柿雄花表型及花粉形態(tài)多樣性研究

索玉靜 孫 鵬* 韓衛(wèi)娟 刁松鋒 傅建敏 李芳東

(1. 國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，鄭州 450003；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，鄭州 450003)

柿(DisopyroskakiThunb.)為柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros)植物，原產(chǎn)我國，是一種具有近萬年歷史的傳統(tǒng)木本糧食樹種，由野生馴化為栽培柿也有近2 000多年的歷史[1]。柿果實(shí)汁多味甜，富含多糖、黃酮、酚類及維生素C等多種營養(yǎng)物質(zhì)，深受人們喜愛；柿葉和柿果還富含單寧類物質(zhì)，在食品、保健、化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用潛力[2-4]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，2014年我國柿栽培面積約93.72萬hm2，年產(chǎn)量高達(dá)380.36萬t，均占世界第一。

柿樹單性結(jié)實(shí)力很強(qiáng)，長久以來由于人們對(duì)柿果實(shí)的追求，野生雄株被人為的砍伐或改接，造成了絕大多數(shù)柿品種只開雌花，少量雌雄同株，完全雄性資源罕見的現(xiàn)狀[5-6]。雖然生產(chǎn)上一般無需配置授粉樹，但在種質(zhì)創(chuàng)新和良種培育方面，雄性種質(zhì)作為授粉父本的育種價(jià)值不容忽視[7-8]。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)柿分布區(qū)進(jìn)行了廣泛的野生雄性資源調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在秦淮以南多地發(fā)現(xiàn)野生柿自然居群和柿野生完全雄性種質(zhì)資源。這些新發(fā)現(xiàn)的野生資源、尤其是野生雄性資源的分類學(xué)地位尚不清楚，對(duì)其進(jìn)行表型形態(tài)特征及遺傳多樣性評(píng)價(jià)，是柿雄性種質(zhì)資源高效利用的基礎(chǔ)。王麗媛等[9]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)193份柿雄性種質(zhì)資源及主栽甜澀柿品種和近緣種進(jìn)行了遺傳多樣性分析；而若想對(duì)這類資源進(jìn)行種質(zhì)鑒定及綜合評(píng)價(jià)，還需對(duì)其表型指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，花粉微觀形態(tài)特征在植物種質(zhì)鑒定中被廣泛應(yīng)用[10]，但目前關(guān)于柿雄性種質(zhì)花粉微觀形態(tài)的研究多集中在少數(shù)柿屬植物代表種之間[11-12]，關(guān)于柿種內(nèi)雄性資源間花粉微觀形態(tài)指標(biāo)的差異尚未見報(bào)道。

目前，已頒布的《柿種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[13]和《柿新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南》(2010)兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中均缺乏柿雄性資源表型，尤其是雄花表型特征的相關(guān)描述，為柿雄性種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)和新品種選育造成困難。因此，本研究旨在通過對(duì)柿雄性種質(zhì)資源的雄花表型形態(tài)特征進(jìn)行評(píng)價(jià)，填補(bǔ)目前柿種質(zhì)資源描述標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于雄性資源表型特征描述的空白，以期為后續(xù)柿雄性種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)及新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以柿及其近緣種共計(jì)93份雄性種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，其中來自廣西、湖北、江西、江蘇、湖南、河南、陜西、貴州、臺(tái)灣等省份的柿雄性種質(zhì)資源63份，包括各地野生資源、主栽品種及農(nóng)家品種；此外，還包括日本起源的各類型(甜澀)柿雄性種質(zhì)共計(jì)22份，油柿、浙江柿、美洲柿、君遷子等近緣種共計(jì)8份。江西野柿、江蘇野柿、湖南野柿、湖北羅田野柿和富有F1的種子于2011年收集，2012年播種于原陽試驗(yàn)基地，于2016年花期采集本研究所需雄花，其余試驗(yàn)材料采集于各資源的起源地或西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院國家柿種質(zhì)資源圃，詳見表1。

表1 試驗(yàn)材料類型、來源及采集地Table 1 Material types, origins and collecting zones

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表1(續(xù))

1.2 表型測(cè)定

每份資源選取剛開放的雄花10朵，測(cè)定其花筒直徑、花筒高、雄蕊數(shù)、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬、萼片長、萼片寬、萼片數(shù)量、花托高、花托寬、花柄長和花柄寬等13個(gè)表型指標(biāo)。收集其中33份雄性種質(zhì)資源的花粉，將鮮樣用雙面膠粘在金屬臺(tái)上，經(jīng)HITACHI E-1010型離子濺射儀噴金、鍍膜，置于HITACHI S-3400N型掃描電鏡中觀察和拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS.20.0軟件包(SPSS.inc.，USA)計(jì)算各資源13個(gè)表型指標(biāo)的均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。利用單因素方差分析法，對(duì)不同來源地和不同類型(甜澀)的資源分別進(jìn)行組內(nèi)和組間顯著性差異分析，如果存在顯著性差異，則用Tukey HSD法進(jìn)行多重比較(P<0.05)；利用相同方法對(duì)種間資源表型及33份資源花粉長度、寬度和表面條紋長度進(jìn)行差異顯著性分析。最后利用主成分法和系統(tǒng)聚類法進(jìn)行降維和聚類分析[14]。

2 結(jié)果與分析

將85份柿種內(nèi)雄性資源根據(jù)其來源地及甜澀類型，劃分為10個(gè)類別，即廣西、木蘭山、云架山、江西、江蘇、湖南和羅田等野柿雄株，及常見甜柿、澀柿和‘富有’與‘赤柿’雜交F1代類別。通過對(duì)85份柿種內(nèi)雄性資源及8份柿近緣種雄性資源的13個(gè)雄花表型指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)分析，研究柿屬種間和柿種內(nèi)各類別資源雄花表型指標(biāo)的差異。部分資源雄花表型見圖1。

圖1 部分柿及其近緣種資源的雄花表型圖Fig.1 The male flower phenotype of some persimmon and its related species

2.1 種間資源的雄花表型指標(biāo)比較

對(duì)柿及其近緣種間雄性資源雄花表型指標(biāo)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明：柿與油柿、美洲柿、浙江柿、君遷子等近緣種在雄花最長雄蕊長、萼片長和花柄長等表型指標(biāo)上存在顯著差異；其中，柿的最長雄蕊長顯著高于油柿，萼片長顯著高于浙江柿和君遷子，花柄長均顯著高于4個(gè)近緣種。此外，油柿的萼片寬和花托高均顯著高于美洲柿，而與其他種間的差異未達(dá)到顯著水平(表2)。

2.2 不同來源地和類型內(nèi)部資源間雄花表型指標(biāo)差異顯著性分析

對(duì)10個(gè)類別的柿種內(nèi)雄性資源雄花表型進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)，分析不同來源地和類型內(nèi)部資源間雄花表型指標(biāo)的差異程度。從表3可以看出，廣西各資源間花筒直徑不存在顯著性差異；木蘭山資源間雄蕊寬和萼片數(shù)量不存在顯著性差異；江西野柿資源間花筒高、雄蕊數(shù)、花序柄長、花柄長和不存在顯著性差異；江蘇野柿雄蕊數(shù)不存在顯著性差異；湖南野柿間花筒直徑、雄蕊數(shù)、最長雄蕊長、萼片長、花托高、花序柄長和花柄粗不存在顯著性差異；羅田野柿間花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬不存在顯著性差異；常見甜柿雄株資源間花托寬不存在顯著性差異；常見澀柿雄株資源間雄蕊數(shù)不存在顯著性差異；富有F1資源間雄蕊寬不存在顯著性差異。除此之外，各指標(biāo)間均存在顯著性或極顯著性差異，說明各類型資源內(nèi)部單株間雄花表型存在豐富的變異。

2.3 不同來源地和類型間資源的雄花表型指標(biāo)比較

比較10個(gè)類型間柿雄性種質(zhì)雄花表型之間的差異程度，結(jié)果如表4所示，除雄蕊數(shù)和萼片數(shù)量不存在顯著差異外，其余11個(gè)指標(biāo)在不同來源地和類型間均表現(xiàn)出不同程度的差異，其中以萼片寬、花托高和花托寬變異程度最大。廣西雄性資源的花筒直徑、花筒高、最長和最短雄蕊長值均最小，湖北木蘭山野柿雄株的萼片寬、花托高和花托寬值最??；而江西野柿雄株的最短雄蕊長、萼片長、花托高和花托寬值最大，以及常見甜柿雄性資源的花筒直徑、花筒高、最長雄蕊長、萼片寬和花柄長均值最大。此外，江蘇野柿雄株的雄蕊數(shù)最多，最高達(dá)19枚/朵；羅田野柿雄株的花柄最粗，‘富有’ב赤柿’雜交F1代雄株的雄蕊寬值最大。

2.4 各類型資源雄花表型的主成分分析

對(duì)93份雄性資源雄花的13個(gè)表型指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，前4個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到77.876%，因此選取前4個(gè)主成分作進(jìn)一步分析。如表5所示，成分1主要代表花筒直徑、花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬；且花筒表型與雄蕊指標(biāo)呈正相關(guān)，即花筒越大、雄蕊也越大。成分2主要代表萼片長、萼片寬、花托高、花托寬；萼片與花托表型也呈正相關(guān)。成分3主要代表萼片數(shù)量；成分4主要代表雄蕊數(shù)。分別選取2個(gè)主成分對(duì)93份雄性資源進(jìn)行聚類分析，以判斷各資源雄花表型特征。

表5 旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣Table 5 The component matrix after rotation

以成分1為橫坐標(biāo)，成分2為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)聚類圖，橫坐標(biāo)的值增加代表花筒直徑、花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬增大；縱坐標(biāo)的值增加代表萼片長、萼片寬、花托高和花托寬增大。圖2中各資源被分為5類，第Ⅰ類包括江西野柿雄3和江蘇野柿1-19，具有花筒、雄蕊小，但萼片、花托大的特點(diǎn)；第Ⅱ類包括湖北云架山8、江西野柿雄1、江西野柿雄4、太秋、耀縣五花柿和小八胡等，這些資源的花筒和雄蕊較小，萼片和花托較大；第Ⅲ類包括江蘇野柿2-9和47A(4)(甘秋芽變)，這類資源的花筒、雄蕊大，萼片、花托和花柄也較大；第Ⅳ類包含33份資源，表現(xiàn)出花筒和雄蕊、萼片、花托和花柄都較小的共同特點(diǎn)；第Ⅴ類包含50份資源，這些資源的花筒、雄蕊較大，但萼片、花托較小。

圖中編號(hào)對(duì)應(yīng)資源名稱詳見表1，下同。The number corresponding to the resource in the figure is shown in Table 1. The same below.圖2 93份雄性種質(zhì)資源以成分1和2為坐標(biāo)的散點(diǎn)聚類圖Fig.2 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 1 and 2 as coordinates

以成分1為橫坐標(biāo)，成分4為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)聚類圖，橫坐標(biāo)的值增加代表花筒直徑、花筒高、最短雄蕊長、最長雄蕊長、雄蕊寬增大；縱坐標(biāo)的值增加代表雄蕊數(shù)減少。由圖3可知，93份雄性資源被分為6類，其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類資源的雄蕊數(shù)都較低；第Ⅰ類資源的花筒和雄蕊最小，而第Ⅲ類資源花筒和雄蕊最大；第Ⅳ和Ⅴ類資源的花筒、雄蕊大小分別與第Ⅰ和Ⅱ類資源相似，而雄蕊數(shù)較多；第Ⅵ類資源包括廣西51和油柿，其花筒、雄蕊小于其他資源，但其雄蕊數(shù)最多。

圖3 93份雄性種質(zhì)資源以成分1和4為坐標(biāo)的散點(diǎn)聚類圖Fig.3 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 1 and 4 as coordinates

以成分3為橫坐標(biāo)，成分2為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)聚類圖，橫坐標(biāo)的值增加代表萼片數(shù)量增加；縱坐標(biāo)的值增加代表萼片長和寬、花托高和寬增大。由圖4可知，93份資源被分為4類，其中第Ⅰ類資源包括江西野柿雄3、江蘇野柿1-19、47A(4)(甘秋芽變)和耀縣五花柿，這些資源萼片數(shù)量較少，但萼片長和寬、花托高和寬最大；第Ⅱ類資源包括86份，都表現(xiàn)出萼片數(shù)較少，萼片長和寬、花托高和寬也較小的特點(diǎn)；第Ⅲ類資源為湖北木蘭山24，其萼片數(shù)量偶有5瓣，萼片長和寬、花托高和寬都很??；第Ⅳ類資源包括廣西51和廣西2，其萼片數(shù)量偶有5瓣或6瓣。

圖4 93份雄性種質(zhì)資源以成分3和2為坐標(biāo)的散點(diǎn)聚類圖Fig.4 Scatter plot of 93 male germplasm resources with components 3 and 2 as coordinates

2.5 花粉表型變異

對(duì)29份柿種內(nèi)雄性資源及其4個(gè)近緣種的花粉進(jìn)行電鏡觀察，觀察各雄性種質(zhì)花粉形態(tài)、粒表面紋飾及萌發(fā)溝(圖5)，并測(cè)量花粉長、寬及其表面條紋長度。結(jié)果表明，5個(gè)種間資源的花粉長和寬均存在極顯著性差異(P<0.01)，表面條紋長存在顯著性差異(P<0.05)。由表6可知，美洲柿花粉最大，其次為柿，兩者的花粉長和花粉寬顯著高于君遷子、浙江柿和油柿，而后三者之間差異不顯著。此外，油柿的花粉表面條狀紋飾最長，浙江柿最短。

圖5 部分柿及其近緣種花粉電鏡觀察圖Fig.5 Electron microscopic observation of the pollen of some persimmon and its related species

表6 柿及其近緣種間花粉形態(tài)指標(biāo)比較Table 6 Comparison of pollen morphology between persimmon and its interrelated species μm

柿種內(nèi)29份資源間花粉長存在顯著性差異(P<0.05)， 云架山5號(hào)和老尖山5號(hào)資源的花粉最長，羅田野柿雄株的花粉最短。花粉寬和表面條紋長在29份資源間均存在極顯著性差異(P<0.01)，Tukey’s多重比較發(fā)現(xiàn)木蘭山43花粉顯著寬于木蘭山11、耀縣五花柿和青化雄株；木蘭山1號(hào)和江蘇野柿2號(hào)的花粉表面紋最長，華柿1-1最短，變異系數(shù)為28.93%，說明花粉表面條紋長度在29份柿雄性資源間存在豐富的變異(表7)。此外，對(duì)花粉長、寬和表面條紋長進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果表明花粉長和花粉寬之間的相關(guān)系數(shù)為0.767，呈極顯著性正相關(guān)(P<0.01)。

表7 柿種內(nèi)29份雄性資源花粉形態(tài)指標(biāo)比較Table 7 Comparison of pollen morphology between 29 male resources in persimmon μm

表7(續(xù))

此外，經(jīng)掃描電鏡顯微觀察，柿及其近緣種的花粉表面結(jié)構(gòu)均呈線性條紋狀，除條紋的長短在各資源間存在顯著性差異外，各資源花粉表面條紋的深淺和交錯(cuò)程度也存在差異。條紋較淺的資源有11份，包括木蘭山16號(hào)、木蘭山44號(hào)、江蘇野柿1號(hào)、正月、平頂山澀柿、什樣柿、興義水柿、青化雄株、君遷子、浙江柿和油柿，剩余22份資源花粉表面條紋較深。條紋交錯(cuò)程度低、方向較為一致的資源有6份，即木蘭山1號(hào)、木蘭山7號(hào)、木蘭山16號(hào)、木蘭山44號(hào)、江蘇野柿1號(hào)和正月；剩余27份資源花粉表面條紋縱橫交錯(cuò)程度較高。此外，柿及其近緣種的花粉萌發(fā)溝內(nèi)呈現(xiàn)出顆粒狀凸起，各凸起的直徑為0.3～0.6 μm。

3 討 論

3.1 柿及其近緣種間雄花表型及花粉微觀形態(tài)多樣性

本研究對(duì)比了柿與其4個(gè)近緣種間雄性種質(zhì)的雄花表型差異，在13個(gè)表型指標(biāo)中，只有5個(gè)指標(biāo)在種間有顯著差異，說明柿屬植物種間雄性資源表型變異程度較弱。就花粉粒大小而言，美洲柿最大，其次為柿，而君遷子、浙江柿、油柿較?。挥捎诿乐奘僚c柿均為六倍體，而君遷子、浙江柿、油柿為二倍體，所以呈現(xiàn)出花粉體積隨著倍性增加而增加的規(guī)律，這與張永芳[12]的報(bào)道一致。

3.2 柿種內(nèi)雄花表型及花粉微觀形態(tài)多樣性

本研究發(fā)現(xiàn)柿種內(nèi)不同來源地和類型間雄性資源的雄花表型變異程度較強(qiáng)，13個(gè)表型指標(biāo)中，除雄蕊數(shù)和萼片數(shù)量在柿種內(nèi)10個(gè)類別間不存在顯著差異外，其余11個(gè)指標(biāo)均表現(xiàn)出不同程度的差異，其中萼片寬、花托高和花托寬等指標(biāo)的變異程度最大；常見甜柿雄性資源在多個(gè)表型指標(biāo)中均表現(xiàn)出優(yōu)于其他類型資源的特點(diǎn)，這可能與長期的人為選擇有關(guān)。此外，柿種內(nèi)10個(gè)類別內(nèi)部資源雄花表型也存在較強(qiáng)變異，尤其是云架山野生雄性資源，其13個(gè)表型指標(biāo)在不同單株間均存在極顯著差異；木蘭山野生雄性資源除雄蕊寬和萼片數(shù)量外，其余指標(biāo)在不同單株間也均存在極顯著差異，這與王麗媛等[9]發(fā)現(xiàn)的湖北木蘭山和云架山來源的雄性資源遺傳多樣性最高一致。但是，湖南野柿雄性資源在花筒直徑、雄蕊數(shù)、最長雄蕊長、萼片長、花托高和花柄粗等6個(gè)指標(biāo)中無顯著差異，羅田野柿雄性資源也有4個(gè)指標(biāo)無顯著差異，推測(cè)可能與這2個(gè)類別的樣本數(shù)量較少有關(guān)。

3.3 柿雄性種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)與鑒定

對(duì)于收集保存的種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)和鑒定，是對(duì)種質(zhì)資源充分利用的基礎(chǔ)。表型是生物遺傳變異的表征，植物居群的表型特征與其生境密切相關(guān)，其多樣性水平是遺傳多樣性與環(huán)境異質(zhì)性的綜合體現(xiàn)，在適應(yīng)和進(jìn)化上具有重要意義[15]。因此，對(duì)植物表型形態(tài)特征進(jìn)行評(píng)價(jià)和鑒定，是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的基本而必要的內(nèi)容。柿作為一種栽培歷史悠久的經(jīng)濟(jì)林樹種，長期以來，人們對(duì)柿果實(shí)的追求嚴(yán)重影響了柿雄性種質(zhì)的生存與利用，從事柿育種的研究者曾認(rèn)為柿嚴(yán)重缺乏雄性資源，故而目前頒布的《柿種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[13]和《柿新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南》(2010)2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中均缺乏關(guān)于柿雄性資源，尤其是雄花表型的相關(guān)描述。本研究對(duì)收集保存的柿及其近緣種雄性種質(zhì)資源雄花表型和遺傳變異進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，填補(bǔ)了2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的空白，為后續(xù)柿雄性種質(zhì)資源的高效利用，以及柿雄性新品種的選育提供了理論依據(jù)。