大豆生育期E1、E2、E3和E4基因的研究與應用

呂世翔 王 萍 孫明明 夏正俊

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院 信息中心，哈爾濱 150086；2.中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/大豆分子設計育種重點實驗室，哈爾濱 150081)

在特定生態(tài)環(huán)境下獲得適應的成熟期是最大限度提高農(nóng)作物產(chǎn)量的潛在前提條件[1]。作為一種典型短日作物，栽培大豆開花和成熟時間是其重要生態(tài)和農(nóng)藝性狀。不同品種的光周期敏感性使其具有不同開花和成熟時間，種植于長日照高緯度地區(qū)的大豆品種需要具有光不敏感性，以保證其在霜凍前成熟。因而大豆光周期敏感性遺傳因素的研究對于大豆育種具有重要意義[2-3]。早在1927年，Owen[4]發(fā)現(xiàn)大豆中存在能夠控制其生育期的遺傳因子。1942年，王金陵[5]的《大豆之光期性》開啟中國大豆光周期研究，拉開對大豆生育期遺傳規(guī)律研究的序幕[6]。蓋鈞鎰等[7]在前人關于中國大豆栽培區(qū)域劃分的基礎上，將中國大豆品種生態(tài)區(qū)劃分為6大區(qū)，并在其中3個區(qū)內(nèi)進一步分亞區(qū)。國內(nèi)外學者相繼對不同生育期大豆品種比對研究，結(jié)果表明大豆生育期由多個基因同時調(diào)控，目前發(fā)現(xiàn)的控制大豆開花和成熟的基因有E1[8]、E2[9]、E3[10]、E4[11]、E5[12]、E6[13]、E7[14]、E8[15]、E9[16]、E10[17]和J[18]基因，其中E1、E3、E4和E7基因是決定光周期敏感性的主要基因[19]。隨著分子遺傳學和分子生物學的發(fā)展，E1[20]、E2[21]、E3[22]、E4[23]、E9[16]、E10[17]和J[24]已經(jīng)被定位或克隆。其中，E1～E4基因是研究最為深入、應用最為廣泛的大豆生育期基因，研究表明E1～E4基因與大豆品種的生態(tài)類型密切相關，對大豆開花期變異貢獻率高達62%～66%[23]。分子水平的研究顯示E1～E4基因分別位于大豆基因組C2、O、L和I連鎖群上[20-23]。

大豆生育期基因E1是對大豆開花期及成熟期影響最大的E系列基因，主要功能是抑制開花和延長生育期。E1基因是豆科作物特有的轉(zhuǎn)錄因子，在四季豆(Phaseolusvulgaris)及百脈根(Lotusjaponicus)等豆科作物中存在同源性高的基因序列，在水稻與擬南芥中沒有相應同源序列[20, 25]。Zhang等[26]研究菜豆中E1同源基因Phvul.009G204600(PvE1L)和苜蓿中E1同源基因Medtr2g058520(MtE1L)，證明PvE1L基因能夠延遲大豆開花時間，而MtE1L基因?qū)Υ蠖沟拈_花時間沒有影響，但MtE1L基因能夠促進苜蓿開花。推測豆科作物中E1基因家族在開花和植株生長調(diào)控作用中功能的保守性和變異性可能跟系譜和基因組復制有關。E1蛋白是一個具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的轉(zhuǎn)錄因子，N端含一個雙元核定位信號，C端含有與植物轉(zhuǎn)錄因子B3遠緣相近的結(jié)構(gòu)域[20]。E2基因與擬南芥GI(GIGANTEA)基因同源，對開花期的調(diào)控可能不受到光周期影響，而與生物鐘節(jié)律相關，不同環(huán)境條件下E2基因?qū)﹂_花期的作用相對穩(wěn)定[19]。E3和E4基因分別編碼光敏色素A同源基因[22-23,27]，其但對光質(zhì)量的反應既重疊又互不相同[22, 25, 28]。E3基因?qū)赓|(zhì)的差異并不敏感，導致種植在不同光質(zhì)長日照條件下植株的開花期相近[29]，E3與E4基因?qū)1基因的表達有調(diào)控作用[20]。

近年來各國學者廣泛開展E1～E4基因不同變異類型與不同大豆品種生態(tài)適應性關系研究。但是對變異類型的總結(jié)、鑒定和應用前景方面鮮有報道，中國亟待形成適應我國地域特點的基于E1～E4基因變異類型的分子輔助育種模式。本研究就E1～E4基因的不同變異類型、變異類型鑒定方法及各國學者針對世界各地不同大豆品種E1～E4基因開展的相關研究進行綜述，以期為大豆生育期遺傳調(diào)控機理的全面深入研究提供參考，同時為適應不同生態(tài)區(qū)域大豆遺傳育種工作提供依據(jù)，以期促進中國大豆生育期分子育種模式的形成。

1 大豆E1～E4基因的等位變異

1.1 E1基因類型變異

E1基因(Glyma06g23040.1)編碼區(qū)全長864 bp，沒有內(nèi)含子。常見的E1基因變異類型包括e1-fs、e1-nl、e1-as和e1-b3a[20, 30]。e1-fs和e1-nl同為功能喪失型，均表現(xiàn)出極早的開花期和成熟期，e1-fs型實變體DNA序列49 bp處單堿基缺失導致移碼突變；e1-nl為基因整體缺失。e1-as基因型為非同義突變，DNA序列44 bp處出現(xiàn)單堿基突變，使編碼蛋白的定位發(fā)生變化，該基因型為早花型[20]。e1-as型開花及成熟期介于E1與功能喪失型(e1-fs及e1-nl)之間。e1-b3a型334～338 bp存在變異，在444 bp提前終止，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，定位于細胞核，該基因型也為早花型[29]。除此之外，e1-re基因型在e1基因起始位點上游148 bp處有1個3.1 kb 的LINE(long interspersed nuclear element)序列插入，該基因型的品種較基因型背景相近品種提前開花14 d[30]。e1-p基因型在E1基因5′側(cè)翼序列存在差異[30]。

1.2 E2基因變異類型

E2基因(Glyma10g36600)編碼區(qū)全長3 758 bp，包含14個外顯子，編碼1 170個氨基酸的蛋白。目前發(fā)現(xiàn)的E2基因變異類型有e2-ns、e2-in和e2-dl。e2-ns型最常見，編碼區(qū)內(nèi)4個單堿基位點變異致使編碼序列提前終止。e2-ns基因型品種(Harosoy)較e2基因型品種(Clark)開花時間早[21]。e2-in和e2-dl型是E2基因的無義突變，分別為第8個內(nèi)含子處36 bp插入和缺失，5′側(cè)翼序列均存在序列變異[30]。

1.3 E3基因變異類型

E3基因(Glyma19g41210)編碼區(qū)包含4個外顯子，編碼1 130個氨基酸的蛋白質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)的E3基因的變異類型包括E3-Mi、e3-Ha、e3-T(e3-tr)、e3-Mo、e3-ns和e3-fs，其中e3-Mi、E3-Ha和e3-T型較常見。e3-Mi型編碼正常光敏色素A，e3-Mo型第四內(nèi)含子處插入1個2 633 bp反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子且在第三外顯子處堿基序列改變導致編碼蛋白功能減弱，E3-Ha型包含1個與e3-Mo相似的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，但其編碼正常光敏色素A。e3-T型第三外顯子之后出現(xiàn)13.33 kb缺失，使組氨酸結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)部分缺失，導致編碼蛋白沒有功能[22]。e3-ns和e3-fs型是E3基因的無義突變型。e3-ns型第三外顯子單堿突變，e3-fs型第一外顯子單堿基插入導致移碼突變，序列提前終止[31]。

1.4 E4基因變異類型

E4基因(Glyma20g22160)編碼區(qū)包含4個外顯子，編碼1 123個氨基酸的GmPhyA2蛋白質(zhì)序列。目前發(fā)現(xiàn)的E4基因變異類型包括e4-SORE1、e4-kam、e4-kes、e4-oto和e4-tsu。e4(e4-SORE-1)型第一外顯子存在6 238 bp的Ty1/copia-like反轉(zhuǎn)座子插入，插入序列中的終止密碼子使序列提前終止，產(chǎn)生功能缺失的蛋白序列。e4-kam和e4-kes型第二外顯子單堿基缺失和插入導致編碼蛋白的組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域缺失，而保留調(diào)控下游的PAS結(jié)構(gòu)域。e4-oto和e4-tsu型分別為第一和第二外顯子單堿基缺失，導致組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和PAS2結(jié)構(gòu)域均缺失[28, 32]。

2 大豆E1～E4基因變異類型的分子標記鑒定

E1～E4，4個基因等位變異型的分子標記鑒定方法主要包括CAPS、dCAPS、InDel和FLP，根據(jù)其基因序列和長度設計引物，采用合適的限制性內(nèi)切酶對其加以區(qū)分，如表1。

表1 E1～E4基因變異類型的鑒定Table 1 Identification of E1-E4 variation type

表1(續(xù))

3 大豆E1～E4基因功能研究進展

3.1 E1～E4基因調(diào)控大豆開花時間

研究表明，大豆特異的調(diào)控開花的光周期通路PHYA(E3E4)-J-E1-FT，與擬南芥和水稻光周期反應的調(diào)控主通路CO-FT存在明顯差異。E3和E4基因編碼光反應通路必不可少的光敏色素，J基因編碼蛋白能夠結(jié)合在E1基因啟動子上，調(diào)控E1基因的表達，E1基因編碼豆科作物特有的和具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的轉(zhuǎn)錄因子，負向調(diào)控大豆成花基因FT2a和FT5a的表達[20,24]。

E1～E4基因能夠調(diào)控大豆開花時間，有功能E1基因的轉(zhuǎn)錄豐度與開花時間顯著相關，基因表達量越高開花時間越晚，這一點在轉(zhuǎn)基因大豆和普通大豆品種中均被證實[2, 20]。E2基因是擬南芥生物鐘GI基因的同源基因，在長日照和短日照條件下均表現(xiàn)出節(jié)律性表達特性，純和隱性基因型e2/e2通過誘導GmFT2a的表達使大豆開花提前，而在不同光照條件下E2基因?qū)﹂_花期的作用相對穩(wěn)定[21]。E3和E4基因編碼的光敏色素對不同光質(zhì)的敏感性不同，不同緯度條件下，其對E1基因的表達量的影響隨緯度變化而有所改變。E3和E4基因所編碼的光敏色素蛋白對不同光質(zhì)的敏感性不同，E3基因編碼的GmPhyA3對光質(zhì)的差異并不敏感，導致種植在不同緯度植株的開花期差異不大。而隨著海拔的升高，R:FR逐漸變小，E4基因編碼的GmPhyA2對光照的敏感性明顯增強。隱性E3和E4基因同時存在才能使大豆品種表現(xiàn)出光照不敏感特征[10-11]。

3.2 E1～E4在大豆整個生長期的調(diào)控作用

E1基因正常表達能夠延遲開花，但不能延長生殖期，E2和E3基因正常表達能夠延長花期和開花后的時期，E4基因正常表達能夠推遲開花和成熟[12]。不論是開花前還是開花后的光周期反應中，光敏色素E3和E4基因都是主要調(diào)控者，基因型為E3或E4品種的繁殖期和開花后的莖生長對光照變化很敏感，原因在于GmphyA2和GmphyA3能夠調(diào)控生長習性Dt1基因表達，使莖尖分生組織的營養(yǎng)活動存在持續(xù)性[31]。隱性基因型e1、el-as、e2、e3和e4對于大豆品種在高寒地區(qū)的適應性具有重要意義，其可以不同程度地促進大豆開花和成熟，而且其隱性基因數(shù)量越多表現(xiàn)出的光周期不敏感性越強。研究表明絕大多數(shù)高寒地區(qū)大豆品種為e1/e2基因型[1,34]。對332個栽培大豆品種和85個野生大豆品種中e4-SORE-1基因型分布情況的研究結(jié)果表明，僅日本北部地區(qū)栽培大豆品種存在基因型為e4-SORE-1的品種，說明e4-SORE-1編碼功能缺失的GmphyA2，導致大豆植株表現(xiàn)光不敏感特性，從而適應高緯度生存環(huán)境[30, 35]。

4 大豆E1～E4等位變異在生育期研究中的應用

目前世界上大豆種植范圍已經(jīng)超過50°N和40°S[36]。近年來各國學者廣泛研究不同地理區(qū)域大豆品種的E1～E4基因型，并對不同基因型組合品種生態(tài)適應性展開了更為深入的分析。目前，中國、日本、俄羅斯、哈薩克斯坦、美洲和歐洲等地區(qū)關于大豆品種E1～E4基因型鑒定與分析工作已經(jīng)開展多年。

4.1 中國大豆品種E1～E4等位變異與生育期關系研究

2014年Zhai等[3]鑒定180個具有代表性的中國大豆品種E1～E4基因型，在全國主要大豆生態(tài)區(qū)的6個試點(33°57′～45°70′N，117°17′～126°64′E)對大豆開花期與成熟期進行表型觀察，結(jié)果表明E2基因的隱性基因型比率最高，高達84.45%。明確我國品種的基因型主要可分為8個類型，e1-nf、e1-asE4、E1-asE3E4、e1-asE2(E3)E4、E1、E1E4(E3)、E1E3E4和E1E2E3E4，其中E1E3E4為優(yōu)勢基因型，占26.1%。e1-nf型(E1功能缺失型)開花最早，而來自南部地區(qū)的E1E2E3E4基因型品種不能適應高緯度地區(qū)日照時間較長的環(huán)境，開花很晚或者在高緯度地區(qū)霜凍之前沒有開花。研究發(fā)現(xiàn)不同品種中E1基因的表達量與大豆開花期呈極顯著相關。進一步證明E1～E4尤其是E1顯性基因?qū)Υ蠖构庵芷诿舾行缘囊种谱饔谩1-as具有一定抑制開花的功能，其對開花的抑制作用小于E1基因。

2017年Li等[37]研究299個中國大豆核心種質(zhì)在中國4不同地區(qū)的成熟期，采用Sequenom MassARRAY iPLEX platform系統(tǒng)鑒定228個品種E1～E4基因型并分析其與開花期和成熟期的綜合效應。結(jié)果表明E1/e2-ns/E3/E4和E1/E2/E3/E4是主要基因型，4個基因的隱性基因型不同程度促進早花，而其顯性基因型在成熟期較長的品種中出現(xiàn)頻率較高。研究結(jié)果表明中國核心種質(zhì)資源在基因型和表型上存在較大遺傳多樣性，能夠為中國大豆種植的生育區(qū)劃分和地理適應性分析提供重要信息，同時為培育適應特殊氣候環(huán)境的品種提供種質(zhì)資源。

4.2 國外大豆品種E1～E4等位變異與生育期關系研究

國外大豆品種E1～E4基因型鑒定工作整體晚于中國，2014年Jiang等[35]檢測85個大豆品種的E1～E4基因型，其中除46個品種為中國品種外，還包括來自南美MG 000～MGV III和MG X的13個生育期組的38個大豆品種，1個俄羅斯大豆品種(50°N)，中國大豆品種中有4個為野生型大豆品種(23°N、39°N、46°N和50°N)。85個品種中共有10種基因型，其中E1/E2/E3/E4和E1/e2/E3/E4型是主要基因型。e1基因型大豆品種更適宜高緯度地區(qū)種植，e4等位變異對于大豆品種對高緯度地區(qū)的適應性具有重要意義，4個帶有隱性e4等位基因的品種均適應高緯度地區(qū)，并表現(xiàn)出光周期不敏感性。帶有等位基因e1、e1-as或e2的品種的出苗期～初花期天數(shù)變化范圍較出苗期～成熟期和初花期～成熟期短。

2017年Kurasch等[38]研究75個歐洲大豆品種E1～E4基因型與成熟期相關性狀。首次發(fā)現(xiàn)有兩個品種是雜合基因型品種，Ruzica品種的E3基因為雜合位點，基因型是e3-tr/e3-fs，Carla_TD品種的E4基因為雜合位點，基因型是E4/e4-SORE-1。沒有檢測出E1基因型的品種，在MG 000 和MG 00生育區(qū)檢測出4個e1-nl基因型品種，每個生育區(qū)中均有e1-as基因型品種。e1-nl基因型品種的開花和成熟時間最早，在所有22個種植地點都能成熟。與e1-as基因型品種相比，e1-nl基因型品種營養(yǎng)生長期在整個生長期的占比較長。該研究結(jié)果說明大豆光周期作用和E系列基因研究對歐洲栽培大豆品種生態(tài)適應性研究的重要意義。2017年Abugalieva等[39]鑒定了來自哈薩克斯坦農(nóng)業(yè)科學院的120個品種(系)E1～E4基因型，這些品種是該地區(qū)育種工作的主要品種來源，研究材料來自西歐、東歐、北美、東亞和哈薩克斯坦5個地區(qū)12個國家。該研究共檢測到17個不同的基因型組合，5個主要組合是e1-as/e2/E3/E4、e1-as/e2/e3/E4、e1-as/e2/e3/e4、e1-nl/e2/E3/E4和e1-nl/e2/E3/e4。該研究分析了產(chǎn)量表型與基因型的關系，e1-as/e2/E3/E4基因型的品種(系)數(shù)量最多，但在3個地區(qū)都不是產(chǎn)量最高的基因型，具有顯性等位基因E3或E4基因的品種在這3個地區(qū)的產(chǎn)量均較高。5個主要組合的E2基因全部為隱性基因型。研究表明東南和東部地區(qū)形成一個整體環(huán)境，與需要種植成熟期較早的大豆品種的北部地區(qū)明顯區(qū)分開來，這些研究結(jié)果將為哈薩克斯坦大豆種植區(qū)的基因和表型模式關系的研究與應用提供參考。

2017年Langewisch等[1]鑒定238個大豆品種(系)E1/e1-as、E2/e2和E3-Ha/E3-Mi/e3-tr基因型，238個品種中127個為美國地方品種，48個為中國栽培大豆品種，17個為北美祖先品種，46個為北美栽培大豆品種，其中，40%品種采用分子標記方法鑒定，對60%品種進行重測序，利用Zhou等[40]的302個大豆品種的重測序SNP數(shù)據(jù)庫分析其基因型。結(jié)果表明，美國和加拿大現(xiàn)代大豆育種工作以有限親本材料為基礎，大部分親本材料來自中國，本土品種E1～E3基因等位變異類型存在局限性。美國MG 0～MG IV生育區(qū)錯誤的全部使用了基因型為e1-as的大豆品種，美國至少2 400萬hm2大豆產(chǎn)量受此限制。該研究形成基于大豆主要成熟期位點E1、E2和E3的美國大豆生育區(qū)分子育種模式，該模式能夠使育種者更高效的培育出適應不同生態(tài)區(qū)、具有特定農(nóng)藝性狀的大豆品種。該方法也可以用于優(yōu)化基因預測及篩選方案，從而整體提高美國和加拿大的大豆品種繁育效率。

不同大豆種植區(qū)的研究結(jié)果進一步說明盡管4個E基因不同變異的影響程度存在差異，但其不同基因型組合顯著地決定品種的生態(tài)適應性，4個E位點等位基因組合和相應分子標記技術(shù)能夠促進大豆分子繁育從而提高大豆產(chǎn)量。

5 展 望

E1變異基因型e1-b3a編碼蛋白具正常核定位信號，但B3結(jié)構(gòu)域發(fā)生變異。e1-b3a在高緯度哈爾濱地區(qū)種植的開花期較E1基因型提前30 d，在淮安地區(qū)約提前10 d，而e1-b3a蛋白與E1蛋白的亞細胞定位結(jié)果一致，而與e1-as不同，證明B3結(jié)構(gòu)域?qū)1基因生物學功能具有重要作用。Tsubokura等[28]發(fā)現(xiàn)少數(shù)品種為e1-re、e1-p、E2-in和E2-dl變異類型。對這些變異類型的深入研究將有助于對E1和E2基因功能的深入揭示。

E1～E4對開花的綜合貢獻估計高達62%～66%，還有目前尚不為人所知的基因控制[28]。已知基因(如E3、E4和J)和其他未知因素，至少可以通過調(diào)控E1基因表達來發(fā)揮作用[2, 24]。大豆中很多農(nóng)藝性狀相關QTLs已經(jīng)被定位但沒有克隆出來，相關基因的克隆將有助于對大豆生育期基因調(diào)控網(wǎng)絡特點的進一步認識[41]，最終實現(xiàn)對大豆生育期調(diào)控網(wǎng)絡的深入揭示。

重測序和Sequenom MassARRAY iPLEX platform系統(tǒng)等[37,40]更多新型、快速的鑒定方法將有助提高E1～E4基因型的鑒定效率，從而帶來高效率群體鑒定與分析的可能，包括E1～E4基因型鑒定在內(nèi)的更多大豆農(nóng)藝性狀相關基因的研究和鑒定將促進分子遺傳學研究結(jié)果應用到大豆育種工作中。