不同生態(tài)環(huán)境下銀中楊內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)及生態(tài)位變異*

王顏波 張偉溪 丁昌俊 蘇曉華

(1.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091；2.南昌工程學(xué)院 南昌 330099)

植物內(nèi)生菌是至少有一段生命周期存活于植物組織中，并對(duì)宿主沒有負(fù)面影響的一類微生物群落，包括細(xì)菌、古菌和真菌等(Hallmannetal.,2011),它們?cè)诖龠M(jìn)植物生長、營養(yǎng)物質(zhì)積累和抵抗生物和微生物脅迫(如疾病、蟲害、高溫、鹽或干旱等)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用(Hardoimetal.,2008;Prischletal.,2012;Naveedetal.,2014)。了解微生物在植物生長發(fā)育過程中所起的作用，可以為人類開發(fā)利用微生物資源提供依據(jù)。植物內(nèi)生菌群落的多樣性或活性的任何變化都會(huì)對(duì)植物生長和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)產(chǎn)生顯著影響(Redmanetal.,2011;Naveedetal.,2014;Vandenkoornhuyseetal.,2015)，但也有研究表明，玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)和馬鈴薯(Solanumtuberosum)的內(nèi)生菌更容易受到植物的不同發(fā)育階段和病原菌的暴露時(shí)間的影響(Rascheetal.,2006;Janpenetal.,2009;Inceoluetal.,2010;Rangjaroenetal.,2014)。一些植物的內(nèi)生菌是由根際微生物群落進(jìn)入植物根部而形成，其多樣性主要由土壤類型決定(Bulgarellietal.,2012)。植物不同部位的內(nèi)生菌群落也不同，植物內(nèi)生細(xì)菌與根際細(xì)菌相比，根、莖、葉中的內(nèi)生細(xì)菌具有高度的差異性，每個(gè)植物器官都代表了內(nèi)生細(xì)菌群落特有的生態(tài)位(Beckersetal.，2017)。

楊樹(Populusspp.)是生長最快的林木之一，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，是生產(chǎn)生物燃料、紙漿和生物黏合劑等方面重要的原材料(Sannigrahietal.,2010)。楊樹易于無性繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化，具有豐富的基因組信息，也是多年生木本植物生物學(xué)研究以及植物與微生物互作研究的模式植物(Beckersetal.,2016;Beckersetal.,2017)。本研究使用16S rRNA 和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)擴(kuò)增子Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)分別生長在鹽堿地區(qū)(大慶)和非鹽堿地區(qū)(北京、齊齊哈爾)的銀中楊(Populusalba×P.berolinensis)中內(nèi)生細(xì)菌和真菌的多樣性進(jìn)行了評(píng)估，探究環(huán)境因素是否影響楊樹內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)，地上和地下部分內(nèi)生菌群落是否具有差異，為植物和微生物工作研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分別位于黑龍江省的鹽堿區(qū)大慶市林源鎮(zhèn)常圍子村(46°34′N，125°08′E)(D)、非鹽堿區(qū)齊齊哈爾市錯(cuò)海林場(chǎng)(47°27′N，122°51′E)(Q)和北京市房山區(qū)韓村河?xùn)|營苗圃(39°37′N，115°58′E)(J)。其中，黑龍江省的2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)均位于松嫩平原，平均海拔146 m，屬于溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫4 ℃，降雨量415 mm；北京市試驗(yàn)點(diǎn)位于房山區(qū)東南部，屬于暖溫帶半濕潤季風(fēng)大陸性氣候，年平均氣溫11.6 ℃，降雨量602.5 mm。試驗(yàn)林種植密度為2 600株·hm-2，株行距為2 m。

1.2 取樣方法

2017年7月于每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)選擇3個(gè)區(qū)組，每個(gè)區(qū)組隨機(jī)選擇3棵銀中楊植株的根和莖樣本分別混合。去除凋落物層后，在距地面20 cm深度采集根系和土壤樣本，同時(shí)采集地上部分枝條樣本。共分析18個(gè)樣本(3 × 3個(gè)根系樣本DR、JR、QR;3 × 3莖段樣本:DS、JS、QS)。選擇直徑0.3～0.5 cm的根和莖進(jìn)行微生物多樣性分析。此外，從每個(gè)地點(diǎn)隨機(jī)抽取3份土壤樣本進(jìn)行土壤理化性質(zhì)檢測(cè)。根、莖和土壤樣本使用冰盒保存并立即帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.3 樣品處理及DNA提取

無菌條件下，使用無菌水沖洗掉根和莖表面的灰塵和土壤，在70%的酒精中浸泡2 min，在次氯酸鈉溶液(2.5%活躍Cl-)中浸泡5 min，用無菌水沖洗5遍(Beckersetal.,2016)；用無菌吸水紙吸干樣品表面的水分，以手術(shù)刀將根和莖段切成2～3 cm的小片段，然后保存于-80 ℃使用Power Soil DNA試劑盒(MoBio,Carlsbad,CA,USA) 提取根和莖段樣品中微生物DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增和Illumina MiSeq測(cè)序

細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建采用兩步PCR法。第1輪PCR擴(kuò)增引物序列為799F/1392R(5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′/5′-ACGGGCGG TGTGTRC-3′)，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)從凝膠切片中回收DNA(擴(kuò)增子長度=593 bp)。第2輪PCR擴(kuò)增引物序列為799F/1193R(5′-AACMGGA TTAGATACCCKG-3′/5′-ACGTCATCCCCACCTTCC-3′)。第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后使用QuantiFluor-ST (Promega,Madison,WI,USA)進(jìn)行定量。同時(shí)，真菌擴(kuò)增子文庫構(gòu)建使用特定引物ITS1F/ITS2R(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′/5′-GC TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。純化、定量步驟與細(xì)菌PCR第1輪保持一致。最后，純化的擴(kuò)增子文庫由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq平臺(tái)雙端測(cè)序[細(xì)菌(2×250 bp)，真菌(2×300 bp)] (上海，中國)。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

測(cè)序產(chǎn)生的fastq原始文件使用Trimmomatic (Bolgeretal.,2014)和FLASH (Magoetal.,2011)進(jìn)行質(zhì)控過濾，去除低質(zhì)量序列。然后計(jì)算所有剩余的唯一序列之間的兩兩距離，建立距離矩陣，并使用UPARSE (version 7.1 http://drive5.com/uparse/)對(duì)可操作分類單元(OTU)進(jìn)行聚類(97%的序列相似性)。從數(shù)據(jù)集中刪除單序列(Dickieetal.,2010)最小化測(cè)序的影響。使用UCHIME識(shí)別和移除嵌合序列(Edgaretal.,2011)。利用RDP分類器算法(http://rdp.cme.msu.edu/)和70%的置信閾值對(duì)細(xì)菌的16S rRNA和真菌的ITS序列進(jìn)行分類，細(xì)菌采用Silva (SSU128) 16S rRNA數(shù)據(jù)庫，真菌采用UNITE v.7 ITS數(shù)據(jù)庫。隨后從數(shù)據(jù)集中去除非細(xì)菌和非真菌序列。

1.6 土壤樣品分析

首先通過1 mm網(wǎng)篩過濾土壤樣品，然后采用電位法測(cè)定pH值，分別用堿解擴(kuò)散法、鉬銻抗比色法和乙酸銨浸提-火焰光度計(jì)法測(cè)定土壤總氮、總磷和總鉀含量。土壤有機(jī)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定(Reeuwijketal.,1995)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

各參數(shù)的差異顯著性分析采用SPSS 17.0進(jìn)行。采用方差分析(ANOVA)方法研究了植物不同器官(根、莖)和種植地點(diǎn)(北京、大慶、齊齊哈爾)對(duì)reads豐度的影響。使用FastTree(version 2.1.3 http://www.microbesonline.org/fasttree/)和 FastUniFrac(http://UniFrac.colorado.edu/)進(jìn)行層級(jí)聚類(基于Bray-Curtis距離)。主坐標(biāo)分析(PCoA)在R3.5.1 (http://www.R-project.org/)中進(jìn)行。使用R(version 1.7.1)中indicspecies程序包多重函數(shù)進(jìn)行指示種分析(Cáceresetal.,2009)。采用距離冗余分析方法(db-RDA)分析微生物與環(huán)境因子的關(guān)系。通過FastTree利用每個(gè)OTU的一個(gè)代表性序列生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，并使用iTOL (Interactive Tree of Life)進(jìn)行展示(Ivicaetal.,2011)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Illumina測(cè)序的質(zhì)量指標(biāo)

細(xì)菌和真菌的擴(kuò)增子文庫分別測(cè)序獲得有1 161 749個(gè)和1 333 593個(gè)原始reads，平均讀取長度分別為502和602 bp。質(zhì)控后，分別保留1 046 194個(gè)和1 068 323個(gè)高質(zhì)量的reads，平均長度分別為395和281 bp。在優(yōu)化PCR條件下，筆者篩選了非目標(biāo)的共擴(kuò)增序列(葉綠體、質(zhì)體和線粒體序列)，在細(xì)菌樣本中發(fā)現(xiàn)少量線粒體序列，約占標(biāo)準(zhǔn)化后序列的0～0.03%，所有真菌樣本中未發(fā)現(xiàn)共擴(kuò)增產(chǎn)物。細(xì)菌和真菌擴(kuò)增子序列中，能夠?qū)Υ蟛糠謗eads進(jìn)行分類，但仍有部分reads無法分類(細(xì)菌0～0.24%，真菌0.89～25.42%)。在進(jìn)一步分析之前，從數(shù)據(jù)集中刪除在門水平上無法分類的reads(表1)。

2.2 α多樣性

α多樣性的計(jì)算主要基于OTU豐富度、均勻度和Shannon指數(shù)(圖1)。為了控制樣品測(cè)序深度差異的影響，進(jìn)一步分析之前，每個(gè)樣品的序列數(shù)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，抽平到序列數(shù)最少樣本的序列數(shù)目。細(xì)菌和真菌的reads數(shù)分別標(biāo)準(zhǔn)化為35 310和1 885。根據(jù)97%的序列相似性水平，將細(xì)菌和真菌的reads分別歸類為1 541和240個(gè)OTU。

除齊齊哈爾外，北京和大慶地區(qū)的植物內(nèi)生菌的OTU豐富度均表現(xiàn)出依賴于植物器官的現(xiàn)象。尤其是北京地區(qū)，根中的內(nèi)生細(xì)菌、真菌OUT豐富度均顯著高于莖(P<0.05)(圖1A、D)。對(duì)OTU均勻度的計(jì)算發(fā)現(xiàn)不同的植物器官(根和莖)、不同的生態(tài)環(huán)境(大慶、北京和齊齊哈爾)之間均保持在比較一致的水平(圖1B、E)。對(duì)內(nèi)生細(xì)菌OTU多樣性的分析發(fā)現(xiàn)，不同器官間、不同地點(diǎn)間均無顯著差異(圖1C)。然而，除了齊齊哈爾外，北京和大慶地區(qū)的楊樹根內(nèi)生真菌OTU多樣性高于莖。

2.3 β多樣性

采用主坐標(biāo)分析(PCoA)在OTU水平上對(duì)來自不同地點(diǎn)的銀中楊根和莖樣品內(nèi)生菌的β多樣性進(jìn)行評(píng)估，分析不同樣本內(nèi)生菌組成結(jié)構(gòu)的相似性和差異關(guān)系?；贐ray-Curtis距離算法，分別構(gòu)建內(nèi)生細(xì)菌和真菌的層級(jí)聚類樹(圖2)。在OTU水平上，北京、大慶和齊齊哈爾3個(gè)地點(diǎn)銀中楊的莖內(nèi)生細(xì)菌群落明顯聚集，可以與根內(nèi)生細(xì)菌清晰地區(qū)分開。主成分1解釋了總變異的47.08%，主成分2解釋了總變異的12.07%(圖2A)。與內(nèi)生細(xì)菌相同，根與莖中內(nèi)生真菌可以明確區(qū)分，3個(gè)地點(diǎn)的銀中楊莖內(nèi)生真菌也無法區(qū)分，然而，北京和齊齊哈爾2個(gè)地點(diǎn)的根內(nèi)生真菌明顯聚集，可以與大慶區(qū)分開(圖2C)。主成分1解釋真菌總變異的25.00%，主成分2解釋真菌總變異的19.64%?；贐ray-Curtis距離的層次聚類也顯示相同的結(jié)果(圖2B、D)。

表1 Illumina測(cè)序分析的質(zhì)量指標(biāo)Tab.1 Quality metrics of Illumina sequencing analysis

2.4 內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)

在綱水平上，利用方差分析(ANOVA)來評(píng)估不同植物器官(根、莖)和銀中楊不同種植點(diǎn)(大慶、北京和齊齊哈爾)對(duì)所有檢測(cè)到內(nèi)生細(xì)菌和真菌相對(duì)豐度(%)的影響。內(nèi)生細(xì)菌群落主要由放線菌綱(相對(duì)豐度～50%)，β-變形菌綱(～10%)，α-變形菌綱(～10%)，γ-變形菌綱(～5%)和擬桿菌綱(～5%)組成(圖3A)。其中，在不同地點(diǎn)之間，α-變形菌綱細(xì)菌在大慶地區(qū)銀中楊根中的豐度顯著高于北京和齊齊哈爾地區(qū)(大慶：28.75%，北京：15.39%，齊齊哈爾：16.58%)，酸桿菌綱細(xì)菌在齊齊哈爾地區(qū)銀中楊根中的豐度顯著高于北京和大慶地區(qū)(齊齊哈爾：1.65%，北京：0.25%，大慶：0.04%)。不同植物器官中，β-變形菌綱的細(xì)菌在3個(gè)地點(diǎn)的銀中楊莖中的豐度均顯著高于根。大慶和齊齊哈爾地區(qū)銀中楊根中的α-變形菌綱細(xì)菌的豐度均顯著高于莖。

內(nèi)生真菌群落主要由座囊菌綱(相對(duì)豐度～50%)，傘菌綱(～15%)，子囊菌綱(～10%)，在綱水平尚未分類的子囊菌門(～10%)和銀耳綱(～5%)組成(圖3B)。其中，在不同地點(diǎn)之間，在綱水平上未分類的子囊菌門的細(xì)菌在大慶地區(qū)銀中楊根中的豐度顯著高于北京和齊齊哈爾地區(qū)(大慶：53.49%，北京：3.01%，齊齊哈爾：0.09%)。子囊菌綱真菌在北京地區(qū)銀中楊根中的豐度顯著高于其他2個(gè)地區(qū)(北京：56.09%，大慶：6.63%，齊齊哈爾：2.64%)。不同植物器官中，座囊菌綱真菌在3個(gè)地點(diǎn)的銀中楊莖中的豐度均顯著高于根。大慶地區(qū)銀中楊根中的傘菌綱真菌顯著高于莖。

2.5 微生物群落與環(huán)境因素的相關(guān)性

計(jì)算微生物群落與環(huán)境因素之間的相關(guān)性，以檢驗(yàn)可能導(dǎo)致微生物多樣性變化的環(huán)境因素(表2)。根中細(xì)菌和真菌群落的距離冗余分析(db-RDA)表明，樣品是根據(jù)植物栽植地點(diǎn)的環(huán)境因素進(jìn)行劃分的(圖4)。Mantel檢驗(yàn)結(jié)果顯示，pH值、土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)含量和鉀(K)含量與微生物群落顯著相關(guān)(P<0.05)，而氮(N)、磷(P)含量并不是解釋楊根內(nèi)生菌群落差異的重要因素(表3)。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌和真菌的α多樣性Fig.1 Alpha diversity estimates of bacterial and fungal communities

圖2 內(nèi)生細(xì)菌和真菌群落的主坐標(biāo)(PCoA)分析和層級(jí)聚類Fig.2 Principal co-ordinates analysis (PCoA) and hierarchical clustering of bacterial and fungal communities

圖3 綱水平上細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacterial community(A) and fungal community(B) structure at the class level

表2 環(huán)境因子Tab.2 Data of environmental factors

表3 微生物群落與環(huán)境因素的相關(guān)性①Tab.3 Correlation between microbial communities and environmental factors

①微生物群落與環(huán)境因子的相關(guān)性的計(jì)算基于Bray-Curtis距離算法(9 999次置換)的Mantel檢驗(yàn)，R和P值表示相關(guān)性程度，*為P≤0.05，**為P≤0.01。Correlations between microbial communities and environmental factors were calculated using the Mantel test based on the Bray-Curtis distance algorithm (9 999 permutations).The degree of correlation is shown as the R and P-value.Significance level:*P≤ 0.05;**P≤ 0.01.

2.6 核心微生物分析

將每組中豐度排名前10的OTU定義為核心微生物，以確定不同地點(diǎn)生長的銀中楊不同器官中的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌群。23個(gè)核心細(xì)菌OTU，歸屬于6個(gè)綱，分別占根和莖中細(xì)菌的64.33%和68.71%，占大慶、北京和齊齊哈爾細(xì)菌的63.63%、67.27%和68.66%(圖5A)。22個(gè)核心真菌OTU，歸屬于7個(gè)綱，分別占根和莖中真菌的79.61%和98.34%，占大慶、北京和齊齊哈爾真菌的89.31%、81.67%和95.94%(圖5B)。分別利用克氏秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H test)和Student T檢驗(yàn)來分析環(huán)境因素和不同銀中楊器官對(duì)核心微生物豐度的影響(表5)。其中，慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和青枯菌屬(Ralstonia)的根內(nèi)生細(xì)菌，小球腔菌屬(Leptosphaeria)、口蘑屬(Tricholoma)和在屬水平未分類的子囊菌門內(nèi)生真菌受環(huán)境因素的影響。受銀中楊不同器官影響的內(nèi)生細(xì)菌有紅球菌屬(Rhodococcus)、根瘤菌屬 (Rhizobium)、紅微菌屬(Rhodomicrobium)、青枯菌屬(Ralstonia)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)，真菌有Endosporium和屬水平上未分類的子囊菌門、革菌目、格孢菌目。

圖4 根中細(xì)菌和真菌群落的距離冗余分析(db-RDA)Fig.4 Distance-based redundancy analysis (db-RDA) of bacterial community(A) and fungal community(B) in root

圖5 內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌的核心菌群Fig.5 The core communities of endophytic bacteria and endophytic fungi

表4 種植地點(diǎn)和植物器官對(duì)核心內(nèi)生菌結(jié)構(gòu)的影響Tab.4 Plant locations and compartments effect on the endophytic structure

2.7 指示種分析

為了支持在OTU水平上克氏秩和檢驗(yàn)和Student T檢驗(yàn)的結(jié)果，并進(jìn)一步確定銀中楊不同器官間以及不同地點(diǎn)間內(nèi)生菌群落差異是由哪些OTU決定的。運(yùn)用指示物種分析，確定OTU和銀中楊不同器官以及不同生長環(huán)境之間的相關(guān)性。內(nèi)生細(xì)菌中分別獲得了根和莖中的119和31個(gè)指示OTU。大慶、北京和齊齊哈爾3個(gè)地點(diǎn)的根中分別獲得了23、8、8個(gè)指示OTU，莖中僅在大慶地區(qū)得到1個(gè)指示OTU。內(nèi)生真菌中，分別獲得了根和莖中的4和5個(gè)指示OTU；3個(gè)地點(diǎn)的根中分別獲得了6、2、1個(gè)指示OTU，莖中僅在北京地區(qū)得到1個(gè)指示OTU。當(dāng)去除了相對(duì)豐度<1%的OTU之后，共確定了7個(gè)根內(nèi)生細(xì)菌指示OTU：Actinophytocola、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、紅微菌屬、鏈霉菌屬(Streptomyces)、貪噬菌屬(Variovorax)(P<0.01)和慢生根瘤菌屬(P<0.05)；5個(gè)莖內(nèi)生細(xì)菌指示OTU：雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、紅球菌屬(P<0.01)、小桿菌屬(Dialister)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)和微球菌屬(Micrococcus)(P<0.05)。大慶和齊齊哈爾地區(qū)各1個(gè)指示OTU：Actinophytocola、Acidibacter(P<0.05)，均位于根中。3個(gè)地點(diǎn)的莖中均無相對(duì)豐度>1%的指示OTU。同時(shí)，還確定了2個(gè)根內(nèi)生真菌指示OTU：小球腔菌屬和Ilyonectria(P<0.01)；3個(gè)莖內(nèi)生真菌指示OTU：格孢腔目、鏈格孢屬(Alternaria)(P<0.01)和Endosporium(P<0.05)。大慶地區(qū)5個(gè)指示OTU：木霉屬(Trichoderma)、口蘑屬、錘舌菌綱、革菌科和子囊菌門(P<0.05)；齊齊哈爾地區(qū)1個(gè)指示OTU：隱球菌屬(Cryptococcus)(P<0.05)位于根中。北京地區(qū)1個(gè)指示OTU：Neosetophoma(P<0.05)位于莖中(表5)。

2.8 UpSetR分析

為了全面展示不同銀中楊器官之間、不同種植地點(diǎn)之間內(nèi)生菌OTU的分布，用R程序包(UpSetR)計(jì)算了各個(gè)樣本中特有的和共有的OTU。結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌中有51(3.30%)個(gè)OTU被6組樣本共有。根內(nèi)生細(xì)菌中有56(3.63%)個(gè)OTU為3個(gè)地點(diǎn)共有，北京和大慶地區(qū)擁有最多的共有OTU：105(6.81%)。莖內(nèi)生細(xì)菌中有29(1.88%)個(gè)OTU為3個(gè)地點(diǎn)共有；北京和齊齊哈爾地區(qū)擁有最多的共有OTU：37(2.40%)。6個(gè)組單獨(dú)特有的OTU占了總OTU數(shù)的大部分(4.54%～15.44%)；其中根中特有OTU的數(shù)量大于莖(圖6A)。內(nèi)生真菌OTU的分布與細(xì)菌相似，有1(0.42%)個(gè)OTU被6組樣本共有。根內(nèi)生真菌中有4(1.67%)個(gè)OTU為3個(gè)地點(diǎn)共有，北京和大慶地區(qū)擁有最多的共有OTU為11個(gè)(4.58%)。莖內(nèi)生細(xì)菌中有2個(gè)(0.83%)OTU為3個(gè)地點(diǎn)共有。6個(gè)組單獨(dú)特有的OTU占了總OTU數(shù)的2.92%～29.17%；其中根中特有OTU的數(shù)量大于莖(圖6B)。

表5 指示種分析①Tab.5 Indicator species analysis

①*:P≤0.05;**:P≤0.01;***:P≤0.001。

圖6 樣品中內(nèi)生菌OTU的upset分析Fig.6 Upset analysis of endogenous microorganisms in samples

3 討論

3.1 環(huán)境因素對(duì)銀中楊內(nèi)生菌群落的影響

土壤鹽分含量、pH值和溫度等環(huán)境因素對(duì)內(nèi)生菌群落有顯著影響(Podolichetal.,2014;Whitakeretal.,2018;Lozuponeetal.,2007;Yaishetal.,2016b;Thiemetal.,2018)。目前植物內(nèi)生菌的研究多集中于草本植物，木本植物內(nèi)生菌的研究相對(duì)較少(Kesarietal.,2013;Rozeketal.,2018)。本研究中，北京、大慶和齊齊哈爾3個(gè)地點(diǎn)的銀中楊根內(nèi)生菌群落都可以明顯的區(qū)分，而莖內(nèi)生菌卻無法分離(圖2)。在糯米(Alnusglutinosa)(Thiemetal.,2018)與海棗(Phoenixdactylifera)(Yaishetal.,2016a)內(nèi)生菌的研究中也發(fā)現(xiàn)這一類似的現(xiàn)象。本研究中，在不同地點(diǎn)的銀中楊中，pH值、土壤有機(jī)物(SOM)含量和鉀含量顯著影響內(nèi)生菌群落(圖4，表3)。這一結(jié)論與前人的研究結(jié)果相一致(Marschneretal.,2005;Lauberetal.,2009;Ishidaetal.,2009;Shakyaetal.,2013)。特別是Hartman等(2008)發(fā)現(xiàn)土壤pH值是土壤細(xì)菌群落變化的最佳預(yù)測(cè)因子，在門水平上，土壤中酸菌和放線菌的豐度隨著pH值梯度的變化而改變。離海岸線80 m的連續(xù)樣帶上森林中的研究表明，沿著樣帶的植被和微生物群落與土壤有機(jī)質(zhì)含量有較強(qiáng)的相關(guān)性(Meril?etal.,2010)。

銀中楊根內(nèi)生細(xì)菌主要以γ-變形菌綱和α-變形菌綱為主，酸桿菌門也有高水平的分布(Gotteletal.,2011;Shakyaetal.,2013)，本研究發(fā)現(xiàn)銀中楊內(nèi)生細(xì)菌群落主要由放線菌綱(相對(duì)豐度～50%)，β-變形菌綱(～10%)，α-變形菌綱(～10%)和γ-變形菌綱(～5%)組成(圖3A)。α-變形菌綱在鹽堿地區(qū)(大慶)銀中楊根中豐度更高，而這些菌已被證明與植物抵御逆境脅迫有關(guān)(Go?biewskietal.,2014;Thiemetal.,2018)。在非鹽堿地區(qū)(齊齊哈爾)，γ-變形菌綱有更高的豐度，這可能與土壤有機(jī)質(zhì)含量有關(guān)(Shakyaetal.,2013)。在細(xì)菌的屬水平上，慢生根瘤菌屬和青枯菌屬在齊齊哈爾地區(qū)的根中有較高的豐度(表4)。有研究發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌具有清除和降解污染物砷、二胺和環(huán)丙沙星的能力(Luetal.,2018;Zhangetal.,2018);青枯菌屬是伯克氏菌科的細(xì)菌，能通過生產(chǎn)含硫的抗真菌揮發(fā)性有機(jī)化合物提高土壤的抑菌作用(Carrionetal.,2018)。在大慶地區(qū)銀中楊的根中比莖中有更多的根瘤菌屬細(xì)菌，根瘤菌屬是豆科植物常見的共生細(xì)菌 (Azariasetal.,2015)，但在玉米、水稻和燕麥(Avenasativa)(Antounetal.,1998)等非豆科植物存在，從生長在重金屬污染地區(qū)的木本植物白樺(Betulaplatyphylla)和榿木(Alnuscremastogyne)的根中分離(Zlochetal.,2016)。

在本研究中，銀中楊根內(nèi)生真菌群落以座囊菌綱、傘菌綱、子囊菌綱和銀耳綱為主。莖內(nèi)生真菌主要以座囊菌綱為主(圖3)。本研究結(jié)果與前人在美洲黑楊(Populusdeltoides)中的研究結(jié)果一致(Shakyaetal.,2013)。鹽堿地區(qū)(大慶)銀中楊根中子囊菌門豐度達(dá)到53.49%，顯著高于其他2個(gè)地點(diǎn)，有研究已證明子囊菌門在鹽堿地土壤中有高豐度的分布，且與土壤堿解氮相關(guān)性最大(王艷云等，2016)。小球腔菌的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗真菌、酶抑制及植物細(xì)胞毒活性等多種生物學(xué)活性(劉叢叢等，2017)。小球腔菌屬在北京地區(qū)根中相對(duì)豐度較高(22.71%)，這可能是由于北京地區(qū)并非銀中楊的適生區(qū)而引起的。

3.2 銀中楊根與莖內(nèi)生菌群落的生態(tài)位差異

本研究評(píng)估了銀中楊不同器官中內(nèi)生菌群落的差異，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的豐度因器官而不同，根比莖具有更高的豐度，這些結(jié)果與內(nèi)生菌定殖的基本觀點(diǎn)一致。土壤中根際微生物群落豐富，部分細(xì)菌可主動(dòng)或被動(dòng)移動(dòng)通過內(nèi)皮層和中柱鞘，到達(dá)木質(zhì)部導(dǎo)管，最終在植物體內(nèi)定殖(Hardoimetal.,2008;Compantetal.,2009)。采用PCoA和層次聚類分析比較細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌在綱和屬水平上都嚴(yán)格根據(jù)植物器官聚類。這種生態(tài)位的差異在楊樹(Populustremula×Populusalba)(Beckersetal.,2016)、仙人掌(Opuntiastricta)(Fonseca-Garcíaetal.,2016)、柳(Salixbabylonica)(Tardifetal.,2016)均有報(bào)道。本研究中，根和莖中分別有約13%和6%的獨(dú)有細(xì)菌OTU，約20%和6%的獨(dú)有真菌OTU，這很大程度上是由于植物微環(huán)境或生態(tài)位(根和莖)中存在相關(guān)的生物和非生物梯度，如可溶性有機(jī)化合物的有效性等(Bulgarellietal.,2013)。

在屬水平上，根系內(nèi)生細(xì)菌群落以鏈霉菌屬、慢生根瘤菌屬和根瘤菌屬為主；莖內(nèi)生細(xì)菌群落以紅球菌屬和青枯菌屬為主。這些細(xì)菌已在許多植物中被發(fā)現(xiàn)，可能對(duì)植物的健康和生長有益(華茍根等,2003;Ulrichetal.,2008;Yuetal.,2015;Liuetal.,2017)。這種根內(nèi)生鏈霉菌屬、慢生根瘤菌屬和根瘤菌屬的分布模式使得根與根際微生物種群達(dá)到最大限度的接觸和相互作用(Singhetal.,2018)。有研究表明，紅球菌屬的成員之一帶化紅球菌(Rhodococcusfascians)是一種致畸植物病原菌，通常與細(xì)胞分裂素有關(guān)，并且能通過吲哚-3-丙酮酸(IPyA)途徑產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA) (Vandeputteetal.,2005)。青枯菌屬為伯克氏菌科細(xì)菌，在伯克氏菌科的基因組中，參與芳香族化合物降解的基因多達(dá)30個(gè)，為環(huán)境中有機(jī)污染物的降解提供了合適的途徑和微生物(Perez-Pantojaetal.,2012;Lunsmannetal.,2016)。內(nèi)生真菌Endosporium和格孢菌目在莖中占優(yōu)勢(shì)，而根中以子囊菌門和革菌目為主。Endosporium屬于Myriangales，已有研究者從楊樹(Populusspp.)的芽和嫩枝中分離得到(Tsunedaetal.,2000;2008)。革菌目的所有真菌都是外生菌根，與植物的根形成互惠互利的關(guān)系(Hibbettetal.,2007)。

4 結(jié)論

銀中楊根內(nèi)生細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)取決于土壤的pH值、有機(jī)物含量和鉀含量；而氮、磷含量并不是解釋銀中楊根內(nèi)生微生物群落差異的重要因素。即使在不同的環(huán)境條件下，莖干中的微生物群落可保持穩(wěn)定。此外，證實(shí)了在根和莖中的微生物群落生態(tài)位分化，每個(gè)植物器官代表了一個(gè)微生物群落的獨(dú)特生態(tài)位。最后，確定了與銀中楊不同器官和不同環(huán)境條件相關(guān)的指示OTU和核心微生物。