重組白介素2對紅鰭東方鲀的血液生化指標及免疫指標的影響

保明秀 藏林 張紅斌 劉福君 荊笛 王秀利

（大連海洋大學水產與生命學院，大連 116023）

白細胞介素-2（IL-2）是一種多效細胞因子，可驅動T細胞生長，增強NK細胞溶解活性，誘導調節(jié)性T細胞分化，并介導激活誘導的細胞死亡。目前，IL-2已成為一種在預防和治療疾病方面?zhèn)涫荜P注的重要細胞因子［1］。可以提高動物機體細胞免疫和體液免疫能力，解除機體免疫抑制，增強疫苗免疫效果，降低疫苗副反應，治療寄生蟲感染等［2］。IL-2在作為免疫治療劑，構建新型基因工程苗，作為免疫增強劑等方面都取得良好效果［3］。重組細胞因子能明顯提高細菌、病毒和寄生蟲疫苗的免疫效果。在醫(yī)學領域商品化的重組人IL-2已經用于腫瘤、艾滋病、乙型肝炎等疾病的治療［4-5］。

紅鰭東方鲀隸屬于硬骨魚綱，鲀形目，鲀科，東方鲀屬，是一種北太平洋西部海域近海底層的中大型魚類［6］。近些年在中國的江蘇、上海和遼寧等地紅鰭東方鲀的人工養(yǎng)殖已初具規(guī)模，其產品主要出口日本、韓國。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，病害時有發(fā)生［7］。2005年，Bird等［8］成功克隆了日本河豚（Japanese rubripes）的IL-2基因；2008年，王建平等［9］成功克隆了紅鰭東方鲀IL-2基因，為紅鰭東方鲀IL-2蛋白作為新型疫苗免疫佐劑和自然抗病生物活性物質的開發(fā)奠定了基礎。魚類的血細胞對于自身生理狀態(tài)的變化以及外界環(huán)境因子的刺激十分敏感，通過對魚類血液指標的檢測，可以初步了解魚類的健康狀況［10］。本研究探索r IL-2對紅鰭東方鲀血液生化的血液生化指標及一些免疫指標的影響，旨在為能提高紅鰭東方鲀機體免疫力的治療劑等的開發(fā)和利用提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚購自大連天正養(yǎng)殖場，隨機挑選體質量為（205.9±30.5）g的紅鰭東方鲀，在農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)一周，水溫為19-21℃，溶解氧大于7 mg/L，總氨氮小于0.05 mg/L，亞硝酸鹽小于0.01 mg/L。載有紅鰭東方鲀白介素-2基因陽性克隆的大腸桿菌為實驗室自有［11］。

1.2 方法

1.2.1 rIL-2的獲取 挑取保種的菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落接種于10 mL有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)過夜。吸取1 mL以1∶100的比例接種于100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600達到0.45-0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，然后28℃，150 r/min誘導8 h。取100 mL的兩管菌液，離心，棄上清，用PBS洗滌重懸。經超聲波破菌（200-500 W，超3 s、停3 s，持續(xù)15 min），然后再以5 000 r/min離心10 min，分離上清液和沉淀，沉淀用適量PBS重懸，分別將可溶性表達的IL-2和包涵體進行SDS-PAGE分析并根據(jù)孫鶴等的方法進行純化分離及鑒定［11］。最后用凱基生物的Bradford法蛋白含量檢測試劑盒測定用于免疫的菌液中的蛋白含量，并計算濃度。

1.2.2 試驗設計 隨機挑選75尾試驗魚并隨機分為5組，4個實驗組，1個對照組，每組15尾魚。依據(jù)喬海霞等、Cata等和Wu等［12-14］，r IL-2腹腔注射含量參考值約在0.4 μg/mL-2 μg/mL。設計r IL-2免疫劑量為2.5、5、7.5和10 μg/尾魚，依據(jù)濃度稀釋并進行腹腔注射，以同等量的PBS作為對照。腹腔注射前用碘伏，酒精對體表進行局部消毒。并于注射后的4 h、8 h和12 h分別隨機抽取各濃度組的5尾魚進行尾靜脈采血。

1.2.3 血樣的采集和處理 采血24 h前空腹，尾靜脈采血制作血清用于后續(xù)試驗，采血前用濃度為0.02%-0.05%的MS-222對試驗魚進行麻醉。從每個注射濃度組隨機取5尾魚，使用一次性無菌注射器（1 mL）進行尾靜脈采血，采血時針頭使用抗凝劑（素鈉濃度為1%）潤洗，并將全血分裝在1.5 mL的離心管中，置于室溫。采血完及時離心，以4℃，3 000 r/min，離心10 min，吸取血清于新的1.5 mL離心管中，用Parafilm封口膜封口，放入-20℃冰箱，備檢。

1.2.4 血清生化和免疫指標測定 本試驗對血清中的總蛋白（TP）、白球比（A/G）、谷草轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）等生化指標均用日本日立7020生化分析儀測得。非特異性免疫指標超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LYS），特異性免疫指標補體C3，免疫球蛋白G（IgG）、M（IgM）、E（IgE）均按照試劑盒（購自科華生物）說明書進行測量。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行采用One-way ANOVA分析，采用Duncan多重比較法檢驗，P＜0.05為顯著性差異水平。試驗結果用平均值±標準差（x-±s）表示。

2 結果

2.1 重組蛋白分離結果

經過IPTG誘導表達后菌液經過超聲波破碎后，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，可溶性表達的IL-2的表達量顯著高于其他雜蛋白，表達產物為融合蛋白，其相對分子質量約32.5 kD（與預測大小相符）。上清純化后經檢測只有唯一帶，相對分子質量約32.5 kD（圖1）。測得重組蛋白濃度為0.865 0 μg/μL。

圖1 IPTG誘導表達和純化結果

2.2 血液相關指標檢測結果

2.2.1 血液生化指標檢測結果 經r IL-2免疫之后不同濃度組在不同時間的血液生化指標變化如圖2。從圖2中可見，2.5 μg濃度組在4 h時間點白球比顯著高于8 h和12 h時間點（P＜0.05），其余各組之間無顯著差異（P＞0.05）。5 μg和 7.5 μg 濃度組尿素氮含量在8 h時間點有顯著升高的趨勢，在各個濃度組的8 h時間點顯著高于同組內其它時間點，2.5μg、10 μg濃度組的4 h時間點尿素氮含量顯著低于各時間濃度組（P＜0.05）。在注射了rIL-2之后，2.5 μg濃度組甘油三酯含量在8 h時間點顯著高于PBS組，4 h時間點甘油三酯含量有隨著注射濃度增加而增加的趨勢；8 h時間點甘油三酯含量有隨著注射濃度增加先降低再升高的趨勢（P＜0.05）。

2.2.2 血液非特異性免疫指標檢測結果 經r IL-2免疫之后不同濃度組在不同時間的血液的非特異性免疫指標變化如圖3。由圖3可知：經r IL-2免疫之后，5 μg濃度組在4 h時間點溶菌酶活性顯著升高（P＜0.05），但各個時間濃度組無顯著性差異（P＞0.05）。谷草轉氨酶活性2.5 μg濃度組8 h時間的要顯著高于同組其他時間點，同時也顯著高于PBS組。5 μg濃度組4 h和8 h時間的要顯著高于同組其他時間點，也顯著高于PBS組，整體看來2.5 μg、5 μg和7.5 μg濃度組的谷草轉氨酶活性在8 h時間點要顯著高于其他時間點（P＜0.05），10 μg濃度組與PBS組無顯著差異（P＞0.05）。經r IL-2免疫之后，2.5 μg和5 μg濃度組超氧化物歧化酶的活性的在4 h時間點顯著高于其他各組，5 μg濃度組的8 h時間點超氧化物歧化酶活性也顯著高于各組（P＜0.05），其余各個濃度時間點之間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 經r IL-2免疫之后紅鰭東方鲀的血液的生化指標

2.2.3 血液特異性免疫指標檢測結果 經r IL-2免疫之后不同濃度組在不同時間血液的特異性免疫指標變化如圖4。由圖4可知，各組血清補體C3含量受r IL-2含量和采樣時間影響顯著（P＜0.05），5 μg濃度組的補體C3含量在4 h時間點顯著低于各組（P＜0.05），其余各濃度時間點內無顯著性差異（P＞0.05）。注射r IL-2后，隨著注射濃度增加，免疫球蛋白E含量有升高趨勢，但在各時間點各濃度組間無顯著性差異（P＞0.05）。5 μg濃度組的12 h時間點免疫球蛋白G的含量顯著低于PBS組，7.5 μg濃度組8 h、12 h時間點免疫球蛋白G含量有顯著升高（P＜0.05），其余各時間點各濃度組間無顯著性差異（P＞0.05）。各組血清免疫球蛋白M含量受r IL-2含量和采樣時間的影響顯著（P＜0.05），7.5 μg濃度組的免疫球蛋白M含量在12 h時間點顯著低于各組（P＜0.05），其余各濃度時間點內無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 經r IL-2免疫之后紅鰭東方鲀的血液非特異性免疫指標

圖4 經r IL-2免疫之后紅鰭東方鲀的血液的生化指標

3 討論

血液生化指標能反映魚類的生理狀態(tài)。魚類血液與機體的代謝、疾病及營養(yǎng)狀況有著密切的關系［15］。2.5 μg在本研究中，經r IL-2免疫之后，在注射2.5 μg組和5 μg組血液中的白球比在第4小時時有顯著地增高，總蛋白含量無顯著差異?？偟鞍装ò椎鞍缀颓虻鞍?，血液中白蛋白的主要功能是維持血液中膠體的滲透壓，而球蛋白主要參與脂類或脂溶性物質的運輸及機體免疫反應。A/G能在一定程度上反映白蛋白和球蛋白的含量變化，反映肝臟的功能狀況［16-18］。血清中尿素氮的含量是反映腎功能的指標，尿素氮 濃度降低表明氨基酸平衡好，蛋白質分解速度降低，機體蛋白質合成速度加快，同時尿素氮的含量變化也和生物體攝入含氮物質的多少有關系［19-20］。在各個濃度組的8 h時間點顯著高于同組內其它時間點，2.5 μg和10 μg濃度組的4 h時間點，尿素氮含量顯著低于各時間濃度組，在注射rIL-2后血清尿素氮含量的波動屬于正常變化，但可以從數(shù)據(jù)看出2.5 μg和10 μg注射濃度組在4 h內機體的蛋白合成速度加快，4 h-8 h內蛋白質分解速度提高，8-12 h內又逐漸降低恢復至正常水平。甘油三酯和膽固醇是血脂的主要組成，當體內有多余的能量時，脂肪組織會以甘油三酯的形式將其儲存?zhèn)溆?，大部分組織均可利用甘油三酯的分解產物供給能量，同時肝臟和脂肪等組織還可以進行甘油三酯合成［20-21］。在注射了rIL-2之后，2.5 μg濃度組甘油三酯含量在8 h時間點顯著高于PBS組，8 h時間點甘油三酯含量有隨著注射濃度增加先降低再升高的趨勢，注射rIL-2對機體合成脂肪的速度有一定影響，可能與肝臟的免疫反應有關。

谷草轉氨酶（AST）主要參與體內轉氨基作用，肝功能正常時，血漿谷草轉氨酶活性很低，但當肝細胞或某些組織損傷或壞死，都會導致血液中的谷草轉氨酶活性升高［19，22］。從實驗結果可見，經r IL-2免疫之后，血液中的谷草轉氨酶含量升高，說明對肝臟有一定的影響，總體呈現(xiàn)出隨時間先升高后降低的趨勢，其中低濃度組影響較為明顯。對于動物，超氧化物歧化酶（SOD）在消除活性氧的毒性中發(fā)揮了重要作用，并參與由病毒感染和細菌引起的免疫反應，抗氧化酶在機體內表現(xiàn)出一定的抑菌效果，從而保護機體不受外源物質的破壞［23-24］。本實驗中，低濃度注射組的超氧化物歧化酶明顯升高，說明外源rIL-2可以提高紅鰭東方鲀體內超氧化物歧化酶活性。溶菌酶是生物機體在免疫反應過程中分泌的具有溶解細菌作用的非特異性免疫因子，在動物的免疫防御中發(fā)揮重要作用［25］。5 μg濃度組在4 h時間點溶菌酶活性顯著升高，說明外源rIL-2可以影響魚體免疫反應，在一定程度上提高魚體免疫。

免疫球蛋白是魚類特異性體液免疫應答中最主要的介質，在體液免疫尤其是抵抗細菌性抗原侵擾方面起著重要的作用，硬骨魚類中目前已發(fā)現(xiàn)有IgM、IgD、IgZ、IgT和IgM-IgZ及從紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）中報道的新型IgH［26］。本實驗中，注射rIL-2，對免疫球蛋白的含量有影響，但各組之間差異并不顯著，可能IL-2并未介導免疫球蛋白產生的途徑。

IL-2主要通過直接作用于T細胞而在免疫系統(tǒng)的關鍵功能、耐受性和免疫中發(fā)揮重要作用，并且當最初的T細胞也受到抗原刺激時，IL-2也會促進T細胞分化為效應T細胞和記憶T細胞，從而幫助機體抵抗感染［27］。淋巴細胞（Lymphocyte）是白細胞的一種，可分為T淋巴細胞（又名T細胞）、B淋巴細胞（又名B細胞）和自然殺傷（NK）細胞［28］。本研究中白球比的上升，表示著白細胞的增多，外源IL-2促使了紅鰭東方鲀白細胞的產生，刺激了免疫反應，而對同為魚類重要免疫分子的補體和抗原并沒有太大的促進作用。吞噬細胞也是硬骨魚類細胞免疫的重要組分［28］，而超氧化物歧化酶是吞噬細胞吞噬過程中的反映指標。本研究中超氧化物歧化酶明顯升高，表明了IL-2對吞噬細胞具有促進作用。肝腎作為硬骨魚類重要的免疫器官，在本研究中通過常規(guī)的檢測肝腎功能的血液指標表明，外源IL-2也刺激肝腎作出反應，但具體是促免疫還是肝腎毒性損傷還需做更多研究。IL-2不遵循化學療法的經典劑量反應曲線，高劑量和低劑量IL-2的免疫活性表現(xiàn)出鮮明的對比，這可能與IL-2受體（CD25、CD122和CD132）在不同細胞群體上的分布不同有關，從而導致不同細胞受高劑量和低劑量IL-2的激活反應不同，通常高劑量會抑制免疫，而低劑量會刺激1型免疫［29］，和我們的研究是一致的，在低劑量時血液各項指標表現(xiàn)出了顯著差異（P＜0.05）。

本試驗結果表明，注射rIL-2影響了紅鰭東方鲀免疫相關指標的變化，數(shù)據(jù)各項指標的變化峰值可能在8 h內，外源IL-2促使紅鰭東方鲀的肝臟做出反應，各項指標的變化差異可能與實驗魚個體大小也有關系，外源IL-2對魚體抗病能力等方面還需進一步研究。

4 結論

本試驗活化載有rIL-2的大腸桿菌，對經誘導表達后得到重組目的蛋白r IL-2進行進一步魚體免疫，得到了不同免疫濃度下紅鰭東方鲀血液的生化指標及免疫指標的變化趨勢，證明外源IL-2促使紅鰭東方鲀的肝臟等身體免疫器官做出反應的同時也促使了免疫細胞做出反應。