大豆球蛋白兔源多克隆抗血清的制備及其免疫學(xué)特性鑒定

姚利利，席 俊，陳慧彬，陳 陽(yáng)，劉德果，陳珍妮

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

大豆具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，蛋白含量高達(dá)38%，是人和動(dòng)物獲取植物蛋白的主要來(lái)源[1]。隨著大豆蛋白廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，大豆成為增加食物過(guò)敏的潛在隱患，大豆過(guò)敏反應(yīng)過(guò)程中，主要發(fā)生的是IgE依賴性的I型超敏反應(yīng)[2-5]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆包含多種過(guò)敏原，如大豆球蛋白(11S)、Gly m Bd 60k和Gly m Bd 30k[6]，大豆過(guò)敏影響全球大約6%的嬰兒和2%的成人[7]。大豆球蛋白約占總球蛋白含量的40%，分子質(zhì)量為300～380 kDa[8-9]，且該蛋白是大豆主要抗原蛋白之一，由 G1、G2、G3、G4和G5亞基組成，5個(gè)亞基中致敏性最突出的是G1、G2[10-14]，每種11S蛋白的亞基可以在還原條件下解離成酸性(A，31～45 kDa)和堿性(B，18～20 kDa)肽鏈。目前，大部分研究主要是針對(duì)大豆球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，關(guān)于其免疫學(xué)的分析以及建立該蛋白快速檢測(cè)方法的相關(guān)研究非常有限。作者從脫脂豆粉中提取大豆球蛋白，用瓊脂糖凝膠CL-6B過(guò)柱純化后免疫新西蘭兔制備多克隆抗血清(簡(jiǎn)稱多抗血清)，并進(jìn)行免疫學(xué)特性分析，為建立大豆球蛋白致敏原檢測(cè)方法和該蛋白致敏性亞基的表位定位提供了基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粉：鯤華生物技術(shù)有限公司；雄性新西蘭兔：鄭州中原玉花種兔公司；弗氏不完全佐劑(FIA)、瓊脂糖凝膠CL-6B、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、弗氏完全佐劑(FCA)：北京索萊寶科技有限公司；β-伴大豆球蛋白、花生蛋白、芝麻蛋白、麥朊蛋白：自制；化學(xué)發(fā)光辣根過(guò)氧化物酶底物液(ECL)：美國(guó)millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Tanon 2500凝膠圖像分析系統(tǒng)：上海天能科技有限公司；D500-D數(shù)顯均質(zhì)乳化器：德國(guó)Wiggens公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀、Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀：美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 免疫原的制備

參照Puppo等[15]的方法從脫脂豆粉中提取大豆球蛋白，參照韓景華[16]的方法進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析純化該蛋白，用Nanodrop ND-2000和SDS-PAGE進(jìn)行蛋白濃度與純度測(cè)定。參照文獻(xiàn)[17]配制蛋白電泳膠，初始電壓80 V，待樣品跑出濃縮膠，調(diào)節(jié)電壓至120 V。取出凝膠室溫染色3 h，脫色液脫色到蛋白條帶清晰為止，再用Tanon 2500儀器進(jìn)行分析。

1.3.2 兔源多抗血清的制備

以制備的大豆球蛋白對(duì)3只體質(zhì)量為2.5 kg的新西蘭兔進(jìn)行免疫，喂養(yǎng)一周無(wú)異樣后，耳緣靜脈取陰性血清。參照文獻(xiàn)[18-19]的方法并稍加改進(jìn)，設(shè)計(jì)免疫方案(表1)，最后取心臟血，37 ℃恒溫箱放置2 h，4 ℃冰箱過(guò)夜，使血清充分析出，-20 ℃分裝保存。

表1 免疫方案Table 1 Immunization program

1.3.3 大豆球蛋白抗血清效價(jià)測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22-23]用間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)并稍加改進(jìn)，用CBS(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)將大豆球蛋白稀釋為10 μg/mL，4 ℃包被14 h，PBST洗板，拍干；BSA封閉；加入梯度稀釋的一抗與包被抗原反應(yīng)，以未免疫血清與PBS(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液)為陰性和空白對(duì)照；加酶標(biāo)二抗(1∶ 5 000倍稀釋)與一抗反應(yīng)；加顯色液用錫紙包住孔板避光顯色15 min；用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔OD450。

1.3.4 大豆球蛋白抗血清敏感性測(cè)定

將效價(jià)測(cè)定過(guò)程中的加一抗改為加入配制成4 800～0 ng/mL的大豆球蛋白100 μL/孔，同時(shí)加入等量的抗血清(稀釋倍數(shù)為效價(jià)測(cè)定時(shí)OD450在1.0左右倍數(shù)值)，此法為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA。參照文獻(xiàn)[24]繪制曲線，曲線的半數(shù)抑制濃度(IC50)即為抗血清敏感性。

1.3.5 大豆球蛋白抗血清特異性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[25]測(cè)定多抗血清與花生蛋白、β-伴大豆球蛋白(7S)、芝麻蛋白、麥朊蛋白的交叉反應(yīng)，與敏感性測(cè)定方法類似，將標(biāo)準(zhǔn)梯度的大豆球蛋白溶液替換為標(biāo)準(zhǔn)梯度的其他蛋白溶液。交叉反應(yīng)率(CR)=(大豆球蛋白IC50/其他競(jìng)爭(zhēng)物IC50)×100%。

1.3.6 硫酸銨沉淀純化多抗血清

多抗血清的純化[20-21]：為防止多抗血清活性降低，將分裝的多抗血清先在4 ℃凍融，再置于室溫，取2 mL多抗血清與2 mL PBS混合，加入4 mL飽和硫酸銨溶液(SAS)使最終溶液的飽和度達(dá)到50%，為使沉淀充分析出，放入4 ℃冰箱靜置30 min，離心后將沉淀用PBS溶解，同上操作使溶液飽和度達(dá)到33%。再用PBS將沉淀物溶解，于4 ℃下透析3 d后分裝保存到-20 ℃冰箱。

1.3.7 大豆球蛋白Western blot鑒定

蛋白質(zhì)印跡是用于檢測(cè)生物樣品中特定蛋白質(zhì)的最常用技術(shù)。免疫印跡的測(cè)定參考文獻(xiàn)[26-27]的方法并稍加改進(jìn)，大豆球蛋白凝膠電泳后，110 mA電流下電轉(zhuǎn)150 min至PVDF膜。電轉(zhuǎn)完成后，將PVDF膜封閉1 h，洗膜， 4 ℃下與1∶10 000倍稀釋的多抗血清反應(yīng)18 h，洗膜4次，每次10 min，加二抗孵育1 h，洗膜，加ECL工作液顯影，定影。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆球蛋白SDS-PAGE鑒定

由圖1可知，1泳道為大豆分離蛋白，2、3泳道為純化前后的大豆球蛋白，可以看出其中還混有7S蛋白和其他的蛋白質(zhì)組分，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠CL-6B純化后，蛋白的純度得到提高，雜蛋白的含量相對(duì)減少。經(jīng)過(guò)Gel-Pro Analyzer分析，目標(biāo)條帶的光密度所占該條泳道光密度總和的百分比為大豆球蛋白的純度，得知純化前大豆球蛋白純度為70%，純化后純度為81%。

2.2 多抗血清的鑒定

2.2.1 多抗血清效價(jià)鑒定

影響多抗血清效價(jià)的因素較多，包括免疫原在體內(nèi)的滯留時(shí)間、免疫原注射方式等，且不同動(dòng)物對(duì)免疫原的反應(yīng)也會(huì)有很大差別。按照上述的免疫方法和程序，對(duì)每次免疫所得的血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖中縱坐標(biāo)為每次免疫后多抗血清稀釋倍數(shù)為1 600時(shí)在450 nm下的吸光度。由圖2可知，在4次免疫過(guò)程中，1號(hào)兔的抗血清效價(jià)在4次時(shí)是3只新西蘭兔中抗血清效價(jià)最高的，每只新西蘭兔的多抗血清效價(jià)隨免疫次數(shù)增加呈遞增趨勢(shì)，表現(xiàn)為450 nm的吸光度逐漸增加，總體來(lái)看，所制備的多抗血清效價(jià)逐漸升高。

注：M為蛋白質(zhì)Marker；1為脫脂豆粉；2為粗提大豆球蛋白；3為過(guò)柱后大豆球蛋白。圖1 大豆球蛋白SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of soybean glycinin

圖2 多抗血清效價(jià)Fig.2 Polyclonal antiserum titer

根據(jù)OD檢測(cè)孔/OD陰性孔≥ 2.1為陽(yáng)性，設(shè)置空白和陰性對(duì)照，第4次免疫后效價(jià)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，1、2、3號(hào)的兔源血清效價(jià)分別為1∶ 6×104，1∶ 2.6×104和1∶ 5.8×104，因此1號(hào)兔和3號(hào)兔的效價(jià)較高。制備的抗大豆球蛋白多克隆抗體效價(jià)達(dá)60 000，比陳婧舒等[8]制備的效價(jià)高出6倍。

表2 第4次免疫后多抗血清OD450Table 2 OD450 value of polyclonal antiserum after the fourth immunization

2.2.2 多抗血清敏感性鑒定

選取效價(jià)較高的1號(hào)兔和3號(hào)兔的多抗血清，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定多抗血清的敏感性。參照文獻(xiàn)[17]的方法，以抑制率(B/B0值)與競(jìng)爭(zhēng)蛋白質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)進(jìn)行線性擬合，不同質(zhì)量濃度下的大豆球蛋白對(duì)多抗血清產(chǎn)生的抑制效果如表3所示。

表3 多抗血清抑制效價(jià)Table 3 Inhibitive titers of polyclonal antiserum ng/mL

由圖3、圖4可以看出，y=-0.275 2x+1.447 5為1號(hào)兔的線性回歸方程，R2=0.993 8， 多抗血清對(duì)大豆球蛋白的半數(shù)抑制率IC50為527 ng/mL。3號(hào)兔的線性回歸方程為y=-0.280 8x+1.473 4，R2=0.983 2，多抗血清對(duì)大豆球蛋白的IC50為582 ng/mL。相比3號(hào)兔，1號(hào)兔的多抗血清敏感性更高。

圖3 1號(hào)兔多抗血清抑制曲線Fig.3 The inhibitive curve of polyclonal antiserum of rabbit No.1

圖4 3號(hào)兔多抗血清抑制曲線Fig.4 The inhibitive curve of polyclonal antiserum of rabbit No. 3

2.2.3 多抗血清特異性鑒定

選取免疫效果最好的1號(hào)兔的多抗血清進(jìn)行特異性分析，根據(jù)大豆球蛋白多抗血清的IC50值為527 ng/mL，間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制備的多抗血清與花生蛋白和β-伴大豆球蛋白的交叉反應(yīng)率為4.6%和8.6%，這可能是大豆蛋白與花生蛋白具有潛在同源性，與麥朊蛋白和芝麻蛋白的交叉反應(yīng)率均小于0.2%，基本無(wú)交叉反應(yīng)，證明所制備的兔源多抗血清具有較高的特異性。

2.2.4 純化前后多抗血清的SDS-PAGE

由圖5可知，1和2泳道為多抗血清純化前后的蛋白條帶，純化之后仍含有部分雜蛋白，相比純化前可以明顯看出經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀純化后，多抗血清中的大部分的雜蛋白被去除，即圖1泳道中的蛋白分子量較大的部分被去除，結(jié)果顯示多抗血清中所含的IgG抗體的純度提高。

注：M為Marker；1為純化前的多抗血清；2為純化后的多抗血清。圖5 純化前、后血清IgG含量Fig.5 Serum IgG contents before and after purification

2.2.5 大豆球蛋白的Western blot 鑒定

如圖6所示，大豆球蛋白Western blot測(cè)定結(jié)果表明蛋白與多抗血清結(jié)合，證明成功制備了大豆球蛋白兔源多抗血清，并且提取過(guò)程并未破壞大豆球蛋白的抗原表位，純化后的蛋白能和多抗血清反應(yīng)，經(jīng)純化后的大豆球蛋白具有免疫活性。

注： M為低分子量Marker;1為11S;2為11S Western blot。圖6 大豆球蛋白與多抗結(jié)合Western blot圖譜Fig.6 Identification of soybean glycinin and polyconal antiserum by Western blot

3 結(jié)論

本研究對(duì)大豆球蛋白進(jìn)行提取純化，測(cè)定蛋白純度達(dá)81%，多抗血清中含有較多的雜蛋白和其他成分，不同濃度的鹽離子可以使不同的蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，選擇硫酸銨是因其具有易溶解、不容易使蛋白質(zhì)變性的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)大豆球蛋白多抗血清進(jìn)行純化，蛋白電泳試驗(yàn)表明大部分的雜蛋白被除去。免疫學(xué)特性結(jié)果顯示，1號(hào)兔的多抗血清效價(jià)1∶ 6 ×104，3號(hào)兔的多抗血清效價(jià)1∶5.8 ×104，對(duì)效價(jià)較高的1號(hào)和3號(hào)測(cè)定敏感性，1號(hào)兔的多抗血清對(duì)大豆球蛋白的IC50為527 ng/mL，3號(hào)兔對(duì)大豆球蛋白的IC50為582 ng/mL，即1號(hào)兔的多抗血清敏感性更高。總體來(lái)說(shuō)1號(hào)兔的免疫效果優(yōu)于3號(hào)兔。選取1號(hào)兔進(jìn)行特異性分析，發(fā)現(xiàn)所制備的多抗血清與芝麻蛋白和麥朊蛋白交叉反應(yīng)率幾乎為零，與花生蛋白和β-伴大豆球蛋白交叉反應(yīng)率為4.6%和8.6%。對(duì)制備的大豆球蛋白多克隆抗體進(jìn)行全面免疫學(xué)特性分析，得到了效價(jià)高、敏感性好的多抗，并對(duì)抗體進(jìn)行了初步純化，免疫印跡表明大豆球蛋白具有免疫活性，所制多抗為大豆球蛋白不同種致敏性亞基的結(jié)構(gòu)定位以及研究大豆致敏蛋白中的大豆球蛋白快速檢測(cè)提供了基礎(chǔ)條件。