HPLC-ELSD 一測多評法同時測定蜂蜜中4 種糖類成分

凌 真，劉 慧，丁蘇蘇，姚晶晶，朱慶麗

揚州市食品藥品檢驗檢測中心，揚州225009

蜂蜜是一種藥食同源類物質(zhì)，其成分主要包括果糖、葡萄糖這兩種單糖，以及少量的蔗糖、麥芽糖等雙糖，另含有微量的有機酸、氨基酸、礦物質(zhì)和水分等。蜂蜜的質(zhì)量因蜜源與環(huán)境的不同而具有較大的差異，主要表現(xiàn)在糖分的組成及含量不同。由于蜂蜜的市場需求旺盛，有不法商販對蜂蜜制偽摻假牟取暴利。因此，建立一種準確快速的方法來檢測蜂蜜中主要的單、雙糖成分含量，對于蜂蜜質(zhì)量的監(jiān)管具有重要意義[1，2]。

現(xiàn)行國家法定標準中，主要有兩種檢測蜂蜜單、雙糖含量的方法，《中國藥典》[3]收錄的為高效液相色譜示差折光檢測法（RID），《GB14963-2011 食品安全國家標準蜂蜜》（以下簡稱《國標》）[4]收錄的為RID和高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法（ELSD）。要求果糖和葡萄糖總含量≥60%，蔗糖含量≤5%（少數(shù)蜂蜜除外）；《中國藥典》 還要求麥芽糖含量≤5%且果糖與葡萄糖的含量比值不得＜1.0。上述標準的適用條件均有所局限：如RID 對溫度變化極其敏感，基線穩(wěn)定時間長，檢測靈敏度較低，而《國標》中ELSD法檢測范圍較窄，故本研究擬建立一種靈敏的ELSD法同時測定蜂蜜中的4 種單、雙糖成分。

1 儀器與試藥

Agilent 1260、U 3000 高效液相色譜儀；Alltech 2000 ES、Alltech 3300 蒸發(fā)光散射檢測器；梅特勒XS 205 DU 電子分析天平；Milli-Q 純水機。

蜂蜜樣品12 批，市售；對照品：果糖（批號C13947500，純度99.7%）、葡萄糖（批號C14027000，純度99.7%）、蔗糖（批號C16901100，純度99.9%）、麥芽糖（批號C14734700，純度99.4%）均購自德國Dr.E GmbH 公司；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 Prevail Carbohyrate ES 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（78∶22）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；蒸發(fā)光散射檢測器；載氣：氮氣；流速：3.0mL·min-1；漂移管溫度：105℃；進樣量：10μL。結(jié)果顯示各組分分離良好，色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取各種對照品：果糖1.1460 g、葡萄糖1.0906 g、蔗糖0.7060 g 和麥芽糖0.7886 g，置同一50 mL 量瓶中，加水適量使溶解，再用水稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液。精密吸取對照品儲備溶液2.5 mL，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液（7），再精密吸取對照品溶液（7）1.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、8.0 mL 分別置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為對照品溶液（1）～（6）。

2.1.3 供試品溶液的制備 取蜂蜜樣品0.5 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加水適量溶解，再用水稀釋至刻度，搖勻；精密吸取該液5 mL，置100 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下的對照品溶液（1）～（7）各10 μL，注入高效液相色譜儀，以各對照品溶液質(zhì)量濃度的對數(shù)lgC（mg·mL-1）為橫坐標X，以峰面積的對數(shù)lgA 為縱坐標Y，繪制標準曲線，結(jié)果見表1。4 種糖類線性關(guān)系良好。

表1 各被測組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）和線性范圍

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液（3）10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，并計算對數(shù)值，結(jié)果這4 種糖類的RSD 分別為0.25%、0.36%、0.44%、0.77%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.3”項下的供試品溶液10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件，分別于0 h、3、8、10、12、24、30 h 進樣，記錄峰面積，得4 種成分的RSD 分別為0.49%、0.64%、0.47%、0.68%，表明供試品溶液在30 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗 取已知含量的蜂蜜樣品0.5 g，共6 份，精密稱定，置50 mL 量瓶中，精密量取對照品儲備溶液各5 mL 置上述量瓶中，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的平均回收率（n=6）分別為97.5%、103.2%、98.1%、95.2%，RSD 分別為0.61%、1.02%、1.73%、2.92%，表明4 種糖類回收率符合要求。

2.2 一測多評法評價研究[5，6]

2.2.1 相對校正因子的計算[7]以果糖為內(nèi)參物，以公式Fs/k=（Ms×lgAk）/（Mk×lgAs）（Ms為內(nèi)參物質(zhì)量，Mk為待測物質(zhì)質(zhì)量，lgAs為內(nèi)參物峰面積的對數(shù)，lgAk為待測物質(zhì)峰面積的對數(shù)），計算果糖對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的相對校正因子，結(jié)果見表2。

表2 蜂蜜中3 種糖類相對校正因子的測定結(jié)果

2.2.2 高效液相色譜儀考察 由表3 可見，不同儀器以及不同實驗室條件下，果糖對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的相對校正因子分別為0.921、1.418、1.095，相對偏差＜2%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

表3 不同高效液相色譜儀-蒸發(fā)光檢測器測定的相對校正因子

2.2.3 待測組分色譜峰的定位考察 測定葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對于內(nèi)參物果糖的相對保留時間（tR），完成對待測組分色譜峰的定位，由表4 可見，在不同儀器上其tR的相對偏差均＜2%，表明利用tR進行色譜峰的定位是可行的。

表4 不同高效液相色譜儀-蒸發(fā)光檢測器測定的相對保留時間

2.3 一測多評法與外標法測定結(jié)果比較

有市售蜂蜜12 批，分別取0.5 g，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，采用一測多評法和外標法計算蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，樣品中均未檢出蔗糖和麥芽糖；葡萄糖含量經(jīng)t 檢驗比較，t＞0.1，表明外標法實測值與一測多評法計算值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明一測多評法可用于蜂蜜中葡萄糖等糖類成分的質(zhì)量評價研究，見表5。

3 討論

蜂蜜的主要成分是糖類，此類成分無紫外吸收，《中國藥典》 選用通用型檢測器RID，但是RID受溫度影響較大，靈敏度較低，所以本研究選用ELSD 為檢測器。在色譜柱的選擇中，比較了氨基色譜柱和Prevail Carbohyrate ES 色譜柱：氨基柱柱效下降較快，不利于大量樣品的測定；《中國藥典》推薦Prevail Carbohyrate ES 色譜柱為測定專用柱，在本試驗中分離效果好，柱效高，耐用性強。

表5 外標法（ESM）與一測多評法（QAMS）測定結(jié)果

在柱溫的選擇中，溫度較低，分離度較差；溫度較高，峰形不夠理想，所以柱溫選擇為30 ℃。在含量計算中，選擇以質(zhì)量濃度的對數(shù)值和峰面積的對數(shù)值描繪標準曲線，求得兩者的線性關(guān)系。

引入一測多評法，以果糖為內(nèi)標物，測評蜂蜜中其他3 種糖類成分，以峰面積的對數(shù)值代替峰面積進行相對校正因子的計算，研究了不同高效液相色譜系統(tǒng)對相對校正因子和相對保留時間的影響，結(jié)果重現(xiàn)性良好，驗證了一測多評法在蜂蜜質(zhì)量控制中的可行性。將外標法測定的結(jié)果與一測多評法計算所得的結(jié)果相比較，無顯著性差異，確證了該方法的準確性和科學(xué)性。