西藏牦牛源腸出血性大腸桿菌毒力基因檢測(cè)與進(jìn)化分析

趙燕娟 王 剛 索朗斯珠

(西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 西藏 林芝 860000)

腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli, EHEC)是重要的食源性致病菌，人和動(dòng)物都可成為其傳染源。腸出血性大腸桿菌不僅能引起嚴(yán)重的胃腸道疾病[1]，感染嚴(yán)重時(shí)還可致命。腸出血性大腸桿菌病自1982年于美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來，先后在英國(guó)、加拿大、瑞典等國(guó)家暴發(fā)和流行。我國(guó)首次于1986年在江蘇省發(fā)現(xiàn)該病，隨后蔓延到中部和東部地區(qū)[2]。腸出血大腸桿菌菌株的毒力特點(diǎn)有以下幾點(diǎn)：一方面是可產(chǎn)生毒力較強(qiáng)的志賀毒素(Vero毒素)；另一方面是產(chǎn)生親和素從而粘附到宿主細(xì)胞上，此外還可產(chǎn)生溶血素[3-5]。腸出血大腸桿菌菌株毒力特點(diǎn)是由多因子決定的，如：志賀毒素由Stx1基因和Stx2基因編碼[5]；eaeA基因編碼的外膜蛋白能產(chǎn)生親和素；ehxA基因編碼的溶血素等同樣也是重要的毒力因素[6]。因此，通過PCR技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行毒力相關(guān)基因的檢測(cè)不僅能作為該病特征性鑒定的一種手段，還可以對(duì)由這些基因編碼導(dǎo)致的潛在致病性作出預(yù)測(cè)。

大腸桿菌O157∶H7是目前最常見的腸出血性大腸桿菌代表菌株[7]。該菌株除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可導(dǎo)致嚴(yán)重的溶血性尿毒癥[2]。此外，還有O5、O26、O91、O111和O113等血清型，這些血清型菌株對(duì)公眾健康造成的危害也不容忽視[3]。目前我國(guó)部分地區(qū)已經(jīng)加強(qiáng)了對(duì)EHEC O157∶H7的監(jiān)測(cè)，但是其他血清型病原菌的分離鑒定及其流行病學(xué)調(diào)查方面的研究還沒有完整系統(tǒng)展開[8]。

已有研究表明EHEC主要的自然宿主是反芻動(dòng)物，因此牛被認(rèn)為是人感染EHEC的主要來源[9]。盡管很多國(guó)家都有關(guān)于EHEC在牛群中流行的報(bào)道[10-11]，然而在牦牛上還未見報(bào)道，本研究前期已做了有關(guān)西藏地區(qū)牦牛大腸桿菌毒力基因的檢測(cè)[12]，本試驗(yàn)擬通過從西藏7個(gè)不同地區(qū)采集的牦牛腹瀉糞便以及腸粘膜中分離腸出血性大腸桿菌菌株，后對(duì)這些分離菌株進(jìn)行腸出血性大腸桿菌的相關(guān)毒力基因檢測(cè)、分型和致病性試驗(yàn)等鑒定，旨在了解在西藏地區(qū)牦牛源腸出血性大腸桿菌的毒力和毒力基因分型情況，以期為研究西藏牦牛腸出血性大腸桿菌病的致病機(jī)理和防控技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌分布及分離培養(yǎng)

本試驗(yàn)牦牛源大腸桿菌菌株分別分離自西藏拉薩、林芝、阿里、那曲、日喀則、山南、昌都等7 市地區(qū)散養(yǎng)牦牛的腹瀉糞便和病死牦牛的腸粘膜。細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)[13-14]。

1.2 生化試驗(yàn)

取本試驗(yàn)分離鑒定后的純培養(yǎng)物分別進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)、 M-R、V-P、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等常規(guī)生化試驗(yàn)，并觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.3 血清型試驗(yàn)

將本試驗(yàn)純培養(yǎng)物分別接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基中，24 h后用0.5%石碳酸生理鹽水清洗，隨后于高壓滅菌鍋中高壓2 h制成抗原。按中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供的血清型鑒定說明書，先后進(jìn)行平板凝集反應(yīng)、試管凝集反應(yīng)，最后鑒定出血清型。

1.4 試劑

Taq DNA聚合酶、PCR試劑、核酸染料Gel View 、克隆載體PMD18-T 購(gòu)自TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans5α由TaKaRa公司制作并保存；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒由美國(guó)OMEGA Bio-tek公司生產(chǎn)；麥康凱培養(yǎng)基、瓊脂糖、LB培養(yǎng)基均由北京陸橋公司生產(chǎn)。

1.5 儀器

高速離心機(jī)centrifuge5804由德國(guó)Eppendorf生產(chǎn)；PCR儀my cycleTM、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均由美國(guó)Bio-Rad生產(chǎn)；移液器由德國(guó)Eppendorf生產(chǎn)；核酸蛋白測(cè)定儀由美國(guó)賽默飛世爾Thermo公司生產(chǎn)。

1.6 引物設(shè)計(jì)

從GenBank中檢索已登錄的腸出血性大腸桿菌毒力基因序列(Stx1、Stx2、eae、ehxA、saa、o157)及16SrRNA基因序列(P)信息，用DNA Star軟件找出保守序列，然后采用Primer 5設(shè)計(jì)引物[15-16](表1)，由上海生物工程有限公司合成。

1.7 PCR檢測(cè)

反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)[17]，反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測(cè)序

將擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行純化，純化后在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定濃度，取膠回收純化的DNA 4.5 μL，PMD18-T載體0.5 μL，Solution 5.0 μL，加水到10.0 μL的體系進(jìn)行，按照試劑盒說明將連接片段轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后挑取單個(gè)菌落接種在保存用平板上，并對(duì)單菌落做PCR檢測(cè)。驗(yàn)證正確的即為陽(yáng)性克隆，挑取驗(yàn)證正確的單菌落接種于LB細(xì)菌瓶中過夜培養(yǎng)，吸取足量陽(yáng)性的克隆菌液送金斯瑞生物公司進(jìn)行測(cè)序[12]。

表1 腸出血性大腸桿菌毒力基因及16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增及測(cè)序所用引物Table 1 Primers used for the EHEC gene and 16S rRNA gene PCR amplification and sequencing

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的地理位置分布與培養(yǎng)結(jié)果

本試驗(yàn)分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形態(tài)為中等大小、表面光滑、邊緣整齊的紅色菌落，在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為深紫黑色、光滑、濕潤(rùn)、帶有金屬光澤的圓形菌落，染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性、短桿狀、兩端略圓[12]。經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定獲得西藏牦牛源大腸桿菌149株，其中，西藏阿里地區(qū)13株、西藏那曲地區(qū)12株、西藏日喀則地區(qū)13株、西藏山南地區(qū)20株、西藏拉薩地區(qū)18株、西藏林芝地區(qū)77株、西藏昌都地區(qū)1株(圖1)。

圖1 149株大腸桿菌的地理位置分布及菌株數(shù)Fig.1 Geographical location distribution of the 149 strains of Escherichia coli

2.2 生化鑒定結(jié)果

149株分離菌經(jīng)15項(xiàng)生化試驗(yàn)，結(jié)果見表2，由表可知本試驗(yàn)分離菌株的生化特性基本保持一致。

表2 生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of biochemical test

2.3 血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

被檢測(cè)的149株大腸桿菌中O98、O8、O178、O104、O26等13 種血清型均有檢出，其中O78、O148、O98、O8、O115和O178 檢出率最高，分別占定型菌株的31.54%、7.38%、2.68%、2.01%、8.05%、 2.68%，共占定型菌株的54.34%，可見優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O148、O98、O8、O115和O178(表3)。

2.4 腸出血性大腸桿菌的毒力分型鑒定

對(duì)149株牦牛源大腸桿菌進(jìn)行6 對(duì)毒力基因檢測(cè)，只有14株檢出ehxA基因，檢出的毒力基因菌株的分布情況為林芝市2株、日喀則市3株、昌都市1株、阿里地區(qū)8株；拉薩市、山南市和那曲地區(qū)未檢出，檢出率為9.40%，部分基因檢測(cè)結(jié)果見圖2。

2.5 16S rRNA基因克隆的鑒定

PCR產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，經(jīng)相應(yīng)的酶切，切出的各基因片段大小與目的基因片段和線性pMD18-T載體大小相符，部分菌株的16SrRNA基因序列陽(yáng)性結(jié)果見圖3。

表3 血清型鑒定結(jié)果Table 3 Results of serotype identification

M，DNA標(biāo)記DL 2 000；1～14 ehxA基因；N，陰性對(duì)照M, DNA Marker DL 2 000; 1～14 ehxA gene; N, negative control圖2 ehxA基因電泳圖Fig.2 Electrophoresis map for PCR products of ehxA gene

M，DNA標(biāo)記DL 2 000；1～6 16S rRNA重組質(zhì)?；騇, DNA Marker DL 2 000; 1～6 16S rRNA recombinant plasmid gene圖3 16S rRNA基因重組質(zhì)粒鑒定的電泳圖Fig.3 Electrophoresis map for PCR products of 16S rRNA gene

2.6 腸出血性大腸桿菌16S rRNA基因序列的同源性分析

對(duì)14株牦牛源大腸桿菌分離株的16SrRNA基因片段進(jìn)行克隆測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1 500 bp，與GenBank中登錄的16SrRNA基因序列大小一致。本次分離的牦牛源大腸桿菌16S rRNA核苷酸組內(nèi)同源性為99%～100%，與GenBank中人源、牛源、禽源、豬源、羊源的部分菌株序列的同源性為99%～100%。采用鄰接法設(shè)置bootstrap值1 000進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹[12]，所有菌株形成2個(gè)主要分支，本次分離的其中13株西藏牦牛源大腸桿菌與人源、牛源、豬源、禽源大腸桿菌形成一個(gè)大的分支；Pch1單獨(dú)聚為1個(gè)分支而且可以看出其與GenBank登錄的J01859.1和M2499.6同源性最近。系統(tǒng)發(fā)育樹圖片見圖4。

2.7 腸出血性大腸桿菌毒力基因的同源性分析

通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)牦牛源腸出血性大腸桿菌菌株內(nèi)同源性達(dá)到99.9%左右，與GenBank中所錄其他菌株的同源性達(dá)到99%。采用鄰接法設(shè)置bootstrap值1 000進(jìn)行構(gòu)建進(jìn)化樹[12,18-19]，并與GenBank已登錄的EHEC基因序列做了同源性比對(duì)并進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分 析，所有菌株形成2個(gè)主要分支，本次分離的149株西藏牦牛源大腸桿菌屬于ehxA類型的達(dá)到14株，與現(xiàn)有的2 893個(gè)ST序列相比，其中D1、D2、D4、D5、Dbo、Dch1、DR6與GenBank登錄的EF204922和AF043471同源性最近，Dguo、D3、D6、DR1、DR2與GenBank登錄的CP024291和km880130.1同源性最近。系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

標(biāo)尺表示遺傳距離，標(biāo)尺上的0.2指每個(gè)位點(diǎn)有0.2個(gè)氨基酸替換。The scale indicates genetic distance. Number 0.2 represents 0.2 aa substitutions per site.圖4 16S rRNA基因序列進(jìn)化樹圖狀Fig.4 Phylogenetic tree graph of 16S rRNA gene sequence

標(biāo)尺表示遺傳距離，標(biāo)尺上的0.5指每個(gè)位點(diǎn)有0.5個(gè)氨基酸替換。The scale indicates genetic distance. Number 0.5 represents 0.5 aa substitutions per site.圖5 EHEC Gene基因序列進(jìn)化樹圖狀Fig.5 Phylogenetic tree graph of EHEC gene sequence

3 討論與結(jié)論

從西藏7個(gè)不同地市分離到的149株菌株，根據(jù)它們的分離培養(yǎng)特性、染色鏡檢特征及生化反應(yīng)特點(diǎn)顯示都符合大腸埃希氏菌的基本特征，再結(jié)合16SrRNA基因序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，也能說明149株菌株符合大腸埃希氏菌的特征，故可判斷其為大腸桿菌。

大腸桿菌有很多種血清型，目前國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的血清型主要是O1、O2、O8、O35、O78、O86等[20-23]。本試驗(yàn)所分離菌株中 O98、O8、O178、O104等13 種血清型均被檢出，其中 O78、O148、O98、O8、O115和 O178 檢出率最高，分別占定型菌株的31.54%、7.38%、 2.68%、2.01%、8.05%、2.68%，共占定型菌株的 54.34%，可見優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O148、O98、O8、O115和O178；O104、O142、O117、O86和O137、O158、O26均有檢出。從中不難看出西藏不同地區(qū)其優(yōu)勢(shì)血清型存在差異，這與其他報(bào)道一致[22]。

利用6 對(duì)腸出血性大腸桿菌毒力基因引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢出ehxA基因，共檢出1株含有ehxA基因的大腸桿菌，其在西藏的分布情況為：ehxA基因林芝市2株、阿里8株、日喀則3株、昌都1株；拉薩、那曲、山南未檢出。因本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物是腸出血性大腸桿菌特異性引物，說明西藏林芝市、阿里地區(qū)、日喀則市、昌都市這4個(gè)地市的牦牛源大腸桿菌中存在EHEC，由于該病危害性較大，有感染養(yǎng)殖人員的可能性[24]，應(yīng)引起當(dāng)?shù)氐年P(guān)注和重視，需制定合理的防控措施進(jìn)行預(yù)防本病的發(fā)生，特別是阿里地區(qū)養(yǎng)殖戶要對(duì)本病做好防范。本團(tuán)隊(duì)也會(huì)密切關(guān)注該病在當(dāng)?shù)氐牧餍星闆r，給予長(zhǎng)時(shí)間的監(jiān)測(cè)，以掌握其流行規(guī)律，為當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

利用MEGA4.0軟件對(duì)14株EHEC進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，本次分離的14株EH.EC中D1、D2、D4、D5、Dbo、Dch1、DR6與GenBank已登錄的腸出血性大腸桿菌菌株EF204922(O98∶H-)和AF043471(O8∶H19)同源性最近，Dguo、D3、D6、DR1、DR2與GeneBank登錄的CP024291(O178∶H19)和km880130.1(O104∶H21)同源性最近。這說明此次分離的菌株大多數(shù)與國(guó)際流行的EHEC血清型O98∶H-、O8∶H19親緣關(guān)系較近。其次是以O(shè)178∶H19、O104∶H21 2種血清型處在另一個(gè)分支上。

大腸桿菌O157∶H7是重要的腸出血性大腸桿菌代表菌株，通過本次血清型結(jié)果可以看出此經(jīng)典血清型菌株在本試驗(yàn)中未曾檢出，說明所分菌株均不是O157∶H7血清型菌株，本次試驗(yàn)中檢出的O98 、O8、O178、O104、O26、O137、O142、O115、O117、O158、O148、O86、O78血清型菌株對(duì)西藏地區(qū)牦牛有一定的致病性，與報(bào)道對(duì)人致病的主要血清型中只有O104存在交叉，說明這種血清型的菌株對(duì)人及牦牛都有致病性，應(yīng)引起重視。目前對(duì)該病的治療尚無有效辦法，最好的防控措施就是加強(qiáng)對(duì)該病的監(jiān)測(cè)，防止宿主的感染[16]。