紫萍與青萍中黃酮類成分的測定及多變量統(tǒng)計(jì)分析

王秋實(shí)，張小龍，2，陳洪巖，吳啟南

1 連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，連云港 222006；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023

浮萍為浮萍科（Lemnaceae）植物的統(tǒng)稱，現(xiàn)行《中國藥典》 所收載的中藥浮萍來源為浮萍科植物紫萍Spirodela polyrrhiza（L.）Schleid.的干燥全草[1]。其味辛、性寒，具有宣散風(fēng)熱、透疹、利尿的功效；可用于治療麻疹不透、風(fēng)疹瘙癢、水腫尿少等癥。但是在歷代“本草”中，有多部記載了浮萍科植物青萍Lemna minor L.也可作為浮萍藥用的情況。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，浮萍具有抗菌、抗炎、抗氧化等活性，主要是通過黃酮類成分發(fā)揮其藥理藥效作用。因此對浮萍中黃酮類成分的測定和分析有著重要意義。本研究采用HPLC-QTOF-MS 法對浮萍中的葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素等6 個黃酮類成分的含量進(jìn)行了測定，并采用主成分分析（PCA)與正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，對青萍和紫萍間的差異進(jìn)行了系統(tǒng)的定量、半定量研究，揭示紫萍和青萍中含有的黃酮類化合物的區(qū)別，為浮萍的合理利用與臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity HPLC（配備DAD 檢測器、二元泵系統(tǒng)、高通量自動進(jìn)樣器及樣品室溫度控制模塊）；Agilent 6530B Accurate-Mass Q-TOF（電噴霧離子化，正離子模式）；AG135 十萬分之一天平（Mettler Toledo 公司）；Ymnl-48 高通量組織研磨儀（南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司）；2-16R 臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對照品：葒草苷（純度97.9%，批號111777-201302）、異葒草苷（純度94.0%，批號111974-201401）、牡荊苷（純度95.7%，批號111687-201603）、木犀草苷（純度94.9%，批號111720-201408）、木犀草素（純度99.6%，批號111520-201605）、芹菜素（純度99.2%，批號111901-201603）均購自中國食品藥品檢定研究院。

來源于不同產(chǎn)地的52 批浮萍樣品由實(shí)驗(yàn)室自采，其中31 批為紫萍樣品（SP 01～31）、21 批為青萍樣品（LM 01～21），均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定確認(rèn)。將采集的樣品用清水洗凈并去除雜質(zhì)后曬干，密封于自封袋中置陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

甲醇為色譜純（德國Merck 公司，甲酸為色譜純（美國Mreda 公司）；超純水由Milli-Q 純水機(jī)制備（美國Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18RRHT（2.1mm×50mm，1.8μm）；柱溫：30℃；樣品室溫度：8℃；以甲醇為流動相A，以0.1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫（程序?yàn)?～25 min，90%～55%B；25～40 min，55%～40%B）；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化（ESI）正離子模式，干燥氣溫度為325℃，霧化氣壓力為35psi，毛細(xì)管出口電壓為120V，干燥氣流量為10 L·min-1，毛細(xì)管電壓3.5 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z 100～2 000，選擇質(zhì)荷比（m/z）為葒草苷449.107 8、異葒草苷449.107 8、牡荊苷433.112 9、木犀草苷449.107 8、木犀草素287.055 0、芹菜素271.055 9 離子進(jìn)行檢測。

2.3 溶液的配制

2.3.1 對照品溶液 分別精密稱取芹菜素、木犀草素、牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、木犀草苷對照品適量，用甲醇溶解分別配制成198.80、200.40、202.80、203.40、201.00、200.60 μg·mL-1對照品儲備液；精密量取上述對照品儲備液各1 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每毫升分別含上述成分19.88、20.04、20.28、20.34、20.10、20.06 μg混合對照品溶液，典型HPLC-QTOF 提取離子色譜圖見圖1。

2.3.2 供試品溶液 取本品（SP11）適量，粉碎，過60 目篩，精密稱取0.25g，置5mL 連蓋式離心管中，加入直徑4.0mm 的不銹鋼珠5 粒，精密加入甲醇2mL，密塞，置于高通量組織研磨儀中提取120 s（頻率70 kHz），提取液離心10 min（轉(zhuǎn)速15 000 r·min-1，離心力15 300×g），取上清液稀釋1～6 倍，即得。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

精密吸取上述對照品儲備液適量，稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（n=6），按上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣，以各對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程；分別以信噪比為3 和10 考察檢測限（LOD）和定量限（LOQ）；取“2.3.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液，按上述色譜質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算RSD 作進(jìn)樣精密度考察；取“2.3.2”項(xiàng)下的同一批供試品溶液（SP 11），分別在室溫下放置0、3、6、12、18、24 h，按上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD 作穩(wěn)定性考察；精密稱取同一樣品（SP 11）6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜質(zhì)譜述條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品含量和RSD，考察方法的重復(fù)性；取同一批樣品（SP 11）6 份，每份約0.125 g，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密加入對照品適量，按上述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣，考察加樣回收率。

由表1 可知，芹菜素、木犀草素、牡荊苷、葒草苷、異葒草苷、木犀草苷在較寬的濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r2均＞0.995 0）；LOD（S/N=3）和LOQ（S/N=10）的范圍分別在0.20～0.27 μg·mL-1和0.40～0.82 μg·mL-1；由表2 顯示，精密度試驗(yàn)RSD＜3.5%，方法重復(fù)性試驗(yàn)RSD＜4.0%，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD＜3.5%，表明儀器精密度和方法重復(fù)性均良好，且樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定；6 種黃酮化合物的加樣回收率為95.41%～105.82%，RSD 為2.03%～4.16%，表明本方法的回收率良好。

表1 6 種黃酮類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限

表2 6 種黃酮類成分的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率

2.5 樣品含量測定及統(tǒng)計(jì)分析

利用上述色譜質(zhì)譜條件對52 批浮萍樣品中6個黃酮成分的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 浮萍中6 種黃酮類成分含量測定結(jié)果（μg·g-1，n=2）

利用SIMCA 14.1（瑞典Umetrics 公司）對52 批浮萍樣品中6 個黃酮成分的含量數(shù)據(jù)進(jìn)行多維變量統(tǒng)計(jì)分析，包括建立PCA、OPLS-DA、PCA-Class模型及分析等[2，3]。

所有樣品含量的原始數(shù)據(jù)經(jīng)UV 尺度化（Unit Variance Scaling）建立PCA 模型，經(jīng)交叉驗(yàn)證后擬合的PCA 模型中有3 個主成分，R2X（cum）=0.958，Q2（cum）=0.713，可知模型能夠很好地?cái)M合浮萍中黃酮含量的原始信息，且有較好的預(yù)測能力，第一主成分的貢獻(xiàn)率為61.2%，得分圖見圖2。樣品無明顯的異常點(diǎn)，青萍和紫萍大體上分為兩類，且在第一主成分上有較大區(qū)分，在第二、第三主成分上無明顯區(qū)別。從Biplot 圖（圖3）中可見，青萍樣品與異葒草苷含量有較強(qiáng)的正相關(guān)；與芹菜素、木犀草素呈明顯負(fù)相關(guān)；與葒草苷、木犀草苷、牡荊苷也呈一定的負(fù)相關(guān)。紫萍樣品與芹菜素、木犀草素、葒草苷、木犀草苷、牡荊苷的含量呈正相關(guān)；而與異葒草苷呈負(fù)相關(guān)。這與表4 的含量測定結(jié)果是相一致的：所有青萍樣品中均未檢出芹菜素，木犀草素也僅在少數(shù)樣品中檢出，且含量很低。在31 批紫萍樣品中，僅有4 批含有異葒草苷，且含量很低；而青萍中的異葒草苷和紫萍中的其它黃酮成分含量明顯較高。

對紫萍和青萍間建立OPLS-DA 模型，經(jīng)自動擬合后分別生成1 個預(yù)測主成分和1 個正交主成分，R2X（cum）=0.831，R2Y（cum）=0.748，Q2（cum）=0.738，對原始數(shù)據(jù)具有較好的解釋度和預(yù)測度，得分圖見圖4。對上述模型作200 次排列實(shí)驗(yàn)，其R2Y與Q2Y 的截距分別為-0.013 5 和-0.196，說明該模型穩(wěn)定，且不存在過擬合現(xiàn)象。

預(yù)測主成分顯示了青萍和紫萍的組間差異，兩組間存在較為明顯的區(qū)別，說明兩者的黃酮含量間存在差異；正交主成分顯示了浮萍黃酮含量的組內(nèi)差異，可見青萍樣品的組內(nèi)差異較小，黃酮含量彼此之間較為相似，而紫萍樣品的組內(nèi)差異較大，成分含量波動較大，有的甚至超過了組間差異。SP 15、SP 17、SP 19 三批紫萍樣品的黃酮含量與青萍相似。

幾種黃酮類成分對于模型中組間差異的重要性依次為木犀草素＞芹菜素＞木犀草苷＞牡荊苷＞葒草苷＞異牡荊苷，且各成分均有顯著性差異（P＜0.05），各成分的回歸系數(shù)也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且芹菜素的回歸系數(shù)最大。對各成分之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。葒草苷和牡荊苷、木犀草苷和牡荊苷、葒草苷之間有很強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性均＞0.9。

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

本研究分別考察了不同溶劑（50%、70%甲醇，甲醇；50%、70%乙醇，乙醇）、不同提取方法（超聲處理、研磨）、不同提取時間（超聲20、30、40 min，研磨60、90、120、180 s）對樣品的處理效果，結(jié)果表明，以甲醇為溶劑，超聲處理30 min 及研磨120 s 以上，測得樣品中各組分的含量較高，也無顯著性差異，且研磨法可大大縮短提取時間，提高了效率，故確定最佳提取方法為：甲醇作溶劑，用研磨法，研磨120 s。

表4 浮萍中6 種黃酮類成分的相關(guān)性

3.2 檢測方法的選擇

對于黃酮類化合物的液相色譜法含量測定，目前采用紫外檢測器[4-7]較多。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對照品溶液的紫外色譜圖中（350 nm），雖然6 個黃酮類待測組分均有較好的紫外吸收，且各成分在上述色譜條件下均能達(dá)到基線分離，但是在浮萍樣品中，由于成分復(fù)雜且黃酮類成分含量較高，常存在共流出組分，且共流出組分也具有較強(qiáng)的紫外吸收，會對待測組分的定量測定產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。由圖5-A 中可看到，青萍樣品（LM 14）的紫外色譜圖中木犀草苷（17.481 min）的位置僅有一個峰，且峰強(qiáng)度遠(yuǎn)高于對照品，但是在該出峰時間的質(zhì)譜圖中（圖5-B）可明顯看出含有兩個成分，除了含有木犀草苷（m/z 449.1059）外，還含有m/z 433.1123 的成分，計(jì)算后木犀草苷實(shí)際濃度僅約為對照品的四分之一，故不能采用傳統(tǒng)的紫外檢測器對待測組分同時定量，而高分辨質(zhì)譜檢測器卻能夠在復(fù)雜的基質(zhì)中精確檢測待測成分，避免共流出組分的干擾，故本文采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對6 個黃酮類組分進(jìn)行定量檢測。

3.3 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究分別考察了不同的有機(jī)相（甲醇、乙腈）及洗脫條件（等度及不同梯度洗脫程序），結(jié)果表明，采用甲醇作為有機(jī)相及上述的梯度洗脫程序時，樣品中的各待測組分之間及與其它成分能夠相對較好的分離，減少共流出組分的干擾。對不同的毛細(xì)管出口電壓進(jìn)行考察時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)毛細(xì)管出口電壓設(shè)置過高時，會增加待測組分在源內(nèi)的裂解，從而降低化合物的質(zhì)譜響應(yīng)；而過低的毛細(xì)管出口電壓又會導(dǎo)致離子傳輸效率的降低，也會降低化合物的質(zhì)譜響應(yīng)。優(yōu)化的結(jié)果表明，當(dāng)毛細(xì)管出口設(shè)置為120 V 時，各待測組分均能有較好的響應(yīng)。

3.4 多變量統(tǒng)計(jì)分析與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法同時測定浮萍中6 種成分的含量，克服了有紫外吸收的共流出組分時、采用傳統(tǒng)的紫外檢測器無法準(zhǔn)確定量的問題，并對紫萍和青萍中的黃酮含量進(jìn)行了多維變量統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，紫萍和青萍中黃酮成分的含量存在較大差異；紫萍的組內(nèi)差異較大，不同樣品的黃酮含量波動較大；而青萍樣品的組內(nèi)差異較小，黃酮含量彼此之間較為相似。青萍中不含芹菜素，木犀草素也僅在少數(shù)樣品中檢出，且含量很低，與異葒草苷含量有較強(qiáng)的正相關(guān)，與芹菜素、木犀草素呈明顯負(fù)相關(guān)，與葒草苷、木犀草苷、牡荊苷也呈一定的負(fù)相關(guān)；紫萍僅有少量樣品含有異葒草苷，且含量很低，與芹菜素、木犀草素、葒草苷、木犀草苷、牡荊苷的含量呈正相關(guān)，而與異葒草苷呈負(fù)相關(guān)。葒草苷和牡荊苷、木犀草苷和牡荊苷、葒草苷之間的相關(guān)性均＞0.9。