劑量組）和秋水仙堿組各10 只。除正常對照組外，其余各組均給予CCl4花生油溶液（CCl4∶花生油＝1∶1）按1 mL／kg 灌胃，每周2 次，同時予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)8 周。 從造模第1 天開始，低、中、高劑量組分別按75、150、300 mg／（kg·d）予牛樟芝提取物灌胃，秋水仙堿組按1 mg／（kg·d）予秋水仙堿溶液灌胃，正常對照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。 每周稱量體質(zhì)量2 次，調(diào)整灌胃量。8 周后麻醉大鼠，收集血清及肝臟，備用。

2.2 肝形態(tài)觀察及肝指數(shù)測定 解剖獲取肝臟后，稱取肝臟質(zhì)量，計算肝系數(shù)。

2.3 肝組織病理學(xué)觀察 取同一部位肝組織浸泡于4%多聚甲醛中固定，按常規(guī)包埋切片，分別予HE 染色和Masson 染色，于光鏡下觀察。

2.4 肝功能指標(biāo)檢測 應(yīng)用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平。

2.5 肝纖維化四項指標(biāo)測定 采用ELISA 法檢測大鼠血清血清透明質(zhì)酸（serum hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（Laminin，LN）、Ⅲ型前膠原（Ⅲ-type procollagen，PC-Ⅲ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-type collagen，ColⅣ）含量。

2.6 western blot 法測定TGF-β1 蛋白水平 向肝臟組織加裂解液勻漿提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，組織蛋白行SDS-PAGE 并轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，常溫下封閉2 h，分別加入TGF-β1 一抗（1∶1 000）及β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，再進一步進行二抗反應(yīng)，完畢后條帶經(jīng)Bio-RAD 凝膠分析儀進行圖像掃描分析，檢測TGF-β1 及β-actin 的灰度值，以蛋白相對表達(dá)量表示。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，組間比較方差齊時，采用LSD 檢驗；方差不齊時，采用Games-Howell 檢驗。 不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis test）。

3 結(jié) 果

3.1 大鼠一般情況 在整個實驗過程中，試驗大鼠未出現(xiàn)死亡情況。 連續(xù)給藥8 周后，正常對照組大鼠飲食和活動正常，反應(yīng)敏捷，毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)良好；模型組大鼠飲食和活動明顯減少，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)蓬松無光澤，精神萎靡；低劑量組大鼠狀態(tài)與模型組差別不大；高、中劑量組及秋水仙堿組大鼠飲食量、活動度、反應(yīng)靈敏度及精神狀態(tài)較模型組均有不同程度的改善。

3.2 6 組大鼠不同時間點體質(zhì)量比較 見表1。

表1 6 組大鼠不同時間點體質(zhì)量比較（x±s）g

3.3 6 組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)比較 如圖1 所示，正常對照組肝臟顏色紅潤，表面光滑，質(zhì)地柔軟；CCl4所致的模型組肝臟色澤呈黃褐色，表面粗糙呈顆粒狀；牛樟芝提取物組和秋水仙堿組的肝臟較模型組而言，肝臟腫大程度均有不同程度的降低，表面光滑和顏色有一定的好轉(zhuǎn)，更接近正常對照組大鼠肝臟的形態(tài)。

圖1 6 組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)比較

3.4 6 組大鼠肝系數(shù)比較 見圖2。

3.5 6 組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 HE 染色結(jié)果顯示，正常對照組的大鼠肝臟形態(tài)正常；模型組的肝臟脂肪細(xì)胞變性，且被炎癥因子浸潤，大量的纖維結(jié)締組織增生，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，甚至出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)重新構(gòu)建。 牛樟芝提取物組和秋水仙堿組的肝組織脂肪細(xì)胞變性明顯減少，炎癥因子也顯著降低，纖維增生程度明顯減輕，但仍無法恢復(fù)至正常對照組的正常水平。Masson 染色結(jié)果顯示，膠原纖維成深藍(lán)色，與正常組比較，模型組膠原纖維明顯增多，肝小葉結(jié)構(gòu)受到破壞，在給予藥物治療后，HF 呈現(xiàn)一定程度的好轉(zhuǎn)。 見圖3、4。

圖2 6 組大鼠肝系數(shù)比較

圖3 6 組大鼠肝組織HE 染色圖（×100）

3.6 6 組大鼠血清肝功能、肝纖維化指標(biāo)比較 見表2。

圖4 6 組大鼠肝組織Masson 染色圖（×100）

3.7 6 組大鼠肝組織TGF-β1 蛋白表達(dá)比較 見圖5。

4 討 論

牛樟芝（Antrodia camphorata）為臺灣珍貴的藥用真菌，具有解毒保肝、抗氧化、抗炎、強化免疫、抗癌等作用［11-12］。 研究表明，牛樟芝對乙醇誘導(dǎo)的大鼠和四氯化碳引起的小鼠急性肝損傷具有保護作用［13-14］。 劉燕隔［15］通過對急性酒精肝小鼠給予牛樟芝治療后，發(fā)現(xiàn)不僅能有效緩解與抑制由酒精引起的TNF-α 水平的升高，還能緩解酒精攝入引起的IL-10 的炎癥因子降低，從而保護肝臟。王宮等［9］通過牛樟芝滴丸對大鼠非酒精性脂肪肝研究表明其對肝臟具有保護作用。

臟器重量和臟器系數(shù)可作為大體確定對應(yīng)器官病變程度的參考［16］。 本研究通過肝臟重量、系數(shù)以及肝組織形態(tài)學(xué)、病理學(xué)比較，牛樟芝提取物各劑量和秋水仙堿組對肝組織均有一定的改善作用，說明牛樟芝提取物對CCl4誘導(dǎo)的大鼠HF 有保護作用。

表2 6 組大鼠血清肝功能、肝纖維化指標(biāo)比較（x±s）

注：A 正常對照組；B 模型組；C 秋水仙堿組；D 低劑量組；E 中劑量組；F 高劑量組。

圖5 6 組大鼠肝組織TGF-β1 蛋白表達(dá)變化

本研究選用經(jīng)典的CCl4誘導(dǎo)HF 模型，CCl4經(jīng)肝代謝和活化生成強生物毒性自由基（-CCl3）、二氯甲基自由基（·CCl2）和過氧化甲基自由基（·OOCCl2），破壞膜結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致肝組織內(nèi)ALT、AST、LDH 等被釋放進入血液循環(huán)中［17-18］。 本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CCl4處理后的大鼠血清ALT、AST、LDH、TB 水平較正常組顯著升高；給予牛樟芝各劑量提取物和秋水仙堿干預(yù)后，大鼠血清ALT、AST、LDH、TB 水平較模型組有一定程度的降低，說明牛樟芝提取物對膜有一定的穩(wěn)定作用，能降低肝損傷程度，對CCl4所致?lián)p傷的肝細(xì)胞有保護作用。

HF 是各種不同致病因子引起的慢性肝病，包括藥物治療、自身免疫反應(yīng)、輻射和感染等共同的病理基礎(chǔ)和過程，是損傷修復(fù)過程調(diào)節(jié)異常的結(jié)果，主要發(fā)生機制是肝ECM 過度沉積。 ECM 成分為HA、LN、PC-Ⅲ、ColⅣ，即肝纖維四項，是反映HF 的血清標(biāo)志物，用來衡量纖維化程度和炎癥活動度。CCl4通過促進肝纖維四項的合成與降解失衡誘發(fā)HF，因此肝纖維四項ECM 含量與HF 程度呈正相關(guān)，可用于評價HF 病變程度［19-21］。 HA 是HF 程度和藥物療效中最敏感、最特異的血清指標(biāo)［22］；LN是非膠原糖蛋白，與炎性反應(yīng)和HF 有關(guān)；PC-Ⅲ是肝結(jié)締組織成分之一，能反映正常肝組織向結(jié)締組織的轉(zhuǎn)換情況；ColⅣ是反映膠原蛋白的生成，在HF 時，可能是最早增生纖維［20］。 TGF-β1 是由激活肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞所釋放，是最強的促纖維化細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，促進ECM分泌，沉積肝組織中，形成HF［23-24］。 本研究結(jié)果顯示，牛樟芝提取物各劑量組和秋水仙堿組與模型組比較，肝纖維四項指標(biāo)和TGF-β1 檢測結(jié)果均有顯著降低，說明牛樟芝提取物能抗肝纖維化。

綜上所述，牛樟芝提取物可改善CCl4致HF 大鼠的精神狀態(tài)、飲食量、體質(zhì)量、活動度及反應(yīng)靈敏度等一般狀況和肝功能生化指標(biāo)，減輕大鼠肝病理損傷、減少肝臟的膠原沉淀，均說明牛樟芝提取物對HF 大鼠具有保護作用，但其確切機制還需進一步研究。