種植體周?chē)l溝液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)

陳慧文，胡 苡，張衛(wèi)平，陳景宜#，宋忠臣#

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院· 口腔醫(yī)學(xué)院牙周病科，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔 醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011；2. 甘肅省蘭州市口腔醫(yī)院，蘭州 730000

種植體周?chē)资且环N發(fā)生在口腔種植體周?chē)M織的菌斑相關(guān)的病理狀態(tài)，其臨床特征表現(xiàn)為種植體周?chē)つこ霈F(xiàn)炎癥、探診出血和/或溢膿、探診深度（probing depth，PD）增加和/或黏膜邊緣的退縮，影像學(xué)檢查可觀(guān)測(cè)到進(jìn)行性的骨喪失[1]。種植體周?chē)l溝液的量及其細(xì)胞因子能夠一定程度上反映種植體周?chē)M織的炎癥狀況，可用于區(qū)別種植體周?chē)M織的健康與疾病狀態(tài)[2]。IL-1β、IL-6 和TNF-α 在炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要的作用，與種植體周?chē)椎陌l(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。因此，本研究擬檢測(cè)IL-1β、IL-6 和TNF-α 在種植體周?chē)l溝液中的含量并探討其與種植體周?chē)椎年P(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2019 年1 月—10 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院牙周科就診的種植修復(fù)患者24 例（共24 顆種植體）；根據(jù)種植體周?chē)闆r，分為種植體周?chē)捉M12 例[女5 例，男7 例，平均年齡（48.3±1.9）歲]和種植體周?chē)】到M12 例[女8 例，男4 例，平均年齡（42.7±4.3）歲]。以該院行常規(guī)口腔檢查的健康人群為健康天然牙對(duì)照組，共12 例[女7 例，男5 例，平均年齡（38.9±2.3）歲]。研究獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批號(hào)：SH9H-2019-T178-1），患者知情同意。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

無(wú)全身系統(tǒng)性疾??；無(wú)吸煙、酗酒；未處于妊娠或哺乳期；納入研究前6 個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行任何抗生素、非甾體類(lèi)藥物及免疫抑制劑等藥物治療；種植修復(fù)體行使功能1 年及以上；種植體無(wú)咬合創(chuàng)傷。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 種植體周?chē)?輕柔探診出血和/或探診溢膿，PD ≥6 mm，以及以種植體骨內(nèi)部分冠端為參照，牙槽骨吸收≥3 mm[3-4]。

1.3.2 種植體周?chē)】?種植體周?chē)M織無(wú)炎癥表現(xiàn)，探診無(wú)出血，PD 不隨時(shí)間的增加而增加，早期愈合后骨喪失水平<2 mm[5]。

1.3.3 健康天然牙 牙周組織無(wú)炎癥表現(xiàn)，探診無(wú)出血，無(wú)附著喪失及骨吸收。

1.4 PD 測(cè)量

種植體周探診采用非金屬牙周探針沿種植體長(zhǎng)軸分別在頰（唇），舌面遠(yuǎn)中、正中、近中測(cè)量，每個(gè)種植體記錄6 個(gè)位點(diǎn)的PD，取平均值。天然牙牙周探診用UNC-15牙周探針探測(cè)指數(shù)牙（16、11、26、36、31、46），每個(gè)牙記錄6 個(gè)位點(diǎn)，取平均值。

1.5 齦溝液采集和測(cè)量

每位受試者均備有1 支含1 mL 磷酸緩沖液（PBS）的1.5 mL EP 管及裁去尖端的滅菌吸潮紙尖（20 根/人）[6]。健康天然牙對(duì)照組每人取樣至少6 顆牙（16、11、26、36、31、46），所選牙均無(wú)齲壞及牙髓、根尖病變，無(wú)咬合創(chuàng)傷。種植修復(fù)患者取樣位點(diǎn)為種植體。小心去除待取部位的齦上菌斑、牙石，無(wú)菌干棉球隔濕；用氣槍吹干牙面（10 s）后，將紙尖輕輕插入種植體或天然牙齦溝中，遇輕微阻力即止；30 s 后取出（收集過(guò)程中保證濾紙條不被血液、唾液及膿液污染；如被污染立即棄之不要，間隔20 min 后再取），游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄紙尖浸濕長(zhǎng)度；將取完后的紙尖盡快放入相應(yīng)EP 管封口，-80 ℃凍存[7]。

以移液槍吸取固定量的去離子水（0 ～2.0 μL，間隔0.1 μL），滴在無(wú)菌吸潮紙尖上，共20 組。測(cè)量濾紙浸濕長(zhǎng)度，計(jì)算去離子水量和紙尖浸濕長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算齦溝液體積[8]。

1.6 IL-1β、IL-6 和TNF-α 的檢測(cè)

嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β、IL-6 和TNF-α。所有試劑盒均由上海江萊生物科技有限公司提供。①取出凍存的齦溝液EP 管，室溫下解凍；加入PBS 100μL，低溫離心20 min（2 292×g，4 ℃）后取上清液；在ELISA 反應(yīng)板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔，每孔加入50 μL 標(biāo)準(zhǔn)品（IL-1β 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、20、40、80、160、320 pg/mL； IL-6 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為0、10、20、40、80、160 pg/mL； TNF-α 標(biāo) 準(zhǔn) 品 質(zhì) 量 濃 度 為0、40、80、160、320、640 pg/mL）。②分別設(shè)空白孔和待測(cè)樣品孔，在樣品孔中先加40 μL 樣品稀釋液，再加10 μL 待測(cè)樣品，輕輕晃動(dòng)搖勻。③每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外；封板膜封板，37 ℃避光孵育60 min。④棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復(fù)5 次，拍干。⑤每孔先后加入50 μL 顯色劑A 液和50 μL 顯色劑B 液，37 ℃避光孵育15 min。⑥每孔加入終止液50 μL 終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色變?yōu)辄S色。⑦以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度[D （450 nm） ]。⑧以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)D （450 nm）值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和稀釋倍數(shù)計(jì)算各組樣本的濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本資料的比較

3 組受試者的年齡、性別構(gòu)成比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。種植體周?chē)捉M的PD 明顯高于種植體周?chē)】到M和健康天然牙對(duì)照組（均P<0.01）；而種植體周?chē)】到M與健康天然牙對(duì)照組的PD 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

種植體周?chē)】到M和健康天然牙組的齦溝液量均顯著低于種植體周?chē)捉M（均P<0.01）；種植體周?chē)】到M的齦溝 液量高于健康天然牙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 3 組受試者的基本資料比較（n=12）Tab 1 Characteristics of basic data of the three groups (n=12)

2.2 各組齦溝液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量比較

種植體周?chē)捉M的IL-1β 和IL-6 含量均明顯高于種植體周?chē)】到M和健康天然牙對(duì)照組（均P<0.05），種植體周?chē)】到M的IL-1β 和IL-6 含量均顯著高于健康天然牙對(duì)照組（均P<0.05）。種植體周?chē)捉M的TNF-α 表達(dá)水平與種植體周?chē)】到M比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；種植體周?chē)】到M的TNF-α 含量高于健康天然牙組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；種植體周?chē)捉M的TNF-α含量顯著高于健康天然牙對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 各組齦溝液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量比較（±s，n=12）Tab 2 Comparison of IL-1β, IL-6 and TNF-α levels in gingival crevicular fluid among different groups (±s, n=12)

表2 各組齦溝液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量比較（±s，n=12）Tab 2 Comparison of IL-1β, IL-6 and TNF-α levels in gingival crevicular fluid among different groups (±s, n=12)

Note: ①P=0.012, ②P=0.000, compared with peri-implantitis group; ③P=0.003, ④P=0.033, ⑤P=0.014, compared with peri-implant health group.

Group IL-1β/pg·mL-1 IL-6/pg·mL-1 TNF-α/pg· mL-1 Peri-implantitis group 249.04±40.10 111.93±36.91 176.36±48.84 Peri-implant health group 217.05±33.74① 71.05±20.84② 143.74±52.43 Healthy control group 179.77±22.19②③ 48.09±18.84②④ 126.05±63.38⑤F value 16.354 22.364 3.381 P value 0.000 0.000 0.043

2.3 齦溝液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達(dá)與齦溝液量和PD 的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示（表3），種植體周?chē)捉M齦溝液中TNF-α 表達(dá)水平與PD 呈正相關(guān)（r=0.600， P=0.039）。

表3 種植體周?chē)捉M齦溝液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)與齦溝液量、PD 之間的相關(guān)性Tab 3 Correlation of IL-1β, IL-6 and TNF-α with gingival crevicular fluid volume and PD in peri-implantitis group

2.4 各組齦溝液量與PD 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各組齦溝液量與PD 呈正相關(guān)（r=0.819，P=0.000）。

3 討論

種植體周?chē)资前l(fā)生在種植體周?chē)M織的病理性狀態(tài)，以種植體周?chē)つぱ装Y及支持骨組織進(jìn)行性吸收為特征[4]。大多數(shù)回顧性研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同牙周炎一樣，黏膜下菌斑的持續(xù)形成會(huì)導(dǎo)致種植體周?chē)鷩?yán)重的炎癥和組織破壞[9-10]。宿主的免疫系統(tǒng)和致病菌在相互作用中會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，這類(lèi)細(xì)胞因子具有一定的免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能，但其在種植體周?chē)字械淖饔蒙胁幻鞔_。因此，細(xì)胞因子在種植體周?chē)椎陌l(fā)生、發(fā)展中的作用已受到口腔種植領(lǐng)域的重視。

目前，系統(tǒng)性回顧研究主要集中在種植體周?chē)l溝液檢測(cè)到的各類(lèi)細(xì)胞因子（如促炎、抗炎和破骨細(xì)胞生成相關(guān)因子）與趨化因子之間的關(guān)系[11]。IL-1β 是與種植體周?chē)钻P(guān)系密切的重要炎癥因子，可以抑制堿性磷酸酶的表達(dá)，抑制組織形成，激活破骨細(xì)胞，刺激破骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2并導(dǎo)致牙槽骨喪失[12]。另外，IL-1β 還可以與其他炎癥介質(zhì)相互作用，如促進(jìn)IL-6、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子等細(xì)胞因子的表達(dá)，將炎癥效應(yīng)級(jí)聯(lián)擴(kuò)散，放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷加重。有研究[13]顯示，種植體周?chē)孜稽c(diǎn)的IL-1β 表達(dá)水平較健康的種植位點(diǎn)顯著增高，但種植體周?chē)捉M與種植體周?chē)つぱ捉MIL-1β 表達(dá)水平無(wú)顯著差異。Schierano 等[14]研究表明，IL-1β 水平與種植體周?chē)M織的炎癥程度具有相關(guān)性；Sakai 等[15]發(fā)現(xiàn)IL-1β濃度與種植體周?chē)墙M織的吸收有相關(guān)性，可作為檢測(cè)種植體周?chē)走吘壒俏盏拿舾兄笜?biāo)。本研究結(jié)果顯示種植體周?chē)孜稽c(diǎn)的IL-1β 表達(dá)水平顯著高于健康的種植位點(diǎn)和健康天然牙位點(diǎn)，且健康種植位點(diǎn)的IL-1β 也高于健康天然牙位點(diǎn)。該結(jié)果提示促炎癥細(xì)胞因子IL-1β 參與了種植體周?chē)装Y的發(fā)生、發(fā)展，可用于區(qū)別種植體周?chē)】岛脱装Y狀態(tài)[4]。

TNF-α 也是種植體周?chē)籽芯康牧硪粋€(gè)關(guān)注焦點(diǎn)。種植體周?chē)滓粋€(gè)重要病理特征為炎癥性骨吸收，主要與局部破骨細(xì)胞骨吸收功能亢進(jìn)有關(guān)。目前認(rèn)為T(mén)NF-α 介導(dǎo)骨吸收主要通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和抑制成骨細(xì)胞分化進(jìn)行[16]。有研究[17-18]表明，種植體周?chē)孜稽c(diǎn)的TNF-α 水平較健康位點(diǎn)顯著增高，這與本研究結(jié)果相似。TNF-α 含量與PD 呈正相關(guān)，PD 的增加提示種植體和周?chē)M織的結(jié)合遭到了破壞，種植體周?chē)装Y程度的加重，說(shuō)明TNF-α表達(dá)水平與種植體炎癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可間接反映種植體周?chē)M織健康狀況。系統(tǒng)性研究[19]也提示，TNF-α可作為輔助標(biāo)準(zhǔn)幫助判斷種植體周?chē)装Y。另外，本研究中，種植體周?chē)孜稽c(diǎn)和健康種植體位點(diǎn)的TNF-α 水平無(wú)顯著差異。TNF-α 能促進(jìn)破骨細(xì)胞合成和減少骨基質(zhì)鈣化，促進(jìn)骨質(zhì)吸收，因此推測(cè)TNF-α 可能參與了種植體骨組織的改建。

與牙周炎相似，種植體周?chē)稽c(diǎn)的病變也以漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主；但多形核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的比例較牙周炎組織更高，且漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞面積更廣、數(shù)量更多、密度更高[18]。IL-6 主要由單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在IL-1 和TNF-α 誘導(dǎo)下產(chǎn)生，可通過(guò)自分泌或旁分泌的方式在免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要的作用，被認(rèn)為是IL-1 和TNF-α 某些生物效應(yīng)的放大因子[20]。有研究表明，IL-6 的表達(dá)水平與種植體周?chē)谆顒?dòng)期呈線(xiàn)性相關(guān)，且其水平隨著病情加重而不斷升高，其可上調(diào)破骨細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-3 的表達(dá)水平，促進(jìn)牙槽骨吸收[21]。在犬種植體周?chē)l溝液中，IL-6 及TNF-α等炎癥細(xì)胞因子參與了炎癥過(guò)程，且與骨破壞相關(guān)，與天然牙周炎相似[22]。本研究結(jié)果顯示，種植體周?chē)装Y組齦溝液中的IL-6 水平與種植體周?chē)】到M和健康天然牙對(duì)照組比較，顯著升高，提示IL-6 參與了種植體周?chē)椎陌l(fā)生、發(fā)展，能夠較好反映種植體周?chē)M織的炎癥狀態(tài)；推測(cè)其可能通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞的作用，在種植體周?chē)俏掌茐姆矫姘l(fā)揮了較大的作用。

PD 可以在一定程度上反映種植體健康狀況。雖然目前無(wú)法確定與健康種植位點(diǎn)相關(guān)的探診范圍，但由于牙齦腫脹或探查阻力降低，在種植體周?chē)M織炎癥的存在下經(jīng)?？梢杂^(guān)察到PD 的增加[23]。齦溝液是一種來(lái)自牙周組織的炎癥滲出液，牙周組織的變化可通過(guò)齦溝液成分的分析而獲得早期的生物化學(xué)指征。齦溝液的流出量與該位點(diǎn)的炎癥程度呈正比，牙齦健康者只有極少量的齦溝液[24]，這與本研究中齦溝液量與PD 呈正相關(guān)相符。

綜上所述，口腔種植體周?chē)谆颊啐l溝液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 均顯著升高，參與了種植體周?chē)装Y的發(fā)生和發(fā)展，其中TNF-α 與種植體炎癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并可能參與了骨改建過(guò)程。

參·考·文·獻(xiàn)

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