軍曹魚催乳素受體PRLR1基因的克隆及其在不同鹽度條件下mRNA 表達差異

黃寶松 李金鳳 張野 曹丹煜 盧曉穎 陳剛 王忠良

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院，湛江 524088）

催乳素（Prolactin，PRL）是一種由內(nèi)分泌器官腺垂體前葉分泌的多效單鏈多肽類激素，于1928年被Stricker和Grneter驗證該激素具有使假陽性妊娠母兔分泌乳汁的功能，并命名為催乳素。國內(nèi)外研究結(jié)果證實了催乳素的生理功能不單單是生殖和泌乳，還包括調(diào)節(jié)水鹽平衡、胰島細胞分化、脂肪代謝、增強非特異性免疫、刺激腸道加速鈣的吸收等［1-2］。研究顯示，催乳素通過與其受體蛋白—催乳素受體（Prolactin receptor，PRLR）結(jié)合，啟動信號級聯(lián)，利用JAK激酶和信號傳導子及轉(zhuǎn)錄激活子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）在靶細胞上介導其生理功能，主要的信號蛋白為JAK2和STAT［3-4］。PRLR是跨膜受體蛋白，屬于I類細胞因子受體超家族。大量的研究證實了PRLR在哺乳動物中存在多種亞型，可分為長鏈PRL、中長鏈PRL和短鏈PRL，主要差異為長度和胞內(nèi)段的組成。而在硬骨魚類中則存在兩種PRLR基因，是硬骨魚類特有的現(xiàn)象。據(jù)報道，莫桑比克羅非魚存在PRLR1和PRLR2兩種PRL受體亞型［5］。目前，已在多種硬骨魚類上克隆出PRLR的全長序列，如尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii），并且利用不同激素刺激轉(zhuǎn)染細胞或直接體內(nèi)注射，證實兩種亞型的PRLR都能啟動下游信號通路，說明這兩種亞型PRLR都是PRL 的特異性受體［6-7］。

廣鹽性魚類適應不同鹽度的過程中受神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控，主要作用在滲透壓調(diào)節(jié)器官，如鰓、腸和體腎等［8］。Pavlosky等［9］發(fā)現(xiàn)莫桑比克羅非魚（O. mossambicus）在海水中血漿滲透壓和PRLR2鰓組織mRNA表達量均高于淡水實驗組，而PRL和NKAaα1a、PRLR1鰓組織mRNA表達量則低于淡水實驗組，提示PRL、PRLR1參與了魚類適應淡水生活的生命活動。王杰［2］將尖鰭鯉（Cyprinus acutidorsalisWang）急性脅迫48 h 后，在鰓、腸、腎、肝、性腺、腦、腦垂體、脾及皮膚等組織中均能檢測到PRLR的mRNA，其中，在鰓中表達量最高。同樣的，在黑鯛的鰓、腸、腎、肌肉、性腺、心臟、肝臟、胃、脾臟及腦垂體中也檢測出PRLR的存在，且表達規(guī)律相似［10］，說明PRLR在各個組織中均有分布，除滲透壓調(diào)節(jié)外，可能參與多項生理活動的調(diào)控。

軍曹魚（Rachycentron canadum）又名海鱺，隸屬鱸形目（Perciformes）、軍曹魚科（Rachycentridae）、軍曹魚屬（Rachycentron），為廣鹽性、中型肉食性洄游魚類［11］。軍曹魚廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域，包括大西洋、印度洋和太平洋。其生長速度快，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高，是具有食用價值的重要海水經(jīng)濟魚類。軍曹魚養(yǎng)殖多以海水網(wǎng)箱為主，受臺風、暴雨等極端天氣影響，海水鹽度波動較大，對軍曹魚的生長和存活造成了一定的影響。目前在其他硬骨魚類鹽度適應過程中PRL和PRLR的表達模式的研究較多，而軍曹魚的較少。因此，為探究軍曹魚適應高鹽和低鹽水體的滲透壓調(diào)節(jié)機制，本實驗克隆了PRLR1cDNA，并通過熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測了PRLR1在健康組織中的mRNA表達豐度和分別適應高鹽、低鹽后的表達規(guī)律，為研究軍曹魚鹽度適應滲透壓調(diào)節(jié)機制奠定分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及試劑 實驗用魚（軍曹魚）采自于廣東海洋大學東海島海洋生物研究基地，挑選出規(guī)格一致，健康有活力，體表無損傷的軍曹魚幼魚，測得平均體長為18.35±1.75 cm，平均體重為60.53±8.21 g。試驗前暫養(yǎng)于室內(nèi)1.5立方水體的水桶，使用正常鹽度（30‰）的過濾海水，水溫為27±2℃。暫養(yǎng)1周后，挑選健康個體，剖取鰓、腸、體腎、腦及心臟等8個組織，迅速置于液氮中速凍，3 h后移至-80℃冰箱保存。

總RNA提取試劑盒TransZol Up Plus RNA Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、膠回收試劑盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit均購自北京全式金生物有限公司，SYBR?Select Master Mix購自聚研生物科技有限公司（廣州），SMARTer?RACE 5'/3' Kit、DH5α 感受態(tài)細胞、pMD18-T Vector、LA-Taq DNA聚合酶購自大連寶生物有限公司。引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.1.2 慢性鹽度適應實驗 鹽度實驗設置3個鹽度梯度，分別為10‰、30‰和35‰，其中以30‰組為對照組。將暫養(yǎng)7 d后的軍曹魚分為3組，每組設3個重復，放置10尾軍曹魚。使用淡水或高品質(zhì)海水晶將養(yǎng)殖用水以每天調(diào)低或調(diào)高5個鹽度，直到實驗組鹽度達到要求后開始實驗。養(yǎng)殖采取靜水充氣方式，每日投喂6%體重的石斑魚配合飼料，換水率為30%。養(yǎng)殖4周后，各鹽度下隨機挑選5尾軍曹魚，分別采取鰓、腸、體腎3種組織，立即放入液氮中速凍，3 h后移至-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA第一鏈合成 參照RNA提取試劑盒的說明書，以軍曹魚幼魚的鰓絲為材料，提取總RNA后，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，超微量核酸蛋白測定儀測定濃度，-80℃保存。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，使用1 μg總RNA合成cDNA第一鏈，-20℃保存。

1.2.2 軍曹魚PRLR1基因的克隆 通過實驗室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出注釋為PRLR的unigene，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST比較，確定為魚類PRLR1基因片段。根據(jù)比較結(jié)果，選取保守區(qū)域設計特異性引物（表1）進行擴增。其 中，PRLR-F1、PRLR-F2、PRLR-R1和PRLR-R2用來克隆中間片段，PCR程序設計為95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠分離出目的條帶，轉(zhuǎn)化連接，挑選陽性單克隆菌落進行測序。根據(jù)測序得到的中間片段序列設計3'和5'末端巢式PCR引物（分別為3'-F1、3'-F2、5'-R1和 5'-R2）（表 1）。先以 3'-F1和 Long primer、5'-R1和Long primer配對擴增，程序設計為95℃預變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。產(chǎn)物稀釋2倍后作為模板進行第二次擴增，引物為3'-F2和Short primer、5'-R2和Short primer。程序設計為95℃預變性 5 min；95℃變性30 s，62 /67℃退火 30 s，72℃延伸60 s/30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化。最終，挑選出單菌落送上海生工生物工程公司測序。

1.2.3 生物信息學分析 將測序結(jié)果導入DNAMAN軟件，拼接后得到PRLR1基因的全長cDNA序列。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫的分析工具ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/）預測，獲得完整的軍曹魚PRLR1開放閱讀框（ORF）和氨基酸序列。利用TMHMM Server2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測跨膜螺旋域。利用signalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽。使用SMART網(wǎng)站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載同源氨基酸序列，運行ClustalX1.83進行氨基酸序列多重比較和同源性分析。使用MEGAX軟件以領接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 實驗所用引物

1.2.4PRLR1基因的組織差異表達和鹽度適應后PRLR1基因的表達分析 根據(jù)PRLR1基因cDNA序列，設計特異性引物qPRLR-F、qPRLR-R（表1），擴增長度為199 bp；以軍曹魚β-actin基因為內(nèi)參。qRT-PCR擴增反應在實時熒光定量擴增儀（Roche light CyclerTM 96）中進行，使用SYBR?Select Master Mix試劑盒檢測PRLR1基因在鰓、腸、體腎、腦、胃、肌肉、脾臟和心臟等8個組織的表達豐度和鹽度適應后PRLR1基因在鰓、腸及體腎等滲透壓相關器官的表達豐度。擴增程序設計為：95℃預變性10min；95℃變性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s，循環(huán)40次。每個樣品重復檢測3次以減少誤差。運用2-ΔΔCt方法計算PRLR1基因的相對表達量，使用SPASS19.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 PRLR1基因全長cDNA序列的克隆和氨基酸序列分析

根據(jù)測序結(jié)果拼接結(jié)果，得到軍曹魚PRLR1基因cDNA序列（GenBank序列登錄號為MN080491），全長有2 629 bp，開放閱讀框ORF有1 953 bp，編碼650個氨基酸（圖1）。其中，5'UTR大小為248 bp，3'UTR大小為427 bp。細胞外區(qū)的4個半胱氨酸，分別位于37、47、76和87位氨基酸上。利用TMHMM Server2.0預測跨膜螺旋域，結(jié)果顯示第1-234個氨基酸為膜外段，第235-257個氨基酸存在跨膜螺旋域，第258-650個氨基酸為膜內(nèi)段。利用signalP-5.0預測信號肽，發(fā)現(xiàn)PRLR1信號肽為第1-25個氨基酸，剪切位點為第25-26個氨基酸。通過SMART預測功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示PRLR1氨基酸序列含有2個纖維連接蛋白3型結(jié)構(gòu)域（Fibronectin type 3 domain，F(xiàn)N3）（29-113 aa、128-214 aa）。

2.2 PRLR1基因的氨基酸序列同源比較和系統(tǒng)進化分析

氨基酸序列同源比較結(jié)果如圖2。Blast結(jié)果顯示：軍曹魚PRLR1與大黃魚（Larimichthys crocea）、大刺鰍（Mastacembelus armatus）和金錢魚（Scatophagus argus）同源性最高，分別為76.95%、74.89%和74.88%。此外，與黑棘鯛、尼羅羅非魚、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鮭（Salmo salar）的同源性分別為73.66%、68.48%、55.45%和55.95%；使用MEGAX軟件構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示：軍曹魚先與鄰近鱸形目的大刺鰍在物種進化上聚為一支，距離最近；其次與大黃魚、黑棘鯛和金錢魚等聚為一支；人（Homo sapiens）和小鼠（Mus musculus）、鳥類綠頭鴨（Anas platyrhynchos）和紅原雞（Gallus gallus）分別聚為一支，與軍曹魚關系較遠（圖3）。

2.3 PRLR1組織表達分析

qRT-PCR組織表達結(jié)果顯示，PRLR1基因在軍曹魚的各個組織中均有表達，其中鰓表達量最高；其次是肌肉、體腎和腸，而在胃、脾、腦和心臟中則微量表達（圖4）。

2.4 不同鹽度下軍曹魚PRLR1的組織表達分析

高鹽（30‰）和低鹽（10‰）適應4周后，軍曹魚PRLR1基因在鰓、腸、體腎的表達情況如圖5所示。結(jié)果顯示，高鹽適應后，PRLR1基因在鰓中表達量最高（為對照組1.49倍，顯著差異，P＜0.05），腸次之，體腎最少；對照組中，PRLR1基因在鰓中表達量最高，體腎次之，腸最少；低鹽適應后，PRLR1基因同樣在鰓組織中表達量最高（為對照組0.06倍，極顯著差異，P＜0.001），在腸、體腎中微量表達。其中，隨著鹽度下降，PRLR1基因的在鰓、腸、體腎中表達量均逐漸下降。PRLR1基因在對照組和低鹽組的腸組織的表達量均低于體腎，而在高鹽組則相反，表現(xiàn)為腸表達量高于體腎。

3 討論

PRLR1是I類細胞因子受體超家族中重要成員，與PRL結(jié)合后，形成激素受體三聚合體復合物，進而激活PRLR1和細胞內(nèi)酪氨酸激酶的磷酸化，在魚類滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的信號傳導作用［10］。本研究利用RACE技術(shù)成功克隆出軍曹魚的PRLR1全長cDNA序列，其中包含1 953 bp的ORF，編碼650個氨基酸，具有脊椎動物PRLR的基本特征。相對于有較大差異的細胞內(nèi)區(qū)，脊椎動物PRLR細胞外區(qū)保守性較高，其C端包含了由4個保守的半胱氨酸構(gòu)成的2個二硫鍵以及由W-S-X-W-S（X為差異氨基酸）構(gòu)成的WS區(qū)［12］。細胞內(nèi)區(qū)作為受體偶聯(lián)啟動信號級聯(lián)的關鍵部位，在魚類中存在著不同長度和組成，相似度不高，僅有2個相對保守區(qū)域，分別為box1和box2。box1是由靠近跨膜區(qū)的8個富含脯氨酸的疏水殘基組成的，其形成的SH3折疊（SrC kinase homology domain3）是信號轉(zhuǎn)換分子特異識別位點。box2由疏水殘基、帶負電荷和正電荷的殘基組成，在魚類和哺乳動物中保守性比box1?。?3］。軍曹魚的PRLR1除存在二硫鍵和WS區(qū)外，同樣含有box1。在斜帶石斑魚［14］、黑棘鯛中PRLR1也存在WS區(qū)和box1，運行ClustalX軟件對軍曹魚與其他物種進行氨基酸序列同源比較，結(jié)果顯示，軍曹魚PRLR1的WS區(qū)和box1確實在魚類和哺乳動物上高度保守，說明PRLR1的WS區(qū)和box1結(jié)構(gòu)域在魚類和哺乳動物進化上相對保守。系統(tǒng)進化樹結(jié)果也顯示，軍曹魚PRLR1與鱸形目的大刺鰍、大黃魚等聚為一支，與人、小鼠等哺乳動物較遠，這與物種進化過程規(guī)律相符，進一步說明本研究中PRLR1屬于魚類PRLR家族成員。

圖1 軍曹魚PRLR1基因cDNA序列及氨基酸序列

圖2 軍曹魚PRLR1氨基酸序列多重序列比對分析

圖3 軍曹魚PRLR1氨基酸序列聚類分析

廣鹽性魚類能適應較大范圍鹽度的水環(huán)境，主要與其滲透壓調(diào)節(jié)器官有關，如鰓、腸、體腎和皮膚等。其中，鰓作為廣鹽性魚類的主要滲透壓調(diào)節(jié)器官之一，已有大量文獻證實其滲透壓調(diào)節(jié)能力與魚鰓中的氯細胞和Na+/K+-ATPase酶密切相關，其中，氯細胞進行Na+、Cl-離子的運輸，Na+/K+-ATPase酶為其運輸離子提供動力。魚在外界水環(huán)境鹽度由低滲轉(zhuǎn)向高滲時，鰓絲結(jié)構(gòu)與生理功能存在顯著性差異。中華鱘在鹽度為15的半咸水中馴養(yǎng)60 d后，鰓絲和鰓小片中氯細胞數(shù)量顯著超過淡水馴化組，其細胞體積膨大，這與氯細胞排出過量的Na+、Cl-以輔助魚體適應高滲環(huán)境的特征相適應［15］。在施氏鱘（Acipenser schrenckii）［16］、馬蘇大馬哈魚（Oncorhynchus masou）［17］、美洲鰣（Alosa sapidissima）［18］中也有類似的研究結(jié)果。魚類PRLR通過與催乳素結(jié)合，可以抑制Na+/K+-ATPase酶活性、縮小氯細胞，達到穩(wěn)定魚體滲透壓的目的［19］。軍曹魚PRLR1組織分布結(jié)果顯示，其在鰓、腸、體腎、肌肉、胃、脾、腦和心臟中都有分布，其中主要分布在鰓、腸和體腎等滲透壓調(diào)節(jié)器官，鰓表達量最高，肌肉次之，這與虹鱒、金頭鯛（Sparus aurata）、金魚（Carassius auratus）等魚類PRLR1表達規(guī)律相似［20-22］，說明軍曹魚PRLR1基因主要功能為滲透壓調(diào)節(jié)，且主要作用場所在鰓上，同時也暗示了PRLR1參與其他生理活動的調(diào)節(jié)。

在硬骨魚類中，人們普遍認為PRL和生長激素（GH）在鹽度適應過程中共同參與滲透壓調(diào)節(jié)，前者適應低鹽水體，后者適應高鹽水體。研究表明，在急性鹽度脅迫中，褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）、日本鰻鱺（Anguilla japonica）的血漿中PRL濃度與外部滲透壓呈負相關，而GH呈正相關［23-24］。從達里湖（半咸水）中洄游到貢格爾河（淡水）的瓦氏雅羅魚（Leuciscus waleckii），其血清中PRL含量顯著上升，而GH含量顯著下降［25］。此外，有研究表明在不同魚類中，PRL的調(diào)節(jié)能力表現(xiàn)出了種屬差異，如PRL在大馬哈魚淡水適應過程中并沒有產(chǎn)生顯著影響［26］。在體外實驗中，鰓和垂體中的受體受PRL和環(huán)境滲透壓刺激后，均產(chǎn)生差異反應：受PRL刺激后PRLR1表達量升高［27］，而增加細胞外滲透壓則促使PRLR2表達量升高［28］。因此，PRL對滲透調(diào)節(jié)的作用可能受到激素水平和環(huán)境滲透壓共同調(diào)控。本研究結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)了軍曹魚PRLR1基因經(jīng)低鹽適應后，在鰓、腸、體腎中mRNA表達量皆顯著性上調(diào)，而在高鹽適應中表達量變化規(guī)律均呈逐步下降趨勢，且在腸和體腎中微量表達。低鹽組、正常組和高鹽組中，PRLR1基因的表達量均為鰓組織最高，腸次之，體腎最低。類似的研究結(jié)果可見于尖鰭鯉［2］、金錢魚［29］。由以上結(jié)果推測，PRLR1基因能調(diào)節(jié)魚體滲透壓穩(wěn)態(tài)，且鰓組織為PRLR1的主要作用場所，在軍曹魚適應低鹽度環(huán)境中起到重要作用。

圖4 軍曹魚PRLR1各組織相對表達量

圖5 鹽度適應后軍曹魚PRLR1各組織相對表達量

4 結(jié)論

本研究首次克隆出軍曹魚PRLR1基因全長cDNA，該基因全長為2 629 bp，包含1 953 bp的開放閱讀框ORF，共編碼650個氨基酸。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)，軍曹魚PRLR1基因與鱸形目魚類相似性高，都含有WS區(qū)和box1等標志性結(jié)構(gòu)域。該基因在多個組織中均有表達，其表達水平鰓最高，肌肉、腸和體腎次之。在鹽度適應中，鰓、腸、體腎中PRLR1表達量隨著鹽度的降低而升高，與對照組差異顯著。