不同糖源對酵母生長及糖利用的影響

雷雅男，謝東東，謝巖黎

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001

小麥粉面團(tuán)中可發(fā)酵的糖有3個來源：游離的單糖(葡萄糖、果糖)、二糖(蔗糖、麥芽糖)、三糖；受損淀粉；果聚糖(由果糖單元組成)[1-4]。面團(tuán)中這些可發(fā)酵糖的含量影響面團(tuán)的發(fā)酵進(jìn)程，包括發(fā)酵過程的產(chǎn)氣量、面團(tuán)的發(fā)育等，且發(fā)酵期間面團(tuán)的高度、氣體產(chǎn)量與糖的類型有顯著的相關(guān)性[5]。研究表明，蔗糖可以增加面團(tuán)的延展性，賦予面團(tuán)更柔軟、更黏稠的質(zhì)地[6]。面團(tuán)中麥芽糖含量高可以延長發(fā)酵時間，葡萄糖/麥芽糖的比值大則有較高的發(fā)酵速率[7]。面團(tuán)發(fā)酵180 min后，酵母濃度最高的面團(tuán)中很少有葡萄糖、果糖和麥芽糖，幾乎完全發(fā)酵[8]。破損淀粉分解后也能被酵母所利用，一般認(rèn)為大分子的淀粉不能被酵母分解利用，但是在特定條件或者極端環(huán)境下酵母能否利用淀粉，還需要進(jìn)一步探究。

面團(tuán)的發(fā)酵是酵母對糖的利用，糖為酵母的生長代謝提供能量和構(gòu)建細(xì)胞組成的碳骨架，直接或間接調(diào)節(jié)所有主要的代謝途徑[9-11]。酵母的生長分為3個階段：初始階段可發(fā)酵糖為碳源，細(xì)胞迅速生長和分裂，該階段稱為指數(shù)生長；當(dāng)培養(yǎng)基中碳源為限制因素時，細(xì)胞生長速率下降，從發(fā)酵代謝轉(zhuǎn)變?yōu)楹粑x，生長階段轉(zhuǎn)變至二次生長；當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，細(xì)胞進(jìn)入靜止期，生長停滯，生物量保持恒定[12-13]。

酵母對面團(tuán)中幾種糖的發(fā)酵規(guī)律，大多數(shù)研究是從面團(tuán)發(fā)酵過程中糖濃度的變化、氣體的產(chǎn)生以及面團(tuán)的發(fā)育出發(fā)建立一系列的相關(guān)性[5]。面團(tuán)是一個復(fù)雜的發(fā)酵體，對于酵母和單一糖源之間的關(guān)系目前沒有具體的探究，因此作者采用培養(yǎng)基模擬面團(tuán)中酵母利用不同糖源發(fā)酵的模式，觀察酵母對單一糖源的利用及自身的生長規(guī)律，對酵母的生長期進(jìn)行研究。通過研究酵母對不同糖源的利用，調(diào)節(jié)面團(tuán)的發(fā)酵進(jìn)程從而達(dá)到預(yù)定的發(fā)酵效果，為生產(chǎn)實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨、酵母膏：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；KH2PO4：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；K2HPO4、MgSO4·7H2O、氯化鈉、可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-92B氣浴恒溫振蕩器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；UV-6100S紫外可見分光光度計：上海美普達(dá)儀器有限公司； pHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DHG-9073BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：廣州滬瑞明儀器有限公司；DL-5-B 離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備[7-8]

種子培養(yǎng)基：稱取KH2PO40.1 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 0.1 g于錐形瓶中，加水100 mL，溶解后滅菌20 min，取出放涼備用[5]。

葡萄糖培養(yǎng)基：稱取KH2PO40.1 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 0.1 g、葡萄糖2 g于錐形瓶A中，加30 mL水溶解；稱取蛋白胨2 g、酵母膏1 g于錐形瓶B中，加30 mL水溶解；滅菌后混合，加蒸餾水至100 mL備用[15-16]。

麥芽糖、淀粉培養(yǎng)基與葡萄糖培養(yǎng)基制備方法相同，無糖培養(yǎng)基作為對照組。

1.3.2 種子液的培養(yǎng)

稱取5 g活性干酵母于種子培養(yǎng)基中，封口后在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)30 min。

1.3.3 酵母生長曲線的繪制

按2%(體積比)的接種量取種子液于4種培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振動培養(yǎng)22 h。每隔2 h取樣1次，在波長 600 nm下測定OD值，繪制酵母細(xì)胞0～22 h的生長曲線[17-18]。

另外按2%(體積比)的接種量取種子液于葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h，每隔15 min取樣1次，在波長 600 nm下測定OD值，繪制酵母細(xì)胞0～180 min的生長曲線。

1.3.4 酵母生長速率曲線的繪制

按照生長速率公式：μ=(lnX2-lnX1)/(t2-t1)計算酵母各個時間點的生長速率，并繪制生長速率曲線[19]。其中X1、X2分別為酵母細(xì)胞培養(yǎng)液在時間t1、t2的OD600值。

1.3.5 酵母在不同生長階段細(xì)胞形態(tài)的變化

根據(jù)酵母的生長曲線，分別取延滯期、對數(shù)生長期前期、對數(shù)生長期后期、穩(wěn)定期前期、穩(wěn)定期后期對應(yīng)的5個時間點的酵母進(jìn)行觀察，具體參照李勤[17]的方法。

細(xì)胞形狀[20]分為圓形、橢圓形、近紡錘形3種形狀；在40倍光學(xué)顯微鏡下對視野內(nèi)細(xì)胞的大小進(jìn)行評估，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個等級，依次變大；細(xì)胞聚集情況分為完全分散、部分聚集、大量聚集、完全聚集4種形態(tài)；出芽情況分為無出芽、個別出芽、少量出芽、大量出芽4種狀態(tài)。

1.3.6 葡萄糖濃度的測定

葡萄糖培養(yǎng)基取樣的時間點分別為0、1、2.5、5、7、18 h，麥芽糖培養(yǎng)基的取樣時間點分別為0、1、3、7、9、20 h。收集培養(yǎng)液于離心管中，5 000 r/min離心10 min，收集所得上清液，稀釋10倍后采用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖濃度。

1.3.7 麥芽糖含量的測定

采用李珊[21]的方法測定麥芽糖含量。取2 mL麥芽糖溶液和2 mL DNS于比色管中混勻，沸水浴10 min后迅速冷卻，加蒸餾水定容至25 mL，在540 nm下測定吸光值，縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為麥芽糖含量，制作麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.654 3x-0.094 6 (R2=0.999 6)。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法計算麥芽糖含量。

1.3.8 淀粉含量變化趨勢的測定

取2 g/L淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于100 mL 棕色容量瓶中，然后加入1.0 mL 0.01 mol/L I2-KI 標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，第一個容量瓶作空白，在600 nm 處測定此系列溶液的吸光度[22]。以吸光度為縱坐標(biāo)，淀粉含量為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.299 4x+0.012 5(R2=0.994 9)。收集培養(yǎng)液于離心管中，5 000 r/min離心10 min，收集所得上清液，適當(dāng)稀釋后測定淀粉含量。

1.3.9 不同糖源的酵母培養(yǎng)基pH值的測定

每隔1 h收集1次酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，測定0～22 h不同糖源培養(yǎng)基的pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示，采用SPSS 16.0 進(jìn)行單因素方差分析，采用 Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 糖源對酵母生長的影響

2.1.1 糖源對酵母22 h內(nèi)生長的影響

酵母在葡萄糖、麥芽糖、淀粉、無糖培養(yǎng)基中的生長結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 酵母在4種培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curve of yeast in four media

圖2 酵母在4種培養(yǎng)基中的生長速率Fig.2 Growth rate of yeast in four media

由圖1可知，酵母在葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基中0～22 h有明顯的延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定生長期，而在淀粉和無糖培養(yǎng)基中0～22 h沒有明顯的生長階段。這表明0～22 h酵母能利用葡萄糖和麥芽糖維持自身生長，不能直接利用淀粉。而酵母在淀粉培養(yǎng)基的吸光值偏大，可能是因為淀粉分子顆粒大，溶解度低，培養(yǎng)基較為渾濁。

由圖2可知，對數(shù)生長期時，酵母在葡萄糖培養(yǎng)基4 h時生長速率最大，在麥芽糖培養(yǎng)基6 h時生長速率最大。酵母能直接利用葡萄糖進(jìn)行生長增殖，而麥芽糖分解成葡萄糖后才能被利用。穩(wěn)定期時，酵母的生長速率幾乎為零。在淀粉和無糖環(huán)境中，酵母沒有明顯的生長階段，說明酵母沒有可利用的糖源，不能生長。酵母不能直接利用淀粉，淀粉需要在酶的作用下分解為麥芽糖才能被利用[7]。

2.1.2 糖源對酵母3 h內(nèi)生長的影響

酵母在葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基中3 h的生長結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 酵母在2種培養(yǎng)基中3 h內(nèi)的生長曲線Fig.3 The first 3 h growth curve of yeast in two media

圖4 酵母在2種培養(yǎng)基中3 h內(nèi)的生長速率Fig.4 The first 3 h growth rate of yeast in two media

從圖3和圖4可以看出，酵母在兩種培養(yǎng)基中的生長曲線大致相同，在葡萄糖培養(yǎng)基中120 min后進(jìn)入對數(shù)期，而在麥芽糖培養(yǎng)基中150 min后進(jìn)入對數(shù)期。酵母在麥芽糖培養(yǎng)基中的延滯期長，這是因為葡萄糖能直接被酵母轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行利用[2]，而麥芽糖需要被分解后才能被利用。對數(shù)期酵母在麥芽糖培養(yǎng)基中生長速率加快，這是因為酵母分泌麥芽糖酶將麥芽糖分解成葡萄糖，培養(yǎng)基中可利用的糖總量增加。

結(jié)合圖1生長曲線可以得出：在葡萄糖培養(yǎng)基中，0～2 h為延滯期，2～6 h為對數(shù)生長期，6～22 h為穩(wěn)定期；在麥芽糖培養(yǎng)基中，0～2.5 h為延滯期，2.5～8 h為對數(shù)生長期，8～22 h為穩(wěn)定期；在淀粉和無糖培養(yǎng)基中，0～22 h無明顯生長階段。

2.2 不同糖源對酵母各生長階段細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2.1 不同糖源中酵母細(xì)胞觀察時間點的選取

根據(jù)生長曲線，選取觀察酵母細(xì)胞形態(tài)的時間點如表1所示。

表1 4種培養(yǎng)基中的酵母菌觀察時間點Table 1 Observation time of yeast in four media h

2.2.2 不同糖源對酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

由表2可知，延滯期時，葡萄糖培養(yǎng)基中的細(xì)胞個體大，出芽早，這說明酵母能更早識別利用葡萄糖為細(xì)胞生長增殖做準(zhǔn)備。對數(shù)期后期時，葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞均大量出芽，麥芽糖培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞聚集程度高，這是由于對數(shù)生長期的酵母酶系活躍，代謝旺盛[23]。穩(wěn)定期后期時，在葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基中酵母細(xì)胞形態(tài)多呈近圓形，與淀粉培養(yǎng)基和無糖培養(yǎng)基相比，細(xì)胞大、數(shù)量多。穩(wěn)定期時，葡萄糖培養(yǎng)基與麥芽糖培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞都較為分散，幾乎沒有生長。這可能是隨著培養(yǎng)基中的糖源消耗，營養(yǎng)物比例失調(diào)[23]，代謝產(chǎn)生的乙醇等產(chǎn)物限制了酵母的生長，使其數(shù)量處于動態(tài)平衡之中。

表2 不同觀察時期酵母的形態(tài)Table 2 Yeast morphology at different observation time

在淀粉和無糖培養(yǎng)基中，5個觀察時間點中只有第3小時觀察到酵母有少量出芽增殖的情況，可能是培養(yǎng)基中所添加的酵母膏或細(xì)胞內(nèi)積累的少量營養(yǎng)物質(zhì)為其提供少量碳源維持其生長增殖[9, 24]。在這兩種培養(yǎng)基中細(xì)胞生長緩慢、數(shù)量少、個體小。在淀粉培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞聚集程度高，這可能是在蒸汽滅菌階段，淀粉分子糊化，淀粉體積膨脹、顆粒解體，限制了酵母細(xì)胞的活動。

2.3 不同糖源對酵母糖利用的影響

2.3.1 不同糖源對培養(yǎng)基中糖含量的影響

酵母在不同生長時期，培養(yǎng)基中糖含量變化如圖6—圖9所示。

圖6 葡萄糖培養(yǎng)基中葡萄糖濃度變化Fig.6 Change of glucose concentration in glucose medium

圖7 麥芽糖培養(yǎng)基中葡萄糖濃度變化Fig.7 Change of glucose concentration in maltose medium

圖8 麥芽糖培養(yǎng)基中麥芽糖含量變化Fig.8 Change of maltose content in maltose medium

圖9 淀粉培養(yǎng)基中淀粉含量變化Fig. 9 Change of starch content in starch medium

由圖6可知，在葡萄糖培養(yǎng)基中0～7 h葡萄糖濃度下降，7 h之后趨于穩(wěn)定。這表明酵母在發(fā)酵過程中消耗葡萄糖，導(dǎo)致其濃度下降。在對數(shù)生長期時，酵母大量增殖，消耗葡萄糖的速度也在加快。穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度很少，此時酵母數(shù)量變化很小，生長速率幾乎為零。一方面，培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗將盡；另一方面，代謝產(chǎn)生的乙醇等產(chǎn)物和pH值的下降限制了酵母的生長。

由圖7和圖8可知，在麥芽糖培養(yǎng)基中麥芽糖含量逐漸下降，而葡萄糖的濃度呈現(xiàn)先逐漸上升后下降的趨勢，這說明酵母將麥芽糖分解成葡萄糖，能間接利用麥芽糖[25]。在2～8 h，麥芽糖培養(yǎng)基中麥芽糖被分解成葡萄糖，出現(xiàn)“供”大于“求”，從而葡萄糖濃度增加。隨著酵母的生長，葡萄糖濃度呈現(xiàn)下降趨勢[26]，這是因為酵母消耗葡萄糖的速度大于麥芽糖分解的速度。穩(wěn)定期后，葡萄糖濃度很低，酵母數(shù)量達(dá)到飽和，生長速率幾乎為零。

由圖9可知，在淀粉培養(yǎng)基中淀粉含量無明顯變化，酵母數(shù)量無明顯變化，表明酵母細(xì)胞在0～22 h內(nèi)，幾乎沒有分解利用淀粉。

2.3.2 不同糖源對培養(yǎng)基pH值的影響

4種培養(yǎng)基的pH值變化如圖10所示。在葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基中，pH值呈先下降后穩(wěn)定的趨勢，這是因為酵母代謝旺盛，代謝產(chǎn)物琥珀酸能影響培養(yǎng)基的pH值[8]。在葡萄糖培養(yǎng)基中，穩(wěn)定期后葡萄糖含量下降[27]，酵母數(shù)量也趨于穩(wěn)定，pH值后期趨于穩(wěn)定，這可能是酒精的累積、大分子物質(zhì)的分解和弱堿性物質(zhì)(堿性氨基酸、核苷酸、高級醇等)的大量增加所引起的[25]。在淀粉培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH值和淀粉的含量變化不明顯，表明在0～22 h酵母細(xì)胞沒有利用淀粉[28]。

圖10 4種糖源培養(yǎng)基pH值的變化Fig.10 Changes of pH in four media

3 結(jié)論

酵母在含有葡萄糖和麥芽糖的培養(yǎng)基中能大量生長增殖，均有明顯的延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期。酵母在麥芽糖培養(yǎng)基中比在葡萄糖培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期長，對麥芽糖的利用速度低于葡萄糖。酵母在淀粉培養(yǎng)基和無糖培養(yǎng)基中無明顯的生長階段，細(xì)胞數(shù)量在22 h內(nèi)僅有少量增殖，但酵母細(xì)胞能否在長期的饑餓狀態(tài)下適應(yīng)性地間接分解利用淀粉，還需要做進(jìn)一步的研究。