鱗翅目昆蟲基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展

程英 靳明輝 蕭玉濤

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120；3. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心，深圳 518120）

鱗翅目在分類學(xué)上隸屬節(jié)肢動物門（Arthropoda）六足總綱（Hexapoda）昆蟲綱（Insecta），是昆蟲綱的第二大目，包括蝶、蛾2類，單個(gè)世代經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹、成蟲等4階段，為全變態(tài)昆蟲。其種類超過25萬種，廣泛分布于世界各地。大部分鱗翅目昆蟲都是農(nóng)林、畜牧業(yè)的重要害蟲，給農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；蚓庉嬍侵咐煤怂醿?nèi)切酶在基因組的特定位置引入雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs），誘導(dǎo)細(xì)胞自身的DNA損傷修復(fù)機(jī)制非同源末端連接修復(fù)（Nonhomologous end joining，NHEJ）或同源重組修復(fù)（Homology directed repair，HDR）對切口位置進(jìn)行修復(fù)，從而產(chǎn)生基因插入、缺失等多種突變類型。隨著基因編輯技術(shù)快速發(fā)展，鱗翅目昆蟲基因編輯研究也取得了一系列重要的成果。本文對3種主要基因編輯技術(shù)：鋅指核酸酶技術(shù)（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶技術(shù)（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALENs）、成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及相關(guān)核酸酶技術(shù)（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/CRISPR-associated system（Cas），CRISPR/Cas）在鱗翅目昆蟲基因組編輯中的研究進(jìn)行簡要綜述，旨為鱗翅目昆蟲功能基因組研究、抗性基因挖掘、建立害蟲綠色防控體系提供參考。

1 鋅指核酸酶技術(shù)及其在鱗翅目昆蟲基因編輯的應(yīng)用

鋅指核酸酶（ZFNs）技術(shù)是第一代基因編輯技術(shù)，1996年Kim等［1］首次成功將其應(yīng)用于DNA靶向切割，它是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，每一個(gè)ZFNs由兩個(gè)功能域組成：N末端為鋅指蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由一系列Cys2His2鋅指模塊串聯(lián)組成，每個(gè)鋅指模塊識別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基序列，4-6個(gè)鋅指模塊組合在一起，形成一個(gè)鋅指蛋白（ZFP），其特異性識別12-18 bp核酸序列。C末端為經(jīng)過改造的非特異性FokI核酸酶內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)okI以二聚體形式對DNA進(jìn)行切割。兩個(gè)鋅指蛋白分別識別5'-3'方向和3'-5'方向的DNA雙鏈，雙鏈通常間隔5至7個(gè)堿基的靶序列（Spacer），此時(shí)FokI核酸酶形成二聚體，切割靶位點(diǎn)，造成DNA雙鏈斷裂（圖1）。Takasu等［2］通過ZFN mRNA顯微注射成功對家蠶尿酸鹽代謝通路中尿酸顆粒沉積相關(guān)基因BmBLOS2進(jìn)行敲除，突變后代表現(xiàn)出半透明體色，制備了經(jīng)典的油蠶表型品系。Merlin等［3］以黑脈金斑蝶的Dpcry2基因?yàn)榘袠?biāo)，通過體外合成的ZFNs mRNA顯微注射，成功實(shí)現(xiàn)了Dpcry2基因敲除，突變后代表現(xiàn)出晝夜節(jié)律行為和分子鐘機(jī)制紊亂。Ma等［4］利用ZFN技術(shù)對家蠶絲腺蛋白重鏈基因BmFibH進(jìn)行敲除，產(chǎn)生只含有絲膠蛋白的蠶繭，該敲除品系能作為生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)外源基因穩(wěn)定高表達(dá)。由于設(shè)計(jì)有效的ZFNs技術(shù)難度大，成本較高，實(shí)驗(yàn)周期長，ZFNs技術(shù)在鱗翅目昆蟲研究中的應(yīng)用報(bào)道較少（表1）。

圖1 ZFNs結(jié)構(gòu)及工作原理［5-6］

表1 ZFNs、TALENs基因編輯技術(shù)在鱗翅目昆蟲基因編輯中的應(yīng)用

2 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶技術(shù)及鱗翅目昆蟲基因編輯應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白核酸酶（TALENs）技術(shù)是第二代基因編輯技術(shù)，TALENs來源于植物病原菌黃單胞菌屬（Xanthomonas），與ZFNs結(jié)構(gòu)相似，每一個(gè)TALENs由兩個(gè)功能域組成：N末端為TALE蛋白結(jié)構(gòu)域，特異性的結(jié)合DNA序列，C端為FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，非特異的切割靶位點(diǎn)造成雙鏈斷裂。每個(gè)TALE蛋白由3個(gè)部分組成：N-端轉(zhuǎn)運(yùn)信號；C-端核定位信號NLSs及酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD；中間DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。中間DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由多個(gè)串聯(lián)排列的重復(fù)序列單元組成，單個(gè)重復(fù)序列單元由33-35個(gè)高度保守的氨基酸組成，其中第12和13位氨基酸可變，被稱為重復(fù)可變雙殘基（Repeat-variable diresidue，RVD），RVD可特異的識別DNA堿基，其中NI識別A；NG識別T；HD識別C；NK識別G；NN識別G或A；NS識別A、C、G、T等，根據(jù)不同堿基序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的TALE模塊串，理論上可以靶向任何序列［7-8］（圖2）。1989年，Bonas首次報(bào)道，2009年成功應(yīng)用于植物細(xì)胞基因組編輯［7］，迄今已應(yīng)用于多種鱗翅目昆蟲基因編輯研究（表1）。2012年，Ma等［9］首次嘗試使用TALENs敲除家蠶BmBLOS2基因，通過顯微注射的方法，成功獲得BmBLOS2缺失突變個(gè)體。通過同時(shí)注射兩對TALENs，切割靶序列的兩個(gè)不同位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了家蠶基因組長片段刪除。為了提高其編輯效率，Takasu等［10］對TALENs系統(tǒng)進(jìn)行了進(jìn)一步的改造，利用改進(jìn)的TALENs系統(tǒng)pBlueTAL對家蠶BmBLOS2和Bm-re基因進(jìn)行敲除，編輯效率提高了一個(gè)數(shù)量級。2014年后，TALENs技術(shù)在家蠶基因編輯中的應(yīng)用快速發(fā)展，Xu等［11］利用TALENs對家蠶性別分化相關(guān)基因Bmdsx基因雌性特異外顯子進(jìn)行敲除，獲得了雌性不育遺傳系。日本科學(xué)家 Sakurai和 Yang等［12-13］利用 TALENs分別對家蠶和亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）性信息素相關(guān)受體基因進(jìn)行基因敲除，缺失相關(guān)受體的個(gè)體出現(xiàn)交配行為異常。為了提高突變的精確性，Ma等［14］將TALEN技術(shù)與ssODN聯(lián)合注射到家蠶胚胎中，實(shí)現(xiàn)了家蠶染色體水平的精準(zhǔn)靶向編輯，制備了染色體缺失、重復(fù)、倒位等多個(gè)染色體結(jié)構(gòu)變異模型。將TALENs與微同源介導(dǎo)的末端連接原理結(jié)合，Nakade等［15］構(gòu)建了TAL-PITCh編輯器，成功在家蠶BmBLOS2基因位點(diǎn)插入GFP，該系統(tǒng)極大地提高了基因體內(nèi)標(biāo)記示蹤效率。迄今，利用上述TAL-PITCh編輯器已成功建立了家蠶W染色體示蹤品系及雌性W染色體特異表達(dá)Cas9穩(wěn)定遺傳品系［16］。TALENs技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用極大地推動了鱗翅目昆蟲基因編輯研究進(jìn)展。

圖 2 TALENs結(jié)構(gòu)及工作原理［8，17］

3 CRISPR/Cas技術(shù)及鱗翅目昆蟲基因編輯應(yīng)用

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)是第三代基因編輯技術(shù)，不同于前兩代技術(shù)，它是一種由RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶技術(shù)，是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對外源核酸物質(zhì)攻擊所演化而來的獲得性免疫防御機(jī)制，由兩部分組成：CRISPR即規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），由前導(dǎo)序列（Leader）、重復(fù)序列（Repeat）和間隔序列（Spacer）組成；Cas 即 CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated system），其編碼核酸切割相關(guān)蛋白酶（圖3-A）。CRISPR/Cas免疫防御包括3個(gè)階段：接受（Adaptation），pre-crRNA（pre-CRISPR RNA）表達(dá)和加工，干擾（圖3-B）。接受階段：外源核酸物質(zhì)首次入侵細(xì)菌基因組時(shí)，CRISPR系統(tǒng)會識別外源核酸中的PAM序列（Protospacer adjacent motif，原間隔序列臨近基序），并將其上游約 30 nt的序列（原間隔序列Protospacer）剪切后插入自身CRISPR 陣列中的兩段重復(fù)序列之間（Repeat），形成新的 Spacer，獲得免疫記憶。pre-crRNA合成與加工階段：當(dāng)外源核酸物質(zhì)再次入侵細(xì)菌基因組時(shí)，在前導(dǎo)序列（Leader）的作用下起始轉(zhuǎn)錄CRISPR，得到的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CRISPR RNA（Pre-crRNA）在相關(guān)Cas核酸酶的作用下被加工成成熟的crRNA。干擾階段：成熟的crRNA 與相關(guān) Cas 蛋白形成復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對，crRNA識別外源核酸物質(zhì)中protospacer序列，引導(dǎo)Cas蛋白復(fù)合物對外源核酸進(jìn)行切割，造成雙鏈斷裂，從而防止外源核酸入侵［20-21］。95%的古細(xì)菌及48%的細(xì)菌其基因組中至少存在一個(gè)CRISPR基因座，具有極高的物種特異性和多樣性，不同菌種識別的PAM序列和Cas蛋白的數(shù)量及類型不同?；贑as蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化關(guān)系CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為2個(gè)大類、6種類型及多種亞型（圖3），其中應(yīng)用較為廣泛的有Cas3（Type I）、Cas9（Type II）、Cas10（Type III）、Csf1（Type IV）、Cpf1/Cas12（Type V）、Cas13（Type VI）［20-22］。

圖3 CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、分類及功能簡介［20-22］

2012年，Jinek等［23］首 次 證 明 改 造 后 的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以用于DNA體外靶向切割。Cas9 是Cas蛋白中重要的一員，CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)是細(xì)菌II型獲得性免疫防御系統(tǒng)經(jīng)人工改造而成，由Cas9蛋白、pre-crRNA（cr-RNA前體）和 tracrRNA（Trans-activating crRNA）3個(gè) 組 分 組成，pre-crRNA與tracrRNA結(jié)合，經(jīng)加工成成熟的發(fā)夾結(jié)構(gòu)cr-RNA；cr-RNA通過互補(bǔ)配對的方式引導(dǎo) Cas9 蛋白對靶序列進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制，在雙鏈切口位點(diǎn)附近造成刪除、插入等多種隨機(jī)突變。

鱗翅目幼蟲除極少數(shù)外均取食顯花植物，其中大多是農(nóng)林重要害蟲，如棉鈴蟲、小菜蛾、斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、小地老虎、草地貪夜蛾等，對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用極大的推動了鱗翅目害蟲基因功能研究。

2013年，Wang等［24］首次報(bào)道CRISPR/Cas9系統(tǒng)可應(yīng)用于家蠶基因組編輯，通過顯微注射體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和sgRNAs，獲得了重要標(biāo)記基因BmBlos2敲除品系，單個(gè)sgRNA敲除效率高達(dá)94%-95.6%，同時(shí)注射兩個(gè)sgRNA，其大片段敲除效率高達(dá)95.5%-100%。Liu等［25］利用CRISPR/Cas技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了單位點(diǎn)的小片段敲除、插入，也突破了制備染色體大片段缺失及倒位模型、同時(shí)突變6個(gè)基因等諸多技術(shù)難關(guān)。為了進(jìn)一步解決同源重組效率低下等問題，Zhu等［26］利用CRISPR/Cas9對家蠶NHEJ相關(guān)調(diào)控因子BmKu70、BmKu80、BmLigIV、BmXLF、BmXRCC4和BmTUDOR-SN進(jìn)行敲除，敲除細(xì)胞中同源重組效率提高了7倍以上。為解決家蠶飼養(yǎng)中病毒感染的問題，Dong等［27］構(gòu)建了一種病毒誘導(dǎo)的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)在病毒感染后能被迅速激活，切割BmNPV病毒中的復(fù)制關(guān)鍵因子ie-1，從而有效抑制病毒增殖。CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于鱗翅目昆蟲信號通路研究也取得了一定進(jìn)展。保幼激素（Juvenilehormones，JHs）一直被認(rèn)為是昆蟲幼蟲性狀維持及向成蟲發(fā)育的關(guān)鍵因子，Daimon等［4］對JHs合成關(guān)鍵基因JHAMT以及JHs受體Met1和Met2進(jìn)行了缺失突變，發(fā)現(xiàn)敲除后的低齡幼蟲并不會存在提前化蛹的情況，對保幼激素在變態(tài)發(fā)育中的作用有了不同的認(rèn)識。CRISPR/Cas9也成功應(yīng)用于miRNA的功能研究，利用CRISPR/Cas9對家蠶miRNA-14進(jìn)行敲除后，突變后代出現(xiàn)一定程度的發(fā)育遲緩現(xiàn)象［28］。截至目前CRISPR/Cas9技術(shù)已成功應(yīng)用于家蠶胚胎發(fā)育、體色形成、嗅覺行為、代謝通路等多個(gè)領(lǐng)域（表2）。

性信息素具有吸引雄蟲進(jìn)行交配的功能，其代謝相關(guān)基因是害蟲防治的重要靶標(biāo)。Koutroumpa等利用CRISPR/Cas9對棉葉蟲（Spodoptera littoralis）宿主和性信息素相關(guān)受體Orco基因進(jìn)行敲除，純合突變個(gè)體對宿主植物氣味和性信息素嗅覺感受缺陷［29］。斜紋夜蛾嗅覺相關(guān)基因SlitPBP3敲除后，突變?nèi)后w對性信息素的電生理反應(yīng)敏感性顯著降低［30］。棉鈴蟲性信息素的氣味受體16（OR16）敲除后，突變體雄蟲不能區(qū)分性成熟和未成熟的雌蟲，在性信息素主成分Z11-16∶OH作用下與未成熟的雌蟲交配，其子代的孵化率和存活率顯著降低［31］，為上述害蟲防治提供了的重要靶標(biāo)信息。

性別決定機(jī)制的解析對害蟲遺傳發(fā)育研究意義重大，其代謝相關(guān)通路研究為害蟲遺傳防治提供了新的思路。鱗翅目性別控制主要由Masculinizer（Masc）、Masc-piRNA、Fem、Fem-piRNA、doublesex（dsx）、Psi、Imp、Siwi等基因組成的信號通路決定［32］。Xu等［33］對家蠶性別分化相關(guān)基因Bmsxl，Bmtra2、Bmlmp、BmPSL、BmlmpM、BmPSI和BmMasc進(jìn)行敲除，進(jìn)一步解析了家蠶性別決定中上述各基因功能。Bmtra2敲除后性別決定基因Bmdsx非正常轉(zhuǎn)錄，雌性胚胎不能正常發(fā)育而致死。BmImp或BmImpM基因功能的喪失不影響性別分化。BmPSI和BmMasc基因的突變影響B(tài)mdsx的剪切，導(dǎo)致雌性生殖器官出現(xiàn)在雄性外生殖器中。BmPSI參與調(diào)節(jié)BmMasc、BmImpM和Bmdsx的表達(dá)，為家蠶雄性性別決定中的關(guān)鍵輔助因子。斜紋夜蛾Sldsx基因敲除后雄性睪丸發(fā)育異常，外生殖器畸形，無法完成交配［34］。對小地老虎雌性和雄性特異性Aidsx區(qū)域進(jìn)行敲除后，突變后成蟲外生殖器畸形或缺失，解剖發(fā)現(xiàn)卵巢和睪丸發(fā)育異常。觸角是區(qū)分小地老虎性別的主要標(biāo)志，Aidsx突變體觸角出現(xiàn)多種突變類型，同時(shí)性別差異表達(dá)相關(guān)基因如vitellogenin（Vg），pheromone binding protein（PBP），olfactory receptors（OR）等表達(dá)譜均發(fā)生相應(yīng)改變［35］。Wang等［36］研究發(fā)現(xiàn)小地老虎性別決定通路中Masc基因敲除后，突變體雄性在外生殖器中表現(xiàn)出嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)缺陷，交配行為無法正常進(jìn)行。

體色相關(guān)標(biāo)記基因的篩選對鱗翅目昆蟲遺傳學(xué)研究有重要意義，Khan等［37］利用CRISPR/Cas9對棉鈴蟲White、Brown、Scarlet及Ok基因分別進(jìn)行敲除研究發(fā)現(xiàn)，white基因敲除后后代隱性致死，同時(shí)影響卵、1齡幼蟲、成蟲眼的色素沉著。Scarlet基因敲除后1齡幼蟲、成蟲眼出現(xiàn)黃色素沉著。Ok基因敲除后幼蟲呈黑色眼，角質(zhì)層半透明。Chen等［38］對小地老虎體色相關(guān)基因yellow進(jìn)行了功能驗(yàn)證，鑒定出7個(gè)yellow基因，yellow-y基因敲除的小地老虎幼蟲呈現(xiàn)出不同于野生型的黃色表型，同時(shí)幼蟲出現(xiàn)一定程度的脫水現(xiàn)象而導(dǎo)致死亡。

田間害蟲防治及新藥靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)離不開抗藥性機(jī)理研究，CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)極大的推動了這一進(jìn)程。棉鈴蟲盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HaABCA2基因敲除后，其對Bt毒素Cry2Aa、Cry2Ab抗性增強(qiáng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)敲除品系Cry2Aa、Cry2Ab毒素不能與BBMVs結(jié)合（Brush border membrane vesicles，中腸刷狀緣膜囊泡），而Cry1Ac與BBMVs的結(jié)合不受影響，揭示棉鈴蟲HaABCA2參與Bt毒素Cry2A結(jié)合運(yùn)輸［39］。棉鈴蟲HaABCC2、HaCAD基因敲除后，敲除群體表現(xiàn)出Cry1Ac高抗性，揭示HaABCC2、HaCAD基因參與棉鈴蟲體內(nèi)Cry1Ac代謝［40］。棉鈴蟲CYP6AE基因簇包含9個(gè)首尾相連的細(xì)胞色素P450氧化酶基因，P450細(xì)胞色素氧化酶可以催化上萬種生化反應(yīng)，具備對多種化合物如植物次生物質(zhì)、殺蟲劑、環(huán)境化合物等的解毒代謝能力，Wang等［41］采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除了棉鈴蟲長達(dá)85kb的CYP6AE基因簇，發(fā)現(xiàn)該基因簇敲除品系對植物次生性化合物花椒毒素和2-十三烷酮，以及殺蟲劑順式氰戊菊酯和茚蟲威的敏感性顯著升高。2019年，草地貪夜蛾入侵我國，本課題組率先應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對草地貪夜蛾SfABCC2基因進(jìn)行敲除，闡述了草地貪夜蛾Bt毒素Cry1F解毒代謝機(jī)制［42］。Zuo等［43］通過將ssODN、Cas9蛋白、位點(diǎn)特異sgRNA顯微注射入甜菜夜蛾胚胎中，成功制備RyR基因G4946E位置定點(diǎn)突變品系，與小菜蛾、番茄夜蛾中研究相似，RyRG4946E突變后甜菜夜蛾對氯蟲苯甲酰胺、氰蟲酰胺和氟蟲雙酰胺的抗性分別增加223倍、336倍和 1 000倍以上。

新型CRISPR/Cas蛋白的發(fā)現(xiàn)以及各種基因編輯策略有機(jī)結(jié)合極大的豐富了鱗翅目基因編輯技術(shù)體系。SpCas9來源于釀膿鏈球菌，僅識別含有“NGG”PAM序列的靶位點(diǎn)，SaCas9來源于金黃色葡萄球菌，比SpCas9蛋白分子量更小，識別以“NNGRRT”序列為PAM的靶位點(diǎn)，AsCpf1識別以“TTTN”序列為PAM的靶位點(diǎn)，而Cas13a能夠靶向RNA，使靶位點(diǎn)選擇更加靈活。Cas9n（Cas9 nickase）大大提高了 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特異性，同時(shí)顯著降低其脫靶效率。dCas9（nuclease-dead Cas9）系統(tǒng)將 Cas9 蛋白切割結(jié)構(gòu)域失活，通過偶聯(lián)不同的輔助功能蛋白，如FokI、轉(zhuǎn)錄激活域、甲基化酶等，可實(shí)現(xiàn)更為精確的基因組切割實(shí)現(xiàn)靶基因激活、干擾、表觀遺傳學(xué)修飾等。如將dCas9與大鼠胞嘧啶脫氨酶APOBEC1融合，能特異的將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)G·C→A·T定向突變。與APOBEC3A（hA3A）融合可高效介導(dǎo)甲基化胞嘧啶（mC）到胸腺嘧啶（T）的堿基編輯。與海七鰓鰻（Petromyzon marinus）胞嘧啶脫氨酶（PmCDA1）結(jié)合構(gòu)建了新的胞嘧啶編輯器（nCas9-Linker-PmCDA1），在動植物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)的C→T 和 C→G 突變。PspCas13b酶和ADAR2脫氨酶融合，可高效地修復(fù)RNA的單個(gè)核苷酸，實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)A·T → G·C定向突變?；贏sCpf1（Cas12a）構(gòu)建的堿基編輯器可在A/T富集區(qū)域進(jìn)行堿基編輯，極大地拓寬了堿基編輯器的應(yīng)用范圍。

在上述研究基礎(chǔ)之上，Ma等［44］研究表明SaCas9和AsCpf1兩種核酸酶均可在家蠶BmNs細(xì)胞中誘導(dǎo)高效的位點(diǎn)特異性基因編輯，SaCas9敲除效率約為11.8%-11.9%，AsCpf1的敲除效率約 8.7%-16.7%，兩者均與SpCas9的敲除效率相當(dāng)。針對一些特殊的基因，直接敲除會導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因后代不能有效存活或傳代，Ma等［4］構(gòu)建了一套組織特異性調(diào)控基因編輯策略，通過將絲腺特異性表達(dá)Cas9蛋白的品系與組成型表達(dá)BmlaminA/C（BmLMN）gRNA品系雜交，實(shí)現(xiàn)了BmlaminA/C基因絲腺特異性敲除。Nakade等［15］將CRISPR/Cas9技術(shù)與微同源介導(dǎo)的末端連接原理結(jié)合，構(gòu)建了CRIS-PITCh編輯器，大片段敲入效率有了極大提高。張峰和Sam Sternberg團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了基于轉(zhuǎn)座子的CRISPR系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用轉(zhuǎn)座元件能實(shí)現(xiàn)目的基因高效整合到基因組，大片段敲入效率有望進(jìn)一步提高［45-46］。

4 總結(jié)與展望

ZFNs、TALENs 和 CRISPR /Cas 三種基因編輯技術(shù)各有優(yōu)劣。作為基因編輯領(lǐng)域的先行者，ZFNs

技術(shù)的應(yīng)用使基因打靶效率大大提高。但是，由于ZFNs 蛋白序列識別的特點(diǎn)，ZFNs的設(shè)計(jì)序列依賴性較高，不能滿足對全基因組任意基因任意位置進(jìn)行編輯的需求。同時(shí)，其模塊化設(shè)計(jì)及組裝難度大，成本高，大部分實(shí)驗(yàn)室并不能熟練掌握該技術(shù)，其在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用受到了極大限制，僅在少數(shù)物種如家蠶中有一定程度的應(yīng)用。與 ZFNs 技術(shù)相比，TALENs其設(shè)計(jì)及組裝較為快捷，所需實(shí)驗(yàn)周期也大大縮短，經(jīng)過較短時(shí)間的培訓(xùn)，大部分實(shí)驗(yàn)室都能熟練掌握該技術(shù)。但是，篩選高效的TALEN模塊仍需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，成本并不低，基于此在鱗翅目昆蟲中的應(yīng)用僅有少量報(bào)道。CRISPR/Cas技術(shù)的出現(xiàn)顛覆了基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，不到一周時(shí)間實(shí)驗(yàn)室就能完全掌握該技術(shù)，由于僅需要設(shè)計(jì)合成一個(gè)約20 nt與靶基因互補(bǔ)配對的堿基序列就能識別目的基因，極大的縮小了基因編輯窗口，基本能實(shí)現(xiàn)全基因組任意基因位點(diǎn)的編輯。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于多種鱗翅目昆蟲的基因編輯研究。不可忽略的是，CRISPR/Cas系統(tǒng)造成的脫靶率遠(yuǎn)高于前兩種，更高效精確的CRISPR/Cas版本有待開發(fā)。

表2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在鱗翅目昆蟲基因編輯中的應(yīng)用

相較于模式昆蟲，鱗翅目昆蟲基因編輯研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后，基因?qū)胄实褪侵饕蛩亍Ｄ壳暗幕蚓庉嫾夹g(shù)對遺傳物質(zhì)導(dǎo)入方式有極高的要求，顯微注射通常是最為直接有效的手段，但是對儀器平臺以及操作人員熟練程度要求較高。病毒載體具有高效整合、高效表達(dá)的特點(diǎn)，在人類疾病研究及基因治療中發(fā)揮著重要的作用，鱗翅目昆蟲是許多病毒的天然宿主，通過對這些病毒進(jìn)行改造，使其能夠在活體組織、細(xì)胞內(nèi)完成基因編輯系統(tǒng)的傳遞，無疑能極大的彌補(bǔ)顯微注射技術(shù)在鱗翅目昆蟲基因編輯應(yīng)用中的不足。

雖然CRISPR-Cas系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)基因組特異位點(diǎn)的高效靶向切割，通過同源重組或非同源重組的方式能夠?qū)崿F(xiàn)目的DNA片段的插入，但是大片段插入以及同源重組效率整體上仍然極低。轉(zhuǎn)座子尤其是DNA轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)簡單，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，能識別特定轉(zhuǎn)座位點(diǎn)，通過剪切、粘貼等一系列過程使基因從一個(gè)位置“跳躍”到另一個(gè)位置，實(shí)現(xiàn)目的基因的高效、位點(diǎn)特異性插入?；谵D(zhuǎn)座子的基因插入對外源基因大小限制較低，可以實(shí)現(xiàn)大片段插入，建立基于轉(zhuǎn)座酶的CRISPR系統(tǒng)能很大程度的解決鱗翅目昆蟲基因編輯大片段插入效率低及轉(zhuǎn)座隨機(jī)性問題。類似的，整合酶系統(tǒng)如Flp/FRT、Cre/Lox、φC31/att等具有動植物細(xì)胞廣泛適用性，無需外源輔助因子實(shí)現(xiàn)大片段定點(diǎn)整合及外源基因持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，利用CRISPR技術(shù)建立基于整合酶的定點(diǎn)整合“停泊位點(diǎn)”（Docking site）品系，亦可應(yīng)用于鱗翅目基因組大片段整合研究。

大多鱗翅目昆蟲均為農(nóng)林牧重要害蟲，科學(xué)家們一直致力于建立有害昆蟲的遺傳防控技術(shù)體系，并取得了一定成效?；诨蚓庉嫾夹g(shù)的基因驅(qū)動技術(shù)，能使有害突變在群體中快速擴(kuò)散或替代原有基因座，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到控制害蟲種群的目的。但是，一旦把基因驅(qū)動的生物釋放至野外，人們便很難對這些生物進(jìn)行控制，可能會引發(fā)一系列的生態(tài)安全事件。利用時(shí)空表達(dá)調(diào)控元件給基因驅(qū)動裝上“開關(guān)”，建立可調(diào)控的基因驅(qū)動技術(shù)體系，對鱗翅目昆蟲遺傳防控技術(shù)的建立至關(guān)重要。

盡管基因編輯技術(shù)有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，但是成功應(yīng)用于鱗翅目基因組編輯的技術(shù)仍屈指可數(shù)。隨著5 000種昆蟲基因組（i5k）計(jì)劃、昆蟲TOP1000計(jì)劃的推進(jìn)，眾多鱗翅目昆蟲全基因組信息有望破譯。靈活應(yīng)用現(xiàn)有的技術(shù)開發(fā)高效的、鱗翅目昆蟲適用的基因編輯的技術(shù)體系，利用基因編輯技術(shù)對鱗翅目昆蟲遺傳資源進(jìn)行深度挖掘，加速昆蟲生理生化、遺傳代謝、行為機(jī)理解析，開發(fā)新型經(jīng)濟(jì)昆蟲，制備昆蟲不育系、建立綠色害蟲防控體系，大量的工作仍有待開展。