化學蛋白質組學鑒定天然產物作用靶標的研究進展

王 平，羅 佳，李海舟，許 敏

昆明理工大學生命科學與技術學院，昆明 650500

從天然產物中尋找高效低毒的先導化合物一直是新藥研究的熱點，據統計從1981年到2014年大約有53%的上市藥物都是天然產物或基于天然產物結構發(fā)展得到的[1]。中藥在我國有悠久的歷史，是經過臨床應用和時間考驗留下來的財富，從傳統中草藥中提取的天然產物具有結構多樣、藥理活性顯著等特點。但是大多數天然產物作用機制不明確、靶標蛋白的難以確定，阻礙了其在新藥研發(fā)中的發(fā)展。因此，鑒定天然產物的靶標蛋白，有助于闡明天然產物的作用機制、指導構效關系的研究，是藥物發(fā)現的關鍵步驟，而靶標的確定仍然是目前研究的難點[2,3]。化學蛋白質組學則是最近發(fā)展的一類方法可以用來很好的解決這一問題[4]。

1 化學蛋白質組學

化學蛋白質組學方法是利用小分子與特異性蛋白之間的相互作用，為我們提供有效的信息從而鑒定特異性作用的靶標蛋白。其需要對化合物進行修飾，引入一些親和基質或報告基團來釣取需要的靶標蛋白，再通過質譜等其他輔助技術來分析，具體流程如圖1所示[5]?；瘜W蛋白質組學主要有基于化合物為中心的化學蛋白質組學方法(compound-centric chemical proteomics,CCCP)和基于親和性蛋白組學方法(affinity-based protein profiling,ABPP)等。

最早確定靶標蛋白的方法是運用CCCP方法[6]，運用化學方法將天然產物固定在樹脂上再通過親和層析的方法來分離鑒定靶標蛋白，這是鑒定小分子靶標蛋白較為經典的方法，具有快速、大量富集靶標蛋白的優(yōu)點，但對細胞材料、將小分子合成到樹脂上的化學合成方法要求較高，現已較少使用。ABPP方法是在CCCP的基礎上發(fā)展起來的一種更方便、適用性更廣、較為有效的一種方法。它的基本原理和CCCP是一樣的，都是利用蛋白與活性分子之間的結合作用來發(fā)現靶標蛋白。具體步驟是將有活性的小分子運用化學的方法直接或間接引入報告基團(熒光素或生物素)，再通過報告基團富集分離與小分子作用的靶標蛋白[7]。

圖1 化學蛋白質組學方法應用于蛋白的鑒定Fig.1 Chemical proteomics method for protein identification

2 ABPP方法中小分子探針的設計與發(fā)展

ABPP是目前使用較廣泛、發(fā)展也較快的一種方法，其中很重要一部分是設計合成小分子探針(ABPs)，小分子探針是由報告基團(生物素、熒光素等)、鏈接基團(親水性鏈、親脂性鏈、肽鏈等)、反應基團(活性小分子)組成[8,9]。

ABPs探針分子一般是直接在活性小分子上引入報告基團來釣取靶標蛋白，但具有局限性。因為引入的生物素或熒光素報告基團較大，一般會影響小分子的活性，造成活性下降或消失，阻礙探針分子進入細胞膜內，不利于靶標蛋白的鑒定，一般用于細胞裂解液且只能釣取和小分子共價作用的靶蛋白。隨著技術的發(fā)展，ABPP方法中探針的合成也不再局限于原來的方法，特別光親和方法(photoaffinity labeling,PAL)和點擊化學方法(click-chemistry,CC)的引入，是對原先傳統的ABPP的方法進行補充[10]。

自1962年Singh A提出光親和技術，這一技術發(fā)展十分迅速[11]。探針分子上引入光親和基團在紫外光照射下會產生很活潑的反應中間體卡賓，使探針和靶蛋白之間形成較穩(wěn)定的共價鍵，可以用于發(fā)現與小分子非共價作用的靶標蛋白。在2001年Sharpless等提出點擊化學的概念[12]，探針分子上引入炔基或者疊氮基團，可以使探針分子先作用于活細胞減少小分子修飾后活性改變的問題，再在一價銅作用下形成三氮唑引入報告基團[13]。近幾年李正球等設計合成了一些極簡的光交聯基團用于蛋白質組學[14-17]，這些極簡的光交聯基團使點擊化學與光親和技術共同引入一個小分子上而較小的影響小分子自身的活性，結合了兩種方法的優(yōu)點，擴大了化學蛋白質組學對于活性小分子的應用范圍。因此現根據探針合成方法的不同，進一步可細分為ABPP,CC-ABPP，PAL-ABPP,PAL-CC-ABPP，其對應的四種探針如圖2所示。

圖2 ABPP的四種探針圖示Fig.2 Four probes of ABPP

3 ABPP方法在天然產物的靶標鑒定中的應用

天然產物通常具有多功能多靶點的特點，其發(fā)揮藥理作用的靶標蛋白卻難以確定，利用ABPP方法可以幫助我們解決天然產物靶點不明確的問題。下面根據天然產物類型分類介紹近幾年發(fā)表的ABPP方法在鑒定活性小分子靶標蛋白方面的應用，如表1和圖3所示。當有多個探針分子時，只列舉比較重要或有效的探針結構。因活性小分子接上熒光基團，主要是可以觀察小分子的具體作用位置，作為一個靶點鑒定的輔助作用，具體的靶點分離還是需要使用到生物素標記的活性小分子。故列出的小分子探針結構是選取連有生物素報告基團或連有炔基作為報告基團可以潛在的連接生物素的探針分子。

ABPP方法的核心在于活性小分子與靶標蛋白的相互作用，根據這些實例我們發(fā)現同一個化合物在不同位置進行探針分子合成的設計，或設計不同的探針，最后得到的標記蛋白可能會有所不同。因此設計合成小分子探針需要結合小分子的結構特性，需要保證引入報告基團或潛在報告基團的小分子探針依然能保持與原有的小分子相當的活性，同時在實驗過程中設定陰性對照來排除一些背景蛋白也非常重要。

當然也可以發(fā)現當使用不同的細胞系、組織、細菌等與同一探針作用時，得到的結果也不相同，提醒我們在探索化合物的作用機制、發(fā)現其靶標蛋白時，可以全面的運用不同的樣品進行處理，可能會有不一樣的發(fā)現。而中藥通常具有多靶點、多藥理活性的特性，因此運用這一方法可以幫助我們有效的了解中藥的作用機制。

4 小結與展望

ABPP方法的廣泛應用說明其非常適合用于鑒定活性天然產物的未知靶標蛋白，同時也可以用來驗證以前已經確定的化合物其相互作用的靶標蛋白。理論上ABP與PAL-ABP探針主要是作用于細胞裂解液，用來釣取與小分子共價作用的靶標蛋白，可以獲得與小分子特異性結合較為穩(wěn)定的靶蛋白，但因為方法的局限性不能得到較為全面的靶標蛋白譜圖。而CC-ABP、PAL-CC-ABP探針可作用于活細胞，可用來釣取與小分子非共價作用的靶標蛋白，所獲得的靶標蛋白較為全面，但同時也會存在非特異性背景蛋白的影響從而使特異性作用的蛋白確定較為困難。

而通過實例我們發(fā)現每種探針的應用條件并不是一定的，像ABP探針更適用于細胞裂解液，但同時如果合成的探針保留較好的活性也可以用于活細胞。當運用CC-ABPP、PAL-ABPP或CC-PAL-ABPP方法時，通常會得到較為全面的活性小分子作用的靶標譜圖，但同時也帶來一個問題就是會有很多非特異性的背景蛋白被標記，影響我們蛋白的確認和解析，此時通常會結合生物信息學網絡分析方法、同位素標記法等其他方法來綜合分析和活性小分子作用的靶蛋白。因此，不管是ABPP、CC-ABPP、PAL-ABPP還是PAL-CC-ABPP，或者其他發(fā)展起來的方法，每種方法都有優(yōu)劣，但都是根據需求逐步發(fā)展的，它們具體的原理相同，使用者可以根據具體的需要來進行選擇。

ABPP方法不僅可以用來發(fā)現活性小分子的靶蛋白，也會被用來作為工具來研究某一類化合物的具體作用機制，確定其有效的官能團或者骨架，為開發(fā)更有效的藥物提供基礎[63]。同樣也會被用來作為工具研究某一個蛋白在疾病中的作用[64,65]。從中藥材中分離的天然產物一般都具有多種藥理作用、多靶點的特性，而靶點不清晰也是面臨的重要問題，ABPP方法可以有效的解決這一困難，許多中藥中的“明星分子”像雷公藤、青蒿素、砷等都運用這一方法鑒定出其靶蛋白，故可以證明此方法具有較高的可行性，為鑒定天然產物的靶標蛋白提供了一種較為有效的方法。

近年來還發(fā)展了一些方法可以直接鑒定未經修飾的天然產物靶標蛋白，也叫無標簽的天然產物靶標蛋白鑒定，可以應用于一些缺乏可標記位點的化合物，獲得結果較為方便快速，可以較為快速的確定藥物的作用機制，有利于促進化合物進入臨床藥物的開發(fā)，是對ABPP方法用于鑒定小分子蛋白的補充。主要運用的方法包括基于藥物與靶點親和作用的穩(wěn)定性(drug affinity responsive target stability,DARTS)、基于蛋白質氧化率的穩(wěn)定性(stability of proteins from rates of oxidation,SPROX)、基于細胞熱變化實驗(cellular thermal shift assay, CETSA)、熱蛋白質組學分析(thermal proteome profiling,TPP)和基于生物網絡信息學分析藥物作用靶點[66](bioinformatics-based analysis of connectivity)等方法[67]。但是技術的發(fā)展還不成熟，限制了這些方法的使用，但是可以期待未來科學技術發(fā)展的更完善，結合如今發(fā)展較為完善的化學蛋白質組學技術，使這些方法在藥物發(fā)現中得到更好的應用。

表1 ABPP方法用于天然產物的靶點鑒定實例

續(xù)表1 (Continued Tab.1)

天然產物Natural products探針結構ABPs類型Type藥理活性Pharmacology activity探針方法Probe method靶蛋白Protein target實驗所用細胞系或其他Cell line or othersin vivo/in vitro毛萼乙素[31]萜類抗腫瘤和抗自身免疫炎癥ABPPp50的Cys62SMMC-7721 cellsin vitroKongensin A[32]萜類壞死抑制劑和凋亡誘導劑ABPP熱休克蛋白HSP90的Cys420HT29 cellsin vivo土槿皮乙酸[33]萜類抗腫瘤、抗病毒和抗真菌PAL-CC-ABPPCD147蛋白HeLa cellsin vivo穿心蓮內酯[34]萜類抗癌、抗炎CC-ABPPNF-кB和actinHCT116 cellsin vivo雷公藤紅素[35]萜類抗瘧、抑制脂質過氧化、抗炎ABPPAnnexin II,eEF1A,and β-tubulinpancreatic carcinoma cells (PANC-1)in vitro雷公藤甲素[36]萜類抗氧化、抗類風濕、抗癌ABPPPrx IMDCK cellin vitro同上[37]萜類同上PAL-ABPPdCTP焦磷酸酶1HeLa S3 cellsin vitro金盞花苷E[38]萜類內皮細胞保護ABPP128個HUVEC cellin vivo白樺酯酸[39]萜類抗艾滋病、抗炎、抗瘧疾、抗菌、抗腫瘤PAL-CC-ABPP21個MCF-7 cellsin vivo醉茄素A[40]甾體抗腫瘤和抗血管生成ABPPannexin IIbovine lung cellsin vitro

續(xù)表1 (Continued Tab.1)

天然產物Natural products探針結構ABPs類型Type藥理活性Pharmacology activity探針方法Probe method靶蛋白Protein target實驗所用細胞系或其他Cell line or othersin vivo/in vitro同上[41]甾體同上ABPP中間纖維蛋白(IF)波形蛋白HUVEC cellsin vitro膽甾醇[42]甾體參與體內多種生物學活動CC-ABPP250個Hela cellsin vivo同上[43]甾體同上ABPPSonic hedgehog(SHH)蛋白HEK293a Shh+ cells.in vivo膽汁酸[44]甾體幫助膳食脂肪消化PAL-CC-ABPP600Hela cellsin vivo小檗堿[45]生物堿抑菌、抗腫瘤ABPP肌動蛋白Jurkat T-cellsin vitroAvrainvillami-de[46]生物堿抗增殖ABPP核蛋白的Cys275T-47Din vitro苦參堿[47]生物堿抗癌PAL-ABPP膜聯蛋白A2(ANXA2)Hep3B cellin vivoPateamine A[48]海洋天然產物真核翻譯起始抑制劑ABPP真核翻譯起始因子4A(eIf4A)RKO cellsin vitroDiazonamide A[49]海洋天然產物阻斷紡錘體組裝ABPP一種線粒體酶(OAT)Hela cellsin vitro來普霉素B[50]其他抗真菌ABPPN-乙?；?L-半胱氨酸甲酯HeLa cellsin vitro根赤殼菌素[51]其他抗真菌ABPPATP-檸檬酸裂解酶、熱休克蛋白(HSP90)HeLa cellsin vitroFR177391[52]其他抗高血脂藥ABPP蛋白磷酸酶2A (PP2A)3T3-L1 fibroblasin vitro

續(xù)表1 (Continued Tab.1)

天然產物Natural products探針結構ABPs類型Type藥理活性Pharmacology activity探針方法Probe method靶蛋白Protein target實驗所用細胞系或其他Cell line or othersin vivo/in vitro環(huán)氧霉素[53,54]其他抗腫瘤ABPP蛋白酶體EL4 cellsin vivo砷[55,56]其他治療急性早幼粒細胞白血病ABPP360個HEK293T cellsin vivo萬古霉素[57]其他糖苷類藥物PAL-CC-ABPP葡萄球菌自溶素Atl蛋白和ABC轉運蛋白金黃色葡萄球菌in vivoRamariolides A-D[58]其他抗菌PAL-CC-ABPP9個Mycobacterial cellsin vivo阿西維辛[59]其他抗癌、抗寄生蟲CC-ABPPALDH4A1酶mouse liver cellsin vivo姜黃素[60]其他抗癌、抗炎、抗感染CC-ABPP197個HCT116 cellsin vivo寄端霉素[61]其他抗腫瘤和抗菌CC-ABPPTbGSK3short蛋白和TbCLK1激酶布魯氏菌in vivo4-hydroxy-2-nonenal[62]其他內源性的脂質親電試劑PAL-CC-ABPP398個RKO cellsin vivo