木薯MebZIP7和MebZIP9基因的克隆及其轉(zhuǎn)錄活性分析

孟宇紅 陳 新 馬平安 宋 羽 張圣奎 王文泉*

(1.海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?571101；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物品種資源研究所, 烏魯木齊 830091)

木薯(ManihotesculentaCrantz)起源于中南美洲亞馬遜熱帶雨林地區(qū)，分屬大戟科(Euphorbiaceae)木薯屬(ManihotP. Mill.)多年生植物[1]。木薯、馬鈴薯和甘薯并稱(chēng)世界三大薯類(lèi)作物，所產(chǎn)淀粉廣泛用于食品和工業(yè)原料，是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物[2]。木薯野生祖先種與栽培種的全基因組分析顯示：木薯栽培種的淀粉合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)[3]，而木薯塊根淀粉積累是一個(gè)復(fù)雜的生理代謝過(guò)程，會(huì)受到內(nèi)源激素的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)脫落酸(ABA)對(duì)木薯塊根淀粉積累起促進(jìn)作用[4]。其他植物，如小麥內(nèi)源激素ABA通過(guò)調(diào)節(jié)籽粒中蔗糖-淀粉代謝的關(guān)鍵酶活性，促進(jìn)籽粒灌漿[5]，外源ABA處理水稻種子后籽粒千粒重增加，產(chǎn)量增加[6]。

堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)是家族成員眾多的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。bZIP轉(zhuǎn)錄因子有高度保守的bZIP區(qū)，由一個(gè)堿性區(qū)和一個(gè)亮氨酸拉鏈組成[7]。依據(jù)bZIP相似的堿性區(qū)和附加的保守序列將模式植物擬南芥的bZIP基因劃分為10個(gè)亞族，分別為A-I和S亞族，其中 A亞族與ABA相關(guān)，屬于脫落酸響應(yīng)元件結(jié)合因子(ABF)[8]。ABF可以反式激活在啟動(dòng)子區(qū)含有脫落酸響應(yīng)元件(ABA response element，ABRE)的效應(yīng)基因，它的表達(dá)受ABA和各種脅迫誘導(dǎo)[9]。ABF參與ABA信號(hào)通路，ABA結(jié)合PYL后破壞了SnRK2蛋白激酶和PP2C的相互作用，進(jìn)而激活SnRK2蛋白激酶使ABF磷酸化，從而調(diào)節(jié)響應(yīng)ABA信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)[10-12]。擬南芥ABF2過(guò)表達(dá)植株中SuSy1(Sucrose synthase1)的表達(dá)水平低于野生型，高濃度鹽處理后SuSy1在轉(zhuǎn)基因植株中的轉(zhuǎn)錄水平高[13]。

基因組研究表明木薯堿性亮氨酸拉鏈(MebZIP)同樣是一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族[14]，目前對(duì)其研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究針對(duì)bZIP A亞族基因：MebZIP7和MebZIP9，通過(guò)測(cè)定它們?cè)诘矸鄯e累效率不同木薯野生和栽培品種中的轉(zhuǎn)錄活性，以及在外源ABA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式，分析MebZIP成員是否參與木薯塊根淀粉合成代謝調(diào)節(jié)，旨在為深入研究bZIP在ABA參與木薯塊根淀粉調(diào)控中的作用提供一些試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用栽培木薯KU50、SC8、Arg7和野生亞種W14(Manihotesculenta.ssp.flabellifolia)，3個(gè) 栽培種的塊根淀粉含量高于野生型。KU50和W14用于木薯全基因組測(cè)序。SC8是中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的代表性品種，用于ABA處理的組培苗。種植在海南澄邁試驗(yàn)基地，在種植后90(塊根形成期)、180(塊根膨大期)和210 d(塊根成熟期)分別取塊根及功能葉用于分析。

選擇苗齡45 d，長(zhǎng)勢(shì)均一的SC8組培苗進(jìn)行ABA處理。每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入1.0 mL 100 μmol/L的ABA溶液，使其均勻覆蓋于培養(yǎng)基表面。分別處理1、6、12和24 h，取處理后的葉片和塊根做后續(xù)試驗(yàn)。每個(gè)處理3次重復(fù)和1個(gè)對(duì)照(未經(jīng)ABA處理)。3個(gè)重復(fù)的混合樣放入液氮中速凍，-80 ℃保存待用。

1.2 10個(gè)MebZIP基因的確定及實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

在轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中搜索到104個(gè)木薯的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已有的木薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[3]，挑選栽培型與野生型塊根中相對(duì)表達(dá)量比值≥2的MebZIP基因，初步篩選到10個(gè)MebZIP基因(表1)。將初步篩選到的10個(gè)MebZIP基因，根據(jù)基因ID號(hào)依次命名為MebZIP1～MebZIP10。

取木薯栽培種KU50、Arg7、SC8和野生型W14的塊根及功能葉，利用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測(cè)10個(gè)MebZIP在不同品種和不同組織部位的差異表達(dá)。用Primer- BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)定量引物并檢測(cè)引物的特異性，qPCR引物序列見(jiàn)表2。使用木薯Manes.02G137500作為內(nèi)參基因[14]。用Mx3000P QPCR儀，大連寶生物公司的PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑進(jìn)行試驗(yàn)。qPCR程序： 95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，并用2-ΔΔct法整理分析數(shù)據(jù)[15]。

表1 10個(gè) MebZIP在栽培種KU50和野生型W14塊根中的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量及比值Table 1 The transcription and ratio of ten MebZIP in the cultivated species KU50 and wild-type W14

表2 10個(gè)MebZIP基因?qū)崟r(shí)定量分析所用引物序列Table 2 Primer sequences of ten MebZIP genes for qPCR

1.3 植物總RNA提取及單鏈cDNA的合成

使用RNA plant Plus Reagent植物總RNA提取試劑，購(gòu)于天根(北京)公司。進(jìn)行木薯總RNA的提取。RNA質(zhì)量及濃度通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。使用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于寶生物(大連)公司合成單鏈cDNA，并用木薯通用Actin引物檢測(cè)第一鏈cDNA。RNA保存于-80 ℃，cDNA保存于-20 ℃。

1.4 10個(gè)木薯MebZIP與127個(gè)擬南芥AtbZIP氨基酸序列比對(duì)

在轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中搜索擬南芥bZIP基因，得到127個(gè)bZIP。下載擬南芥所有bZIP基因的氨基酸序列與木薯候選的10個(gè)bZIP基因的氨基酸序列經(jīng)CLUSTAL W進(jìn)行序列比對(duì)，之后使用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建使用NJ(Neighbor-Joining)法，并經(jīng)1 000次Bootstrap統(tǒng)計(jì)檢測(cè)。

1.5 MebZIP7和MebZIP9基因的克隆及MebZIP-GFP載體的構(gòu)建

從木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov)中搜索目的基因序列(從10個(gè)MebZIP中選擇2個(gè)MebZIP)，并用Primer-BLAST設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，引物序列信息：MebZIP7上游引物(5′TGTTCATGGTTGTTAGGAATTGGT 3′)和下游引物(5′TCCTTGCACCACACAAATGG 3′)；MebZIP9上游引物(5′AAGAAACTGAACA-GGAACGTCTG 3′)和下游引物(5′CTTCCCTT-CCACTGCTATACCT 3′)。用大連寶生物公司的Primer STARMax DNA Polymerase，以KU50塊根cDNA為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增。PCR程序：98 ℃預(yù)變性5 s，98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 s，用MEGA5.0進(jìn)行測(cè)序后序列比對(duì)。

MebZIP基因插入pCAMBIA1302載體中，所用引物見(jiàn)表3。通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MebZIP-GFP的融合蛋白亞細(xì)胞定位。

表3 構(gòu)建MebZIP-GFP載體所用引物Table 3 Primer sequences for constructing MebZIP-GFP plasmid

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯MebZIPs在木薯栽培種和野生型中具有不同的表達(dá)譜

熒光定量表達(dá)分析結(jié)果，MebZIP1～MebZIP10在栽培品種KU50塊根中的相對(duì)表達(dá)量均高于野生亞種W14，表達(dá)量比值在1.4～185.0倍，其中MebZIP9最高，MebZIP1最低，MebZIP7達(dá)到2.3倍，6個(gè)成員如MebZIP2、MebZIP3、MebZIP4、MebZIP7、MebZIP8和MebZIP9表達(dá)差異達(dá)到顯著和極顯著水平(圖1(a))。 而在功能葉中，MebZIP4、MebZIP9和MebZIP10在栽培品種的相對(duì)表達(dá)量高于野生型，相差倍數(shù)>2(圖1(b))。特別是MebZIP9在塊根和功能葉中的相對(duì)表達(dá)量栽培品種均顯著高于野生型，倍數(shù)在39～185。表明塊根淀粉積累效率高的栽培品種塊根中存在MebZIP成員的優(yōu)勢(shì)表達(dá)，且在功能葉中也有少數(shù)成員高表達(dá)。

2.2 系統(tǒng)分類(lèi)表明MebZIP7和MebZIP9與ABA信號(hào)通路相關(guān)

從轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中搜索到擬南芥bZIP 127個(gè)，10個(gè)MebZIP與AtbZIP的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族總共劃分為10個(gè)亞族，分別為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S亞族，而木薯MebZIP5、MebZIP7和MebZIP9屬于bZIP家族的A亞族，MebZIP2、MebZIP3和MebZIP10屬于S亞族，MebZIP1和MebZIP4屬于G亞族，MebZIP8屬于C亞族，MebZIP6屬于B亞族(圖2)。A亞族在 ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，C亞族可能調(diào)控貯藏蛋白在擬南芥胚乳里的表達(dá)，G亞族在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和種子成熟過(guò)程中起作用，S亞族在蔗糖信號(hào)以及響應(yīng)脅迫中起作用等。系統(tǒng)分類(lèi)結(jié)果證明，MebZIP7和MebZIP9屬于A亞族，歸于ABF類(lèi)，是ABA信號(hào)通路成員。

2.3 MebZIP7和MebZIP9定位于細(xì)胞核內(nèi)

激光共聚焦顯微鏡下觀察DAPI染色后的洋蔥表皮細(xì)胞，MebZIP7-GFP和MebZIP9-GFP表達(dá)的蛋白均定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無(wú)綠色熒光，而對(duì)照試驗(yàn)CaMV35s::GFP在整個(gè)洋蔥表皮細(xì)胞都有GFP分布(圖3)。據(jù)此，可以確定MebZIP7和MebZIP9均具有細(xì)胞核定位特征。bZIP是一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄因子家族，該試驗(yàn)證明木薯中這2個(gè)成員屬于轉(zhuǎn)錄因子功能蛋白。

KU50，SC8和Arg7是栽培木薯；W14是野生木薯。KU50，SC8 and Arg7 are cultivated cassava. W14 is wild cassava.同組柱形圖不同小寫(xiě)字母表示品種間表達(dá)差異顯著(P<0.05)Different letters above the column indicate significant differences in expression between the two varieties of cassava.圖1 10個(gè)MebZIP基因在栽培和野生型塊根(a)與葉片(b)中的表達(dá)差異Fig.1 Tissue-specific expression of ten MebZIP genes in root (a) and leaves (b) of cultivated and wild species

圖2 構(gòu)建10個(gè)MebZIP系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Constructing phylogenetic tree of ten MebZIPs

綠色，GFP是綠色熒光蛋白，激光共聚焦顯微鏡下發(fā)出綠色熒光；藍(lán)色，DAPI染液染色，激光共聚焦顯微鏡下發(fā)出藍(lán)色熒光。標(biāo)尺：20 μmGreen，GFP are green fluorescent proteins,which emit green fluorescence under laser confocal microscopy; Blue，DAPI dye staining and emits blue fluorescence under laser confocal microscopy. Bar: 20 μm圖3 MebZIP7和MebZIP9在洋蔥表面亞細(xì)胞定位Fig.3 MebZIP7 and MebZIP9 locate in the nucleus of onion surface cell

2.4 MebZIP7和MebZIP9受外源ABA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)

ABA處理木薯后1 h，MebZIP7被強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)且相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，此時(shí)根中和葉片的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照的10.7和4.5倍；MebZIP7的相對(duì)表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加而逐漸降低，24 h時(shí)與初始水平一致(圖4)。MebZIP9同樣被ABA誘導(dǎo)上調(diào)，1 h根中的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，是對(duì)照的6.3倍；在葉片中的相對(duì)表達(dá)量在6 h達(dá)到最高，是對(duì)照的4.5倍；MebZIP9在ABA處理下的相對(duì)表達(dá)量先升高后下降，24 h根中的相對(duì)表達(dá)量低于初始水平(圖5)。盡管在幼苗培養(yǎng)條件下與自然生長(zhǎng)發(fā)育條件有很大差異，仍然可以捕捉到木薯根和葉片中MebZIP7和MebZIP9受到外源ABA信號(hào)誘導(dǎo)而增強(qiáng)表達(dá)，說(shuō)明2個(gè)bZIP成員確實(shí)參與ABA信號(hào)途徑。

1L和1R：葉片，塊根ABA處理1 h；6L和6R: 葉片，塊根ABA處理6 h；12L和12R：葉片，塊根ABA處理12 h；24和24R：葉片，塊根ABA處理24 h。下同。1L and 1R, leaf and root are treated by ABA for 1 h; 6L and 6R, leaf and root are treated by ABA for 6 h; 12L and 12R，leaf and root are treated by ABA for 12 h; 24L and 24R, leaf and root are treated by ABA for 24 h. The same below. 圖4 MebZIP7受ABA誘導(dǎo)在葉片(a)和塊根(b)中的表達(dá)分析Fig.4 The expression profiles of MebZIP7 induced by ABA in leaf (a) and storage root (b)

圖5 MebZIP9受ABA誘導(dǎo)在葉片(a)和塊根(b)中的表達(dá)分析Fig.5 Expression profiles of MebZIP9 induced by ABA in leaf (a) and storage root (b)

2.5 MebZIP9在栽培木薯中的轉(zhuǎn)錄活性高于野生型

對(duì)于另一個(gè)基因MebZIP7在栽培品種和野生型不同發(fā)育時(shí)期塊根及葉片中均有表達(dá)，表達(dá)差異不能夠明確區(qū)別。如在塊根發(fā)育90 d，180 d時(shí)KU50、SC8和Arg7中表達(dá)量高于W14，而在210 d時(shí)差異不明顯；葉片中，90 d時(shí)W14的表達(dá)量高于幾個(gè)栽培品種，其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量差異不顯著(圖6)。MebZIP9在栽培與野生型的塊根和葉片中表現(xiàn)出完全不同的表達(dá)模式。在野生型W14整個(gè)生長(zhǎng)期的塊根和葉片中相對(duì)表達(dá)量均很低，而在不同木薯栽培品種不同發(fā)育時(shí)期的塊根和葉片中均保持較高表達(dá)量，塊根中表達(dá)量更高一些。其表達(dá)量總體有前期高后期下降的趨勢(shì)，如在KU50塊根形成期相對(duì)表達(dá)量最高，在塊根膨大期和塊根成熟期的相對(duì)表達(dá)量相同，最高值與最低值相差2倍；在SC8塊根形成期和塊根膨大期的表達(dá)量相近，是塊根成熟期的1.4倍；在Arg7 塊根膨大期相對(duì)表達(dá)量高，是塊根形成期和成熟期的3.6倍(圖7)。此外，MebZIP7比MebZIP9在塊根和葉片發(fā)育不同時(shí)期整體表達(dá)量更高。

同組不同小寫(xiě)字母表示表達(dá)量差異顯著(P<0.05)系指每組材料間表達(dá)差異顯著性。下同。The marked in the figure refers to the significance of difference in expression quantity between each group of materials. The same below.圖6 MebZIP7在木薯栽培型及野生型葉片(a)和塊根(b)中的差異表達(dá)Fig.6 Spatio-temporal expression profiles of MebZIP7 in leaf (a) and root (b) of four cassava varieties

圖7 MebZIP9在木薯栽培品型及野生型葉片(a)和塊根(b)中的差異表達(dá)Fig.7 Spatio-temporal expression profiles of MebZIP9 in leaf (a) and root (b) of four cassava varieties

3 討 論

3.1 木薯bZIP成員在塊根中有優(yōu)勢(shì)表達(dá)，可能與其淀粉積累效率有關(guān)

MebZIP9在栽培木薯塊根中的轉(zhuǎn)錄活性顯著高于野生型，MebZIP9在同一木薯同時(shí)期塊根和葉片中的表達(dá)水平低于MebZIP7。

MebZIP7在栽培種塊根形成期(90 d)和塊根膨大期(180 d)塊根中的相對(duì)表達(dá)量都顯著地高于野生型，MebZIP9在栽培種整個(gè)生長(zhǎng)期塊根中的相對(duì)表達(dá)量都顯著的高于野生型，特別是MebZIP9在W14塊根中幾乎不表達(dá)。栽培木薯淀粉含量顯著高于野生型[3]，木薯栽培品種淀粉含量(干重)為28%～32%，野生型W14淀粉含量是3%～5%。綜上所述，推測(cè)MebZIP7和MebZIP9可能參與木薯塊根淀粉合成?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)：bZIP可以調(diào)節(jié)淀粉合成，例如，水稻C亞族的OsbZIP58在胚乳中高表達(dá)，其蛋白可直接與6個(gè)淀粉合成相關(guān)基因(OsAGPL3,Wx,OsSSIIa,SBE1,OsBEIIb和ISA2)的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并調(diào)控它們的表達(dá)活性，是水稻籽粒中淀粉合成的重要調(diào)節(jié)因子[16]。玉米I亞族的ZmbZIP91可與玉米淀粉合成相關(guān)基因啟動(dòng)子的ACTCAT元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)玉米淀粉相關(guān)基因的表達(dá)[17]。據(jù)此推測(cè)MebZIP可能調(diào)節(jié)木薯塊根淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)或淀粉合成酶的活性。

3.2 木薯bZIP成員受外源ABA誘導(dǎo)表達(dá)

高濃度的ABA抑制水稻籽粒灌漿期淀粉合成基因的表達(dá)和淀粉合成酶的酶活，導(dǎo)致籽粒充實(shí)率降低[18]，而適中濃度ABA能增強(qiáng)水稻籽粒灌漿期SuSy的活性[19]。擬南芥葉片中β-淀粉酶1(BAM1)和α-淀粉酶3(AMY3)受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，導(dǎo)致BAM1酶活提高，葉片淀粉含量降低[20]。MebZIP7和MebZIP9受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，原因可能是：一方面，MebZIP7、MebZIP9是ABF(ABRE)，ABF是ABA信號(hào)通路中的成員[21- 22]，ABA結(jié)合PYL后破壞了SnRK2蛋白激酶和PP2C的相互作用，進(jìn)而激活SnRK2蛋白激酶使ABF磷酸化，即ABF (MebZIP7和MebZIP9)表達(dá)量增加，從而調(diào)節(jié)響應(yīng)ABA信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)。另一方面相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]bZIP響應(yīng)各種非生物脅迫，植物做出一系列抵抗外源ABA脅迫的機(jī)制，響應(yīng)ABA的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，因而與其上游啟動(dòng)子結(jié)合的MebZIP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量增高。綜上推測(cè)栽培木薯中MebZIP受適量ABA誘導(dǎo)高表達(dá)并與淀粉合成相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)塊根淀粉合成。

此外，轉(zhuǎn)錄因子在植物里的表達(dá)水平很低[23]，本研究選用管家基因Manes.02G061900[14],其在木薯各組織部位及脅迫處理后的表達(dá)水平都很穩(wěn)定，而且比常用的木薯Actin基因Manes.12G150500低1.3倍，使用Manes.02G061900做內(nèi)參基因，便于對(duì)表達(dá)量低的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析。MebZIP7和MebZIP9在栽培木薯塊根中的表達(dá)水平顯著高于野生型且受ABA誘導(dǎo)表達(dá)，為后續(xù)分析MebZIP在溝通ABA信號(hào)通路和塊根淀粉合成途徑中的作用提供有效借鑒。