水通道蛋白PIP1基因過表達楊樹的光合生理過程對干旱和復(fù)水的響應(yīng)*

劉文鑫 陳志成 代永欣 萬賢崇

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京100091； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院 太谷 030800)

隨著全球氣候變化，氣溫的升高及降水格局的改變導(dǎo)致干旱或季節(jié)性干旱的頻發(fā)。近年來越來越多的研究報道干旱影響植株的正常生長，甚至導(dǎo)致植株死亡(Swensonetal.,2017;Hartmannetal.,2018;王凱等，2018)。葉片在植物生長和發(fā)育過程中起重要作用，它們需要不斷地補充水分和CO2來實現(xiàn)光合作用。光合作用期間，CO2從葉片周圍大氣通過氣孔到達氣孔下腔，然后擴散到細胞壁周圍，需要克服細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、葉綠體膜及葉綠體基質(zhì)的阻力，最后到達葉綠體基質(zhì)的羧化部位。CO2從氣孔下腔到達羧化位點擴散的流暢程度稱為葉肉導(dǎo)度(gm)。過去幾十年的大量證據(jù)證明葉肉導(dǎo)度很小，致使葉綠體中CO2濃度小于細胞間CO2濃度，因此葉肉導(dǎo)度也常常成為光合作用碳循環(huán)的限制因子(Flexasetal.,2002;Centrittoetal.,2003;Ethieretal.,2004)。葉肉導(dǎo)度的大小受到水通道蛋白(AQP)(Flexasetal.,2006;Perez-Martinetal.,2014)和碳酸苷酶(Hoetal.,2016)的調(diào)節(jié)。在植物體內(nèi)，水通道蛋白主要是質(zhì)膜水通道蛋白(PIPs)和液泡膜內(nèi)在蛋白(TIPs)。質(zhì)膜水通道蛋白(PIPs)家族分為2個亞族：PIP1和PIP2。PIP2蛋白作為主要的水分運輸通道起作用(Chrispeelsetal.,2001)，而PIP1蛋白既協(xié)助CO2的擴散(Uehleinetal.，2003)還與PIP2協(xié)作促進水分的滲透(Fetteretal.,2004)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)PIP1水通道蛋白的表達還會改變質(zhì)膜對CO2的透性(Heckwolfetal.,2011)。水通道蛋白在葉片中對CO2的擴散起促進作用，提高了光合作用；當(dāng)水通道蛋白基因的表達受抑制時植株的光合作用降低(Heckwolfetal.,2011;Flexasetal.,2006)。用氯化汞抑制水通道蛋白導(dǎo)致光合作用和葉肉導(dǎo)度降低(Miyazawaetal.,2008)。另外許多研究發(fā)現(xiàn)，在逆境條件下水通道蛋白基因的上調(diào)在維持植物生命活動中扮演重要的角色(Moshelionetal.,2015;Sreedharanetal.,2013)。因此，推測PIP1基因表達上調(diào)會導(dǎo)致葉肉導(dǎo)度的增加進而促進光合作用。

用水通道蛋白超表達或抑制表達的植株能更精確地探明水通道蛋白的功能(Heckwolfetal.,2011)。前期，作者所在實驗室獲得了轉(zhuǎn)PtPIP1;3(GenBank登錄號：MN795092 ptopip1.3)基因的84K楊(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)過表達植株。對野生型84K楊木質(zhì)部薄壁細胞、根、葉片及葉柄中質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因(PIPs)的相對表達量進行測定發(fā)現(xiàn)，PIP11;3基因的相對表達量最高。而且應(yīng)用生物信息學(xué)工具對PtPIPs的功能位點進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)PtPIP1;3含有1個微體C-末端定位信號，其結(jié)構(gòu)特異性可能意味其功能的特異性(冷華妮,2012)。因此，本研究選定PtPIP1;3基因進行其參與功能調(diào)節(jié)的研究。

植物光合作用是最容易受到干旱影響的生理活動，不管應(yīng)對短期干旱還是長期干旱，氣孔關(guān)閉是植物必然采取的保護措施(Trenberthetal.,2013)。但氣孔并不是限制光合作用的唯一因素，在植物中光合作用受到氣孔導(dǎo)度(gs)、葉肉導(dǎo)度(gm)(Flexasetal.,2012;Galmésetal.,2013;Grassietal.,2005;Zhouetal.,2013；2014)或與最大羧化速率(Vcmax)(Zhouetal.,2013；2014)、最大電子傳遞速率(Jmax)有關(guān)的光合生物化學(xué)過程的限制(Tosensetal.,2016;Veromann-Jürgensonetal.,2017;Zhouetal.,2014)。在干旱及復(fù)水過程中究竟是哪些因素限制了光合作用，目前并沒有定論(Camposetal.,2014;Chenetal.,2015;Flexasetal.,2009；2014)，這限制了對植物應(yīng)對干旱脅迫生理響應(yīng)的全面了解。因此，本研究利用楊樹轉(zhuǎn)基因植株研究PIP1s對光合參數(shù)和葉肉導(dǎo)度的影響，比較轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在干旱期間的光合參數(shù)和葉肉導(dǎo)度下降幅度及復(fù)水后的恢復(fù)速度，分析干旱及復(fù)水期間氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度和光合作用中生物化學(xué)過程對光合作用的限制程度。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因過表達(PB13)和野生型(WT)84K楊的組培苗由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點實驗室培育，于2018年6月底，選取生長健壯、長勢一致的組培苗轉(zhuǎn)移至規(guī)格為19 cm(上口)×17 cm(下口)× 21 cm(高)的花盆中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)基因材料檢測

根據(jù)Qiagen RNAeasy Mini Kit試劑盒的說明書提取楊樹葉片總RNA。用Promega SuperScriptTM Ⅲ第1鏈合成試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄來合成cDNA第1鏈。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA溶液稀釋20倍后用于熒光定量PCR(RT-qPCR)分析。熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書進行操作(劉文鑫,2015)。在LightCyler480熒光定量PCR儀上完成PCR的擴增。

PtPIP1;3基因引物序列，上游引物：5′-CATC AGCTCAAACAGACAAGGAC-3′；下游引物：5′-CAG GCTTAGTAACACCCATGACAAT-3′。內(nèi)參基因ACT引物序列，上游引物：5′-AAACTGTAATGGTCCTCC CTCCG-3′；下游引物：5′-GCATCATCACAATCACTC TCCGA-3′。

1.3 干旱脅迫及復(fù)水處理

2018年11月中旬，選取株高(123±4.8)cm的野生型84K楊(WT)、(125±6.1)cm的轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因的過表達植株(PB13)的苗木，在溫室內(nèi)進行水分控制試驗，試驗期間在夜晚進行補光2 h。通過預(yù)試驗確定干旱處理時間，使植物的光合作用降到盡可能低之后再進行復(fù)水。共設(shè)置2個處理：對照組(正常澆水，保持土壤含水量為田間持水量的75%左右)；脅迫組(利用稱重法觀察水量變化，同時少量多次補水以保證各盆達到預(yù)定的含水量，即達到田間持水量的35%，然后復(fù)水到75%左右的田間持水量)?？厮陂g，對照組保持設(shè)定的水分含量，脅迫組在干旱處理10天后復(fù)水至75%左右的田間持水量。分別于干旱處理后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天和復(fù)水后1、2、3、4天測定光合參數(shù)、土壤含水量，測定干旱第10天和復(fù)水第1、2、3天的熒光參數(shù)和CO2響應(yīng)曲線。每處理18盆，6次重復(fù)。

用鋁盒烘干法測定土壤含水量，每個基因型測6盆，取完后立刻稱取鮮質(zhì)量(FW)。之后，土樣在烘箱中105 ℃烘48 h，稱干質(zhì)量(DW)。土壤含水量=(FW-DW)/DW×100%。在試驗開始前期測定最大田間持水量，土壤含水量最終表示為占最大田間持水量的百分比。

1.4 參數(shù)測定和計算

1.4.1 光合參數(shù)測定 使用Li-6400光合作用系統(tǒng)(帶紅藍光源葉室)于每天的10:00—11:00測定氣體交換，所有測定葉片均選取第4片完全展開葉，光強為1 500 μmol·m-2s-1，葉室溫度控制在25 ℃左右。記錄凈光合作用速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)、大氣溫度(Tair)、葉片飽和水汽壓虧缺(VPDL)等參數(shù)。

在每個取樣日(停止?jié)菜牡?0天及復(fù)水的第1、2、3天)用帶有熒光葉室的Li-6400測定CO2曲線和葉綠素?zé)晒狻?/p>

在光強為1 500 μmol·m-2s-1、大氣CO2濃度(Ca)在50～1 800 μmol·mol-1變化時測定Pn-Ci曲線，設(shè)定CO2濃度為400、300、250、200、150、120、100、50、400、600、800、1 000、1 200、1 300、1 500、1 800 μmol CO2·mol-1，2個相鄰點的時間間隔為2 min。Pn-Ci曲線用于估算Rubisco的最大羧化速率(Vcmax)和最大電子傳遞速率(Jmax)(Sharkeyetal.,2007)，用非直角雙曲線模型(Farquharetal.,1980)擬合Pn-Ci曲線。

1.4.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 暗適應(yīng)一夜后，于凌晨6:00測定最小初始熒光(Fo)。計算光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm。式中：Fv為暗適應(yīng)葉片可變熒光，F(xiàn)m為暗適應(yīng)葉片最大熒光。

1.4.3 葉肉導(dǎo)度(gm)的計算 采用J變量方法計算葉肉導(dǎo)度(gm)(Harleyetal.,1992)，公式如下：

(1)

式中：Pn和Ci從Pn-Ci曲線獲得，Jflu為同一葉片的葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)，Г*為無線粒體呼吸時CO2補償點(Bernacchietal.,2002)，Rd為光下線粒體呼吸速率(Flexasetal.,2009)。用變化范圍在100～300 μmol·mol-1的Ci對應(yīng)的凈光合速率計算葉肉導(dǎo)度(gm)。估算葉綠體內(nèi)CO2濃度(Cc)=Ci-(Pn/gm)。

考慮到葉室內(nèi)部和外部CO2濃度差異，采用沸水煮葉片法來校準(zhǔn)Pn(Flexasetal.,2007)。經(jīng)測定CO2滲漏值較小(Pn<0.5 μmol·m-2s-1)，因此不采用此校準(zhǔn)值。

圖1 PB13植株和WT植株飽和水汽壓虧缺和土壤含水量在試驗期間的變化Fig.1 Variations in leaf saturated vapor pressure deficit (VPDL) and soil moisture content of PB13 and wild type poplar during experimentPB13:PtPIP1;3過表達的轉(zhuǎn)基因84K楊;WT:野生型84K楊。箭頭代表復(fù)水第1天。*表示各自的處理與對照組間存在顯著差異(P<0.05)。下同。PB13:PtPIP1;3 overexpression of poplar 84K;WT:Wild type of poplar 84K.The arrow indicates the first day of re-watering.Asterisks indicate statistical significant difference between control and treatment for the same gene type (P<0.05).The same below.

1.4.4 光合作用限制分析 光合作用限制分析有助于確定脅迫下影響光合作用的因素(Buckleyetal.,2015;Grassietal.,2005)。因此，為了比較干旱脅迫及復(fù)水期間光合作用的限制因素，采用Grassi等(2005)定量限制分析的方法，對光合作用的限制分為氣孔限制(ls)、葉肉限制(lm)和葉片生物化學(xué)限制(lb)，公式如下：

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：gt是總導(dǎo)度，gsc=gs/1.6，?A/?C是Pn-Cc曲線在Cc變化范圍為50～100 μmol CO2·mol-1時的斜率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0對所得數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗，在0.05水平上檢驗同一天處理和對照間的差異顯著性。用Sigmaplot 12.5進行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株葉片質(zhì)膜內(nèi)在蛋白基因表達量

水分脅迫處理前對轉(zhuǎn)基因84K楊葉片中PtPIP1;3基因表達量進行RT-qPCR分析，以ACT基因為內(nèi)參基因。檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因84K楊(PB13)葉片中PtPIP1;3的相對表達量是野生型植株(WT)的2.02倍，差異顯著。

2.2 葉片飽和水汽壓虧缺和土壤含水量在試驗期間的變化

試驗期間對照和脅迫植株的葉片飽和水汽壓虧缺(VPDL)維持在0.8 kPa以上，野生型(WT)和轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因植株(PB13)最大的VPDL值分別出現(xiàn)在停止?jié)菜牡?天和第9天，分別為1.58、1.56 kPa(圖1A)。試驗期間土壤含水量在干旱第10天降到田間持水量的35%左右，此時開始進行復(fù)水，復(fù)水到田間持水量的80%左右(圖1B)。

2.3 PtPIP1;3上調(diào)表達楊樹的光合作用對干旱和復(fù)水的響應(yīng)

試驗期間正常澆水條件下，PB13植株的凈光合速率(Pn)(13.8～20.5 μmol CO2·m-2s-1)顯著高于WT(10.4～13.1 μmol CO2·m-2s-1)。干旱處理的最初5天PB13和WT的處理與其對照之間的Pn均無明顯差異，干旱至第6天，Pn均快速降低；到第10天 WT和PB13的Pn分別只有其對照的15%和7%(圖2A)。復(fù)水1天后恢復(fù)到對照的36%(WT)和64%(PB13)，復(fù)水4天后恢復(fù)到對照的79%(WT)和96%(PB13)，PB13已經(jīng)恢復(fù)到對照水平。

PB13植株的氣孔導(dǎo)度(gs)(0.36 mol CO2·m-2s-1)總體上明顯高于WT植株(0.265 mol CO2·m-2s-1)。干旱至第4～5天，gs開始緩慢降低，分別降到對照的78%(WT)和83%(PB13)；到第7～10天，氣孔幾乎完全關(guān)閉，gs降到0.05 mol CO2·m-2s-1左右(圖2B)。復(fù)水1天后WT的gs恢復(fù)到對照的25%，PB13恢復(fù)到對照的32%；復(fù)水4天后分別為對照的66%和76%。干旱脅迫后2種植株gs的下降速度快于Pn，但復(fù)水后的恢復(fù)速度較慢。

干旱期間胞間CO2濃度(Ci)的下降幅度相對較小，前5天逐漸降低，第6天迅速降低，在第10天迅速增加，甚至高于對照；復(fù)水后恢復(fù)(圖2C)。蒸騰速率(Tr)的變化規(guī)律(圖2D)與gs基本一致。

在干旱第10天后葉肉導(dǎo)度(gm)分別降到對照的7%(WT)和1%(PB13)。復(fù)水1天后WT植株恢復(fù)到對照的41%，而PB13植株的gm超過對照；復(fù)水3天后分別為對照的73%和76%(表1)。干旱期間，gm的降低導(dǎo)致葉綠體CO2濃度(Cc)也受到抑制。干旱第10天Cc為對照的41%(WT)和28%(PB13)。復(fù)水后由于gm的恢復(fù)，復(fù)水1天后2種植株的Cc恢復(fù)到對照水平，PB13高于對照；復(fù)水3天后WT的Cc顯著高于對照，而PB13的低于對照(表1)。

與對照相比，Rubisco的最大羧化速率(Vcmax)在干旱10天后降為對照的35%(WT)和19%(PB13)(表1)。復(fù)水3天后，Vcmax和最大電子傳遞速率(Jmax)分別為對照的70%和66%(WT)、66%和92%(PB13)，其中PB13的Jmax已經(jīng)恢復(fù)到對照水平(表1)。

圖2 PB13植株和WT植株光合參數(shù)在試驗期間的變化Fig.2 Variations in photosynthetic parameters of PB13 and WT during the experiment

表1 脅迫和復(fù)水期間PB13和WT的葉肉導(dǎo)度(gm)、Rubsico最大羧化速率(Vcmax)、最大電子傳遞速率(Jmax)和葉綠體CO2濃度(Cc)的變化①Tab.1 Variations in mesophyll conductance(gm),Rubisco maximum carboxylation rate(Vcmax),maximum electron transport rate(Jmax),and chloroplast CO2 concentration(Cc) of PB13 and WT under water stress and re-watering

① 數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。此處脅迫(S)是干旱處理10天，RE1、RE2、RE3分別代表復(fù)水1、2、3天。不同字母表示同一天對照和處理組間的統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.05)。Data are means±SD.The stress(S) here is drought treatment for 10 days.The RE1,RE2 and RE3 refer to re-watering for one,two or three days.Different letters indicate statistical differences between control and treatment in the same day (P<0.05).

圖3 PB13植株和WT植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)在試驗期間的變化Fig.3 Variations in chlorophyll fluorescence parameters of PB13 and WT during the experimentStress代表干旱脅迫10天，RE1、RE2、RE3分別代表復(fù)水1天、2天、3天。*表示各自的處理和對照組間存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P<0.05)。The “Stress” here is drought treatment for 10 days.The RE1,RE2 and RE3 refer to re-watering for one,two or three days.Asterisks indicate statistically significant difference between control and treatment for the same gene type (P<0.05).

2.4 葉綠素?zé)晒鈱Ω珊岛蛷?fù)水的響應(yīng)

光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)的值在試驗期間維持在0.78以上，與對照相比沒有顯著變化(圖3A)。光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)淬滅(qP)在干旱10天后降為對照的55%(PB13)和85%(WT)(圖3B)。光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)量子效率(ФPSII)在干旱處理后降為對照的43%(PB13)和80%(WT)(圖3C)。電子傳遞速率(Jflu)降為對照的44%(PB13)和80%(WT)(圖3D)。PB13植株在復(fù)水第3天時qP、ФPSII和Jflu都恢復(fù)到對照水平，而WT尚未明顯恢復(fù)(圖3B、C、D)。

2.5 光合作用的限制因素

從Pn和gs的變化來看，在干旱的前5天，氣孔不是限制光合作用的主要因素，可能受到葉肉和生物化學(xué)的限制。隨著干旱程度的加劇，葉肉限制(lm)成為主要的限制因素，甚至為氣孔限制(ls)的4倍(WT)和13倍(PB13)(表2)，其次為ls。復(fù)水后，光合作用的主要限制因素是葉肉導(dǎo)度(lm)和生物化學(xué)限制(lb)，而且二者交替變化。復(fù)水1天后lb迅速增加并成為主要的限制因素。隨后，lm逐漸增加，成為更主要的限制因素(表2)。

表2 干旱脅迫及復(fù)水后PB13和WT植株的光合作用限制因素分析①Tab.2 Limitation factors of photosynthesis of PB13 and WT under water stress and re-watering

① 數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。此處脅迫是干旱處理10 天，RE1、RE2、RE3分別代表復(fù)水1、2、3 天。Data are means±SD.The stress here is drought treatment for 10 days.The RE1,RE2 and RE3 refer to re-watering for one,two or three days.

3 討論

水通道蛋白(AQP)除了具有運輸水分的能力，其運輸CO2的能力也在植物生長過程中起重要的作用。如煙草(Nicotianatabacum)中NtAQP1的表達促進了CO2在植物細胞中的運輸，說明水通道蛋白能增加質(zhì)膜對CO2的透性(Uehleinetal.,2003)。免疫學(xué)和翻譯融合方法進一步證明了NtAQP1存在于保衛(wèi)細胞和葉肉細胞中，在質(zhì)膜和葉綠體內(nèi)膜都有分布；后者的分布預(yù)示了水通道蛋白在CO2吸收方面的作用(Uehleinetal.,2008)。從正常澆水的轉(zhuǎn)基因和野生型的84K楊的光合參數(shù)看，水通道蛋白過表達植株的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(gs)和蒸騰速率(Tr)高于野生型植株，說明水通道蛋白過表達能促進植株的光合作用。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)敲除PIP1;2基因?qū)е氯~肉導(dǎo)度(gm)降低40%(Heckwolfetal.,2011)；而本研究發(fā)現(xiàn)在正常澆水植株中，過表達植株葉肉導(dǎo)度比野生型的高40%左右。盡管葉肉導(dǎo)度還與細胞壁和碳酸苷酶有關(guān)(Evansetal.,2009)，但從上述結(jié)果來看CO2的跨膜透性是葉肉導(dǎo)度的限制因子。

3.1 光合作用對干旱脅迫和復(fù)水的響應(yīng)

干旱脅迫導(dǎo)致的Pn、gs和gm的降低速度比復(fù)水后的恢復(fù)速度慢。復(fù)水1天后PtPIP1;3過表達植株的gm恢復(fù)到對照水平之上。復(fù)水3天后，過表達植株的Pn恢復(fù)到對照水平。gs的降低導(dǎo)致CO2的擴散阻力增加，降低了葉綠體中CO2的可利用性，從而導(dǎo)致光合作用的降低(Flexasetal.,2002)。復(fù)水后，過表達植株光合作用的恢復(fù)程度大于野生型植株，說明水通道蛋白過表達后轉(zhuǎn)基因植株的光合參數(shù)恢復(fù)速度更快。干旱脅迫除了導(dǎo)致氣孔關(guān)閉外，非氣孔因素的作用也扮演很重要的角色。在干旱脅迫期間氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度都降低，這在其他物種中已經(jīng)得到證實(Galmésetal.,2007;Flexasetal.,2008)。本試驗中在干旱脅迫10天后，葉肉導(dǎo)度的下降幅度最大，其次為氣孔導(dǎo)度。干旱脅迫后Rubisco最大羧化速率(Vcmax)降為對照的35%(野生型)和19%(轉(zhuǎn)基因植株)，這可能是由于Rubisco酶活性降低導(dǎo)致的(Lawloretal.,2009)。而Rubisco最大羧化速率(Vcmax)和最大電子傳遞速率(Jmax)的下降幅度沒有氣孔導(dǎo)度(gs)和葉肉導(dǎo)度(gm)的下降幅度大，說明光合作用的降低主要受到氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度的制約。復(fù)水1天后轉(zhuǎn)基因植株的葉肉導(dǎo)度迅速恢復(fù)，可能與其Vcmax和Jmax的恢復(fù)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，Vcmax的增加以響應(yīng)gm的降低可以促進光合作用能力的提升，有助于復(fù)水期間光合作用能力的維持(Galleetal.,2011)。

3.2 葉綠素?zé)晒鈱Ω珊得{迫和復(fù)水的響應(yīng)

干旱脅迫后PtPIP1;3過表達植株的光化學(xué)淬滅(qp)、光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ФPSⅡ)，以及電子傳遞速率(Jflu)的下降幅度大于野生型，而且在復(fù)水第3天恢復(fù)到對照水平，野生型則沒有，反映了在復(fù)水條件下過表達植株光系統(tǒng)的恢復(fù)能力更強。結(jié)合氣體交換的數(shù)據(jù)來看，光合作用降低，用于光化學(xué)消耗的能量減少，所以熱量逐漸通過葉黃素(非光化學(xué)淬滅)消散(Demmig-Adamsetal.,2000)。如果干旱程度嚴(yán)重或持續(xù)時間很長，植物就難以安全地消散額外的熱量，植物的光保護機制也會退化(Chavesetal.,2009)，這可能導(dǎo)致光系統(tǒng)Ⅱ性能受損(Kalajietal.,2016)，光合能力降低(Flexasetal.,2004)，直接影響光合電子傳遞和CO2的同化(云菲等,2010)。本研究中在嚴(yán)重干旱的情況下野生型84K楊的qp、ФPSⅡ及Jflu都下降，表明光系統(tǒng)Ⅱ的性能可能受損，且復(fù)水后不能恢復(fù)；而PtPIP1;3過表達植株在干旱期間也有損傷，但復(fù)水后能很快修復(fù)，說明轉(zhuǎn)水通道蛋白基因的植株在復(fù)水后光系統(tǒng)Ⅱ的恢復(fù)速度更快，其機制尚不清楚。

3.3 干旱脅迫和復(fù)水期間光合作用限制因素分析

轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因植株在復(fù)水后很快恢復(fù)了葉肉導(dǎo)度，使得葉綠體內(nèi)CO2供應(yīng)充足，光合作用的光反應(yīng)和暗反應(yīng)(碳還原)相對平衡；而野生型植株的葉肉導(dǎo)度沒有及時恢復(fù)，CO2短缺，使得光反應(yīng)產(chǎn)生的還原力不能及時消耗，導(dǎo)致產(chǎn)生光氧化(Kozakietal.,1996)，使得光合系統(tǒng)受到損害，因而在復(fù)水期間恢復(fù)緩慢。之前筆者所在實驗室的試驗(劉文鑫等,2019)發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫過程中野生型84K楊的光合速率降到最低時立即復(fù)水，葉肉導(dǎo)度完全恢復(fù)到對照水平，生物化學(xué)限制是復(fù)水期間光合作用的主要限制因素；而本研究在光合速率降到最低時少量補水，并繼續(xù)維持在最低點附近干旱處理3天，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因和野生型植株的葉肉導(dǎo)度沒有完全恢復(fù)并成為限制光合的主要因素之一。

分析光合限制因素發(fā)現(xiàn)，在干旱第10天，葉肉導(dǎo)度限制(lm)成為主要的限制因素。氣孔導(dǎo)度、葉肉導(dǎo)度和光合生物化學(xué)對光合的限制因物種而異，在干旱條件下光合作用的抑制首先是因為氣孔導(dǎo)度和葉肉導(dǎo)度的降低，然后在更嚴(yán)重的干旱脅迫下光合作用中生物化學(xué)過程抑制增加(Flexasetal.,2009;Galleetal.,2009;Galmésetal.,2017;Grassietal.,2005)。而本研究中葉肉導(dǎo)度限制是干旱脅迫后期限制光合作用的主要因素。對復(fù)水的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，光合作用的恢復(fù)受葉肉導(dǎo)度限制影響最大，其次為光合作用中生物化學(xué)限制(lb)。本研究的結(jié)果與Galmés等(2007)的結(jié)果一致，即葉肉導(dǎo)度(gm)是嚴(yán)重干旱后限制光合作用恢復(fù)的主要因素。目前關(guān)于葉肉導(dǎo)度是嚴(yán)重干旱脅迫后主要限制因素的報道比較少。本研究強調(diào)了葉肉導(dǎo)度在楊樹干旱脅迫和復(fù)水后光合作用響應(yīng)方面的重要性，因此有必要進一步了解葉肉導(dǎo)度的調(diào)節(jié)作用，尤其與環(huán)境和葉片解剖結(jié)構(gòu)相關(guān)的方面。

3.4 復(fù)水后PtPIP1;3基因促進楊樹光合能力的恢復(fù)

從干旱第6天起，PtPIP1;3基因過表達植株的gs下降和恢復(fù)速度均大于野生型植株。Wang等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，MdPIP1;3基因增加番茄(Solanumlycopersicum)對干旱脅迫的忍耐，復(fù)水后轉(zhuǎn)基因植株迅速恢復(fù)，野生型死亡；轉(zhuǎn)基因番茄的氣孔在正常生長條件下開放更大，干旱12天后，77%的氣孔關(guān)閉，而野生型的有65%還在開放，說明轉(zhuǎn)基因植株在響應(yīng)干旱脅迫時氣孔關(guān)閉比野生型快。轉(zhuǎn)基因植株的氣孔關(guān)閉迅速說明耐旱性的增加部分是因為減少了水分流失，與本研究結(jié)果相同。在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因植株保衛(wèi)細胞迅速降低膨壓來關(guān)閉氣孔，以減少水分通過氣孔的流失。在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)NtAQP1和VfPIP1在鹽脅迫和干旱脅迫下改變轉(zhuǎn)基因植株的氣孔導(dǎo)度(Cuietal.,2008;Sadeetal.,2014)。轉(zhuǎn)MusaPIP1;2基因超表達的香蕉(Musaacuminata)在非生物脅迫(干旱、鹽和寒冷)后的恢復(fù)能力比非轉(zhuǎn)基因的更強(Sreedharanetal.,2013)。因此本研究的結(jié)果說明轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因的楊樹可能通過有效的氣孔關(guān)閉來減少蒸騰減少水分流失。另外，PtPIP1;3基因過表達也改變了復(fù)水后光合作用的恢復(fù)動態(tài)。轉(zhuǎn)基因植株葉肉導(dǎo)度(gm)迅速恢復(fù)，使得復(fù)水初期主要是lb限制光合作用，隨著CO2供應(yīng)充足，葉綠體內(nèi)光反應(yīng)和暗反應(yīng)過程趨于平衡，光氧化降低、光合化學(xué)機制逐漸恢復(fù)，lb限制減弱；而野生型的相反，gm恢復(fù)緩慢，所以葉肉導(dǎo)度限制(lm)一直是主要的限制因子，另一方面，光合化學(xué)機制恢復(fù)也較慢，至復(fù)水第3天，lb仍相對較大。

4 結(jié)論

通過對轉(zhuǎn)水通道蛋白基因及野生型84K楊進行干旱及復(fù)水處理后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PtPIP1;3基因84K楊的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率對干旱脅迫反應(yīng)更加敏感。在嚴(yán)重干旱時，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的光合作用都主要受到葉肉導(dǎo)度的限制。與野生型植株相比，轉(zhuǎn)基因植株葉肉導(dǎo)度和光合作用在復(fù)水后恢復(fù)更迅速。在復(fù)水過程中，氣孔導(dǎo)度持續(xù)恢復(fù)，而葉肉導(dǎo)度和光合作用的生物化學(xué)過程交替恢復(fù)。此時，光合作用除了受到葉肉導(dǎo)度的主要限制外，還受到與Rubisco最大羧化速率(Vcmax)有關(guān)的生物化學(xué)特性的限制。