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    農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系*

    2020-03-19 08:12:54劉閔豪徐郡儡李周岐范睿深
    林業(yè)科學(xué) 2020年2期
    關(guān)鍵詞:杜仲共培養(yǎng)抗性

    劉閔豪 徐郡儡 葉 靖 李周岐 范睿深 李 龍

    (西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100)

    杜仲(Eucommiaulmoides)是我國特有的重要經(jīng)濟(jì)樹種。杜仲樹皮為傳統(tǒng)中藥材,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,其主要藥用成分為木質(zhì)素、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯基丙烷、多糖、氨基酸、其他萜類和脂肪族(張京京等,2014)。此外,杜仲樹皮、樹葉及果實(shí)中含有杜仲膠(反式聚異戊二烯),具有耐水性、耐腐蝕性、低溫塑性、良好的韌性和溶解性,在化工領(lǐng)域具有巨大的潛力(Fang,2016)。

    由于木本植物生長周期長與生長環(huán)境控制難等原因,傳統(tǒng)的杜仲雜交育種要經(jīng)過很長時間才能獲得新的品種,嚴(yán)重制約了杜仲資源的開發(fā)利用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,組織培養(yǎng)與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)廣泛運(yùn)用于林木育種研究中,克服了傳統(tǒng)育種的不足,具有良好的前景(Girietal.,2004)。杜仲組織培養(yǎng)的研究早在20世紀(jì)80年代就開始進(jìn)行,到目前為止,已有以子葉和下胚軸為外植體的再生體系,以及葉和腋芽的組織培養(yǎng)研究報(bào)道(張朝成,1988;Chenetal.,1995;2008;李琰等,2006;袁云香,2012),在此基礎(chǔ)上,對愈傷組織的繼代條件進(jìn)行了研究,初步構(gòu)建了以葉片為外植體的再生體系(金曉玲等,2014)。盡管如此,杜仲組織培養(yǎng)仍存在愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率低、不定芽再生困難等問題(劉慧敏等,2016),這導(dǎo)致杜仲目前沒有以成熟植株組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系研究的報(bào)道,僅有以下胚軸為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系(趙丹等,2009;李巖等,2011),下胚軸屬于子代材料,不能代表原優(yōu)良品種的遺傳背景(Sidorovaetal.,2017),這一局限性嚴(yán)重制約了杜仲基因功能與遺傳改良的研究。

    本研究以杜仲優(yōu)良品種‘華仲4號’成年植株葉片為材料,優(yōu)化了葉片愈傷組織的再生體系,并在此基礎(chǔ)上研究了愈傷組織對抗生素與抑菌劑的敏感性。以獲得的葉片愈傷組織受體系統(tǒng)為基礎(chǔ),通過正交試驗(yàn)探索不同轉(zhuǎn)化因子對GUS瞬時表達(dá)率的影響。使用最適轉(zhuǎn)化因子組合對約200個愈傷組織進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化操作,共篩選獲得3個抗卡那霉素(Km)的抗性芽,PCR檢測證明這些抗性芽中存在NPTⅡ基因。本研究構(gòu)建的體系使得在杜仲成熟材料中進(jìn)行基因遺傳轉(zhuǎn)化的研究成為可能,為杜仲基因功能的研究與定向改良奠定基礎(chǔ),對杜仲資源的開發(fā)利用具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    杜仲成年植株葉片采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院試驗(yàn)苗圃種植的‘華仲4號’(杜蘭英等,2014),該優(yōu)良品種于2005年從河南靈寶引種至西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)苗圃,樹齡14年。采集時間為4—5月,此時間段采集的外植體具有最低的污染率(羅麗,2009)。

    遺傳轉(zhuǎn)化使用的植物表達(dá)載體為pBI121,含有該表達(dá)載體的農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105 由西北農(nóng)林科技大學(xué)劉雅莉教授惠贈。

    1.2 杜仲葉片的表面滅菌

    采集的葉片在自來水中沖洗3 h,然后使用75%(V/V)酒精清洗30 s,再浸泡在5%(M/V)次氯酸鈉溶液中5 min進(jìn)行表面滅菌,消毒后用無菌蒸餾水沖洗3次,放在無菌濾紙上干燥,切成約0.5 cm×0.5 cm的小片備用。

    1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖

    將切成小片的葉片接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每瓶3到4片,葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為MS + 8.1 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA。接種后在(24±2)℃的溫度下暗培養(yǎng)4天,再在光照條件下培養(yǎng)30~40天,光照周期為每日16 h,溫度為(24±2) ℃。獲得的葉片愈傷組織采用MS + 0.27 μmol·L-1NAA + 6.7 μmol·L-16-BA的繼代培養(yǎng)基(金曉玲等,2014),繼代周期為18天。

    1.4 不定芽誘導(dǎo)與復(fù)壯培養(yǎng)基的優(yōu)化

    將繼代培養(yǎng)2個周期的愈傷組織接種于含不同濃度大量元素的MS(MS,3/4MS)培養(yǎng)基中,添加不同濃度的NAA(0、0.27、0.54 μmol·L-1)和6-BA(0、4.4、6.7、8.8 μmol·L-1),培養(yǎng)3周后,統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率(誘導(dǎo)出不定芽的愈傷組織/所有愈傷組織)。將愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽接種到含不同濃度NAA(0.054、0.27 μmol·L-1)和6-BA(4.4、8.8 μmol·L-1)的MS(MS,3/4MS)培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)壯,3周后測量不定芽伸長長度。每個處理50個愈傷組織,培養(yǎng)條件同1.3的光照培養(yǎng)條件,整個試驗(yàn)重復(fù)3次,使用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析。

    1.5 杜仲愈傷組織抑菌劑和抗生素敏感性試驗(yàn)

    遺傳轉(zhuǎn)化的抗性芽選擇培養(yǎng)基以不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,抑菌劑為頭孢霉素(Cef),篩選用的抗生素為卡那霉素(Km)。將愈傷組織分別接種于含不同濃度Cef(0、50、100、200、300 mg·L-1)和Km(0、25、50、100、200 mg·L-1)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每個處理30塊愈傷組織,培養(yǎng)條件同1.3的光照培養(yǎng)條件。3周后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率,分析愈傷組織對抑菌劑和抗生素的敏感性,以獲得最適合的選擇培養(yǎng)基。

    1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    根據(jù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化體系(趙丹等,2009;李巖等,2011)和其他植物愈傷組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(Yangetal.,2010;Abdallatetal.,2011;Trivellini,2015;黃天帶等,2010;陳子龍等,2014),本試驗(yàn)選擇了4個可能影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率的轉(zhuǎn)化因子(預(yù)培養(yǎng)時間、侵染時間、共培養(yǎng)時間和乙酰丁香酮濃度)進(jìn)行研究,通過L16(45) 的正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),轉(zhuǎn)化因子的水平如表1所示。

    1.7 遺傳轉(zhuǎn)化操作

    將-80 ℃冰箱中保存的農(nóng)桿菌甘油菌使用接種環(huán)接種于固體LB培養(yǎng)基上劃線活化,28 ℃倒置培養(yǎng)16 h,再挑取平板上的單克隆接種于50 mL含50 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中,于28 ℃、180 r·min-1的搖床震蕩過夜培養(yǎng),直到OD600值達(dá)到0.6~0.7。將農(nóng)桿菌懸浮液在室溫下以4 000 r·min-1離心10 min收集菌體,再使用不含激素的無菌液體MS培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌,重懸至OD600值達(dá)到0.6后加入不同水平濃度的乙酰丁香酮(AS)備用。

    正交試驗(yàn)的每個處理均使用50塊愈傷組織,接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織置于農(nóng)桿菌重懸液中進(jìn)行侵染,侵染后使用無菌濾紙吸干菌液,接種于普通的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基,于(24±2)℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)。

    1.8 GUS組織化學(xué)染色

    使用GUS組織化學(xué)染色法(Jefferson,1987)檢測GUS瞬時表達(dá)效率。具體為各處理的愈傷組織在共培養(yǎng)后,置于X-Gluc染色液(GUS染色液,Solarbio)中,37 ℃染色6 h,使用90%(V/V)和70%(V/V)的酒精分別脫色24 h,以除去葉綠素。統(tǒng)計(jì)愈傷組織的染色情況,進(jìn)行染色強(qiáng)度的評級(孟妮等,2018),并以GUS組織化學(xué)染色結(jié)果代表GUS瞬時表達(dá)效率(含藍(lán)色GUS染色位點(diǎn)愈傷組織/所有愈傷組織),使用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并進(jìn)行方差分析。

    1.9 抗性芽的篩選

    使用獲得的瞬時轉(zhuǎn)化體系對愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作,將共培養(yǎng)后愈傷組織使用CEFO水(含200 mg·L-1Cef的無菌蒸餾水)沖洗3次,再在含100 mg·L-1Cef的液體MS培養(yǎng)基中浸泡10 min脫毒,使用無菌濾紙吸干多余液體后,接種于選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng),篩選獲得抗性芽,培養(yǎng)條件同1.3的光照培養(yǎng)條件。篩選出的抗性芽使用GUS組織染色法(同1.8)和PCR法進(jìn)行檢測。

    1.10 抗性芽的PCR檢測

    使用CTAB法從獲得的抗性芽葉片中提取總DNA,以沒有進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片DNA和pBI121質(zhì)粒作為對照進(jìn)行PCR檢測。以NPTⅡ基因?yàn)闄z測標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)特異性引物:上游引物為5′-TCACTTCGCTCGCGGAGAA-3′,下游引物為5′-AGAGGVGATAGAGCGAGATGC-3′,擴(kuò)增片段長度為465 bp。PCR反應(yīng)體系為:94 ℃ 3 min預(yù)變性;98 ℃變性10 s,60℃退火20 s,72 ℃延伸70 s,共30個循環(huán);再72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

    表1 轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)①Tab.1 Factors and levels of L16 (45) orthogonal experiments

    ①AS:乙酰丁香酮 Acetosyringone.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 大量元素與生長調(diào)節(jié)劑對杜仲葉片愈傷組織再生體系的影響

    葉片接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS + 8.1 μmol·L-1NAA+ 4.4 μmol·L-16-BA)上培養(yǎng)25天左右,葉片逐漸膨大,并在切口處出現(xiàn)小塊愈傷組織,誘導(dǎo)率達(dá)90%,這些愈傷組織在幾天內(nèi)迅速生長(圖1a),35天左右即需進(jìn)行繼代培養(yǎng)。愈傷組織接種到繼代增殖培養(yǎng)基(MS + 0.27 μmol·L-1NAA+ 6.7 μmol·L-16-BA)進(jìn)行增殖培養(yǎng)時,會在繼代培養(yǎng)20天后出現(xiàn)褐化,因此適宜的繼代培養(yǎng)周期為18~20天,胚性愈傷組織約在連續(xù)繼代培養(yǎng)2次后形成(圖1b),能夠進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。這些試驗(yàn)結(jié)果與金曉玲等(2014)的研究結(jié)果相似。

    不定芽誘導(dǎo)和復(fù)壯培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明:愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率受到6-BA和NAA配比的影響,當(dāng)6-BA與NAA濃度比為16∶1時,不定芽的誘導(dǎo)率最高。此外,3/4濃度大量元素的MS培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率更高。在3/4MS + 0.27 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA的培養(yǎng)基上,不定芽誘導(dǎo)率最高(83%±10%),并且誘導(dǎo)的芽更加健康(圖1c)。不定芽復(fù)壯的結(jié)果與不定芽誘導(dǎo)的結(jié)果相似,不定芽的伸長長度受大量元素濃度影響更顯著,在3/4MS + 0.054 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-1的6-BA的培養(yǎng)基中芽伸長長度最長,為(2.47±1.33) cm(圖1d)。

    2.2 頭孢霉素與卡那霉素對不定芽誘導(dǎo)的影響

    抑菌劑與抗生素敏感性試驗(yàn)(表3)表明:在含有300 mg·L-1Cef和50 mg·L-1Km的MS培養(yǎng)基上,愈傷組織仍呈黃褐色,但是無法誘導(dǎo)不定芽;在含400 mg·L-1Cef和70 mg·L-1Km的MS培養(yǎng)基上,愈傷組織則完全褐化死亡。因此,遺傳轉(zhuǎn)化的選擇培養(yǎng)基中,抑菌劑頭孢霉素的濃度為200 mg·L-1,能抑菌并不會對愈傷組織產(chǎn)生過大影響;篩選用的抗生素卡那霉素濃度為70 mg·L-1,能夠?qū)е虏缓琄m抗性的野生型愈傷組織死亡,從而篩選出有Km抗性的抗性芽。

    圖1 杜仲葉片誘導(dǎo)愈傷組織及其再生過程Fig.1 Callus induction and plant regeneration in E.ulmoidesa.葉片在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS + 8.1 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA)上培養(yǎng)5周形成的愈傷組織;b.在繼代增殖培養(yǎng)基(MS + 0.27 μmol·L-1 NAA + 6.7 μmol·L-1 6-BA)上繼代培養(yǎng)2個周期的愈傷組織;c.愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(3/4MS + 0.27 μmol·L-1 NAA + 4.4 μmol·L-1 6-BA)上培養(yǎng)2周誘導(dǎo)的不定芽;d.在不定芽復(fù)壯培養(yǎng)基(3/4MS + 0.054 μmol·L-1 NAA + 4.4 μmol·L-1)上復(fù)壯2周的不定芽;e.在不定芽復(fù)壯培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2次獲得的植株。a.Callus induction on callus induction medium (MS with 8.1 μmol·L-1 NAA and 4.4 μmol·L-1 6-BA) after 5 weeks;b.Callus multiplication on callus subculture medium (MS with 0.27 μmol·L-1 NAA and 6.7 μmol·L-1 6-BA) after sub-cultured twice;c.Adventitious bud induction on shoot induction medium (3/4MS with 0.27 μmol·L-1 NAA and 4.4 μmol·L-16-BA) after 2 weeks;d.Shoot multiplication on shoot regeneration medium (3/4MS with 0.054 μmol·L-1 NAA and 4.4 μmol·L-1 6-BA) after 2 weeks;e.Plants on shoot regeneration medium after sub-cultured twice.

    表2 不同濃度的大量元素、NAA、6-BA對杜仲不定芽誘導(dǎo)和復(fù)壯的影響①Tab.2 Effect of different concentrations of macro-element,NAA and 6-BA on shoot induction and regeneration

    ①SD表示來自3次試驗(yàn)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)后的小寫字母表示使用Tukey (P≤0.05)均值差異顯著性檢驗(yàn)所劃分的差異顯著性。Data represent means ± SD from 3 biological replicates.Means followed by different letters are signicantly different using a Tukey test (P≤0.05).

    表3 頭孢霉素(Cef)與卡那霉素(Km)對不定芽誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different concentrations of Cef and Km on shoot induction

    2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化因子

    通過L16(45)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1),共進(jìn)行了16組不同水平處理的轉(zhuǎn)化因子組合試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果表明:GUS瞬時表達(dá)率高的處理組合其愈傷組織染色程度(圖2)也更強(qiáng)(表4),其中侵染時間與共培養(yǎng)時間對GUS瞬時表達(dá)率有顯著影響(P≤0.05),即侵染時間與共培養(yǎng)時間顯著影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率,而AS濃度和預(yù)培養(yǎng)時間的影響不顯著(表5)。比較均值可以發(fā)現(xiàn)GUS瞬時表達(dá)率隨著侵染時間和共培養(yǎng)時間的增加以“S形”曲線上升(侵染時間的GUS瞬時表達(dá)率均值為:6 min 22.0%、8 min 16.0%、10 min 35.0%、15 min 33.8%;共培養(yǎng)時間的GUS瞬時表達(dá)率均值為:1天10.8%、2天16.5%、3天38.5%、4天41.0%),侵染10 min和共培養(yǎng)3天的GUS瞬時表達(dá)率達(dá)到了高值;4天的共培養(yǎng)時間雖然瞬時表達(dá)率均值更高,但提升較小并且對愈傷組織傷害較大。此外,雖然預(yù)培養(yǎng)時間對GUS瞬時表達(dá)率沒有顯著影響,但預(yù)培養(yǎng)5天的GUS瞬時表達(dá)率均值高于其他預(yù)培養(yǎng)時間(預(yù)培養(yǎng)時間的GUS瞬時表達(dá)率均值為:0天24.0%、2天17.8%、5天37.5%、10天27.5%)。根據(jù)這些試驗(yàn)結(jié)果可以獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的最佳轉(zhuǎn)化因子組合是:預(yù)培養(yǎng)5天,侵染10 min,共培養(yǎng)3天。

    2.4 抗性芽的檢測

    總計(jì)約200塊愈傷組織進(jìn)行了最適轉(zhuǎn)化因子組合的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,在選擇培養(yǎng)基上共獲得3個抗Km的抗性芽(圖3)。對抗性芽的葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色,3個抗性芽葉片均呈藍(lán)色,而未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的愈傷組織和不定芽葉片的GUS組織化學(xué)染色均為無色(圖4),這表明GUS基因在抗性芽中得到了表達(dá)。使用NPTⅡ基因的特異引物對抗性芽、未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片和pBI121質(zhì)粒的PCR分析(圖5)表明:在抗性植株和pBI121質(zhì)粒中檢測到NPTⅡ基因的465 bp擴(kuò)增產(chǎn)物,而在未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的不定芽葉片中沒有該擴(kuò)增產(chǎn)物。GUS檢驗(yàn)與PCR分析初步證明T-DNA已經(jīng)整合到了這些抗性芽的基因組中。

    圖2 愈傷組織GUS組織化學(xué)染色評級模式Fig.2 Pattern of scoring for the histochemical GUS assay of callusa.空白對照;b.未染色;c.+(染色程度淺);d.++(染色程度中等);e.+++(染色程度強(qiáng))。a.Blank control;b.Unstained;c.+(staining is shallow);d.++(staining moderate);e.+++(staining the strongest).

    表4 轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)的GUS瞬時表達(dá)①Tab.4 Transient GUS expression in L16 (45) matrix of factors of genetic transformation

    ① +、++和+++分別表示染色程度淺、中等和強(qiáng)的愈傷組織染色率(圖2)。+,++,and +++ indicate the staining rate of the callus with a light,medium and strong level(Fig.2).

    表5 轉(zhuǎn)化因子正交試驗(yàn)GUS瞬時表達(dá)的方差分析①Tab.5 ANOVA of transient GUS expression frequency in L16 (45) matrix of factors of genetic transformation

    ①*:差異顯著Significant difference(P<0.05).

    圖3 抗Km的抗性芽Fig.3 Km-resistant budsa,b,c.愈傷組織在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周誘導(dǎo)出的3個抗性不定芽。a,b,c.A total of 3 Km-resistant buds induced on the selection medium (3/4MS + 0.054 μmol·L-1 NAA + 4.4 μmol·L-1 6-BA + 200 mg·L-1 Cef + 70 mg·L-1 Km) after 2 weeks.

    圖4 愈傷組織和抗性芽葉片的GUS組織化學(xué)染色Fig.4 Transient GUS expression of callus and leaf tissues of Km-resistant budsa,c.對照組(未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作)愈傷組織和不定芽葉片的GUS組織化學(xué)染色;b.最適轉(zhuǎn)化因子組合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織的GUS組織化學(xué)染色;d.抗Km的抗性芽的GUS組織化學(xué)染色。a,c.GUS expression in callus and leaf tissues of controls (untransformed plants);b.GUS expression in callus of optimum transforming factors combination:pre-culture duration of 5 days,infection duration of 10 min and co-culture condition of 3 days;d.GUS expression in leaves of Km-resistant buds.

    圖5 抗性芽、未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片和pBI121質(zhì)粒的PCR分析Fig.5 PCR analysis of putative transformants, binary vector pBI121 and controlsp:pBI121質(zhì)粒;c:未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的不定芽葉片;1,2,3:獲得的3個抗性芽。p:Binary vector pBI121;c:Untransformed plant;1,2,3:Putative transformants.

    3 討論

    本研究優(yōu)化了杜仲葉片愈傷組織的再生體系,對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行了研究。長期以來,杜仲只有一種以下胚軸為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系(趙丹等,2009;李巖等,2011),下胚軸為子代材料,無法代表該優(yōu)良品種的遺傳背景(Sidorovaetal.,2017)。如今,這一缺點(diǎn)可以通過使用成年杜仲葉片愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系來克服。

    構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,建立受體系統(tǒng)的再生體系是前提條件(Gorpenchenkoetal.,2006)。本研究分析了NAA和6-BA對杜仲愈傷組織誘導(dǎo)不定芽以及不定芽復(fù)壯的影響,其結(jié)果與金曉玲等(2014)的研究結(jié)果相似;此外,本研究還發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基只添加3/4濃度的大量元素對杜仲葉片愈傷組織誘導(dǎo)不定芽以及不定芽的復(fù)壯有顯著的促進(jìn)作用。植物組織培養(yǎng)中,大量元素濃度是重要的影響因素之一,然而由于大部分試驗(yàn)中均使用MS培養(yǎng)基,大量元素濃度對杜仲再生體系的影響被忽視。一些研究表明,大量元素濃度能夠顯著影響不定芽的培養(yǎng)(Azadietal.,2010;Zhaoetal.,2014;周新華等,2017),甚至影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率(Naiketal.,2011)。其原因可能是大量元素的減少使得培養(yǎng)基中鹽濃度降低,促使酚的代謝減少,大大減輕褐化現(xiàn)象,而褐化是愈傷組織繼代培養(yǎng)和不定芽誘導(dǎo)最主要的干擾因素之一。此外,早在1980年,Lloyd和McCown就發(fā)現(xiàn)山月桂(Kalmialatifolia)的莖尖培養(yǎng)更適合于低鹽培養(yǎng)基,從而開發(fā)了WPM(woody plant medium)木本植物培養(yǎng)基(Lloydetal.,1980)。本研究的結(jié)果也表明,杜仲更加適合于低鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),這一結(jié)果值得進(jìn)一步研究。

    考慮到多因素研究的復(fù)雜性,本研究采用了正交試驗(yàn)研究4種轉(zhuǎn)化因子(預(yù)培養(yǎng)時間、AS濃度、侵染時間、共培養(yǎng)條件)對GUS瞬時表達(dá)率的影響。結(jié)果表明侵染時間和共培養(yǎng)條件是影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素,而AS濃度和預(yù)培養(yǎng)時間對其影響不明顯。與其他植物相同,侵染時間對杜仲愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化至關(guān)重要,較長的時間能夠提高轉(zhuǎn)化效率。在本研究中,10 min的侵染時間達(dá)到了最高的GUS瞬時表達(dá)率并且有較低的愈傷組織死亡率,這一侵染時間與杜仲的下胚軸轉(zhuǎn)化體系相同,但比大部分木本植物短,這可能是由于杜仲對農(nóng)桿菌EHA105有更高的敏感性(李巖等,2011)。較長的共培養(yǎng)時間則有利于農(nóng)桿菌將T-DNA轉(zhuǎn)化到植物基因組中(Kondoetal.,2000)。不過,本研究的結(jié)果表明,4天共培養(yǎng)時間的GUS瞬時表達(dá)率均值雖高于3天,但提升較小并且對愈傷組織傷害較大,一些其他植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究結(jié)果表明共培養(yǎng)時間不宜超過3天,長期的共培養(yǎng)會使農(nóng)桿菌過度生長從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低(Cerveraetal.,1998;Curtisetal.,1999;Yangetal.,2010)。

    本研究中獲得的3個抗性芽經(jīng)PCR分析和GUS組織化學(xué)染色檢驗(yàn)證明,T-DNA已整合到了抗性芽基因組中,表明這一遺傳轉(zhuǎn)化體系能夠?qū)⒒驅(qū)氤墒熘仓甑慕M織培養(yǎng)材料中,為杜仲基因功能與遺傳改良的研究奠定了基礎(chǔ)。在今后的研究中可以進(jìn)一步優(yōu)化不定芽復(fù)壯后的再生體系,完善整個轉(zhuǎn)化系統(tǒng),獲得轉(zhuǎn)基因植株。

    4 結(jié)論

    本研究對杜仲以葉片為外植體的再生過程進(jìn)行了優(yōu)化,并對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化因子進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,添加3/4大量元素濃度的MS培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)和復(fù)壯有顯著的促進(jìn)作用,愈傷組織誘導(dǎo)不定芽最適培養(yǎng)基:3/4MS + 0.27 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA,不定芽復(fù)壯的最適培養(yǎng)基:3/4MS + 0.054 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA。農(nóng)桿菌介導(dǎo)杜仲葉片愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化最適合的轉(zhuǎn)化因子組合為:預(yù)培養(yǎng)5天、侵染10 min和共培養(yǎng)3天,篩選培養(yǎng)基為3/4MS + 0.054 μmol·L-1NAA + 4.4 μmol·L-16-BA+200 mg·L-1Cef + 70 mg·L-1Km。利用此體系共獲得了3個抗性芽,PCR分析和GUS組織化學(xué)染色都表明T-DNA已整合到抗性芽基因組中。

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