牛胚胎玻璃化冷凍技術(shù)研究進展

張培培，郝海生，杜衛(wèi)華，龐云渭，劉 巖，趙善江，趙學明，朱化彬

（中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團隊，北京 100193）

冷凍保存是將胚胎置于超低溫（-196℃）的液氮中保存，使細胞代謝速率下降，并能長期穩(wěn)定保存[1]，解凍后可用于胚胎移植。胚胎的冷凍保存是輔助生殖技術(shù)的重要手段。1972年由Whittingham等[1]第1次成功冷凍保存了小鼠胚胎，之后胚胎冷凍技術(shù)在家畜繁殖生物技術(shù)的應用日益廣泛。冷凍保存技術(shù)可以實現(xiàn)將體內(nèi)和體外生產(chǎn)的胚胎冷凍保存起來跨時空運輸，促進這些胚胎在胚胎移植行業(yè)的廣泛使用，這將增加胚胎移植帶來的潛在收益。據(jù)2015年國際胚胎移植協(xié)會（IETS）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界共移植牛體內(nèi)胚胎520 535枚、體外胚胎427 810枚，其中冷凍體內(nèi)胚胎達60.91%（317 386枚）、冷凍體外胚胎達25.97%（111 098枚）。胚胎冷凍技術(shù)在牛胚胎移植產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著日益重要的作用。

根據(jù)冷凍過程中降溫速率的不同，將胚胎冷凍保存技術(shù)分為慢速冷凍法、快速冷凍法和玻璃化冷凍法3種。目前，在生產(chǎn)實際中廣泛使用慢速冷凍法和玻璃化冷凍法。本文從冷凍方法、抗凍保護劑、產(chǎn)業(yè)應用等角度對牛胚胎冷凍技術(shù)進行總結(jié)和分析，旨在為從業(yè)人員提供相關(guān)的理論知識和技術(shù)參考，進而推動牛胚胎冷凍技術(shù)的進一步優(yōu)化和更廣泛的產(chǎn)業(yè)化應用。

1 冷凍方法

1.1 慢速冷凍法 慢速冷凍法是利用冷凍設(shè)備，加入低濃度的冷凍保護劑使細胞脫水，以低于1℃/min的速度降到-30～-80℃時，放入液氮中保存。冷凍過程中，細胞外的冷凍保護劑進入細胞質(zhì)以補充流失的水分，完成細胞內(nèi)外溶液的交換，當溫度降到0℃以下時，由于細胞外鹽濃度升高，細胞外冰晶的形成進一步增加了外界滲透壓，使細胞脫水收縮[2]。Whittingham等[1]首次報道了慢速冷凍法，Wilmut等[3]首次對牛胚胎用慢速冷凍法冷凍，解凍后胚胎移植成功生出小牛。慢速冷凍是牛胚胎冷凍保存的傳統(tǒng)方法，囊胚擴張率可達89%，孵化率為66%[4]。

在慢速冷凍過程中，細胞內(nèi)水的不穩(wěn)定過冷狀態(tài)可能會導致細胞內(nèi)冰晶的形成，通過在低溫下加入非滲透性冷凍保護劑（如蔗糖）使細胞與冷凍保護劑保持滲透壓平衡來減少大冰晶的形成。慢速冷凍需要控制速率的冷凍設(shè)備，冷凍過程花費時間較長，且胚胎的存活率和著床率較低，并有可能導致紡錘體異常[5]，這些因素限制了慢速冷凍技術(shù)的廣泛應用。

1.2 玻璃化冷凍法 玻璃化冷凍方法是通過添加高濃度的冷凍保護劑使細胞脫水，在0℃以上直接投入液氮中，使其快速冷卻（15 000～30 000℃/min）。液體粘度增加，當達到臨界值時發(fā)生凝固化，使細胞形成無結(jié)構(gòu)的玻璃態(tài)，避免了細胞內(nèi)冰晶的形成[6]。Rall等[7]首次用玻璃化冷凍方法成功冷凍保存了小鼠胚胎，隨著近幾十年來的改進，玻璃化冷凍法已經(jīng)成為最可靠的冷凍方法。玻璃化冷凍能夠降低冷凍保護劑的毒性，并且能夠使胚胎有較高的存活率和著床率，更重要的是玻璃化冷凍不會形成冰晶，避免了對細胞或組織的損傷。

由于玻璃化冷凍可以避免牛胚胎在緩慢冷凍過程中的冷敏感性，因此玻璃化方法冷凍牛胚胎的存活率（81%）比慢速冷凍胚胎的存活率（60%）更高[8]。研究表明，玻璃化冷凍牦牛胚胎的囊胚擴張率、孵化率和妊娠率也更高[9]，胚胎經(jīng)玻璃化冷凍后效果更好。雖然玻璃化冷凍還存在一些問題，但是相信未來這種方法的應用有很大前景。

2 玻璃化方法

目前，由于玻璃化冷凍技術(shù)的應用具有相對簡單、快速經(jīng)濟、存活率高、保存期短等優(yōu)點，玻璃化冷凍是胚胎冷凍的首選方法。雖然玻璃化冷凍技術(shù)已在許多物種胚胎的冷凍保存方面發(fā)揮了作用，但為了進一步提高懷孕率和產(chǎn)仔率，科研人員從承載工具、冷凍液成分等角度進行了優(yōu)化和完善。

2.1 承載工具

2.1.1 Open Pulled Straw（OPS）冷凍法 如圖1所示，OPS冷凍法是將標準的塑料吸管加熱拉到管直徑和厚度的一半，將含有胚胎的冷凍液（約0.1 μL）吸到OPS管的末端，最后將OPS管直接投入液氮中冷凍保存[10]。隨著1997年OPS法的發(fā)明，Vajta等[11]首次用OPS法玻璃化冷凍牛胚胎，用OPS法冷凍的牛胚胎移植后誕生了小牛[12]。OPS冷凍法的冷卻和升溫速度可達20 000℃/min以上，接觸冷凍保護劑的時間較短，減少了細胞毒性和滲透性傷害[11]。因此，OPS玻璃化技術(shù)為解決生殖低溫生物學的基本問題提供了一條新途徑，可能對動物生物技術(shù)和人類輔助生殖產(chǎn)生實際影響。

2.1.2 Solid surface（SSV）冷凍法 如圖2所示，SSV法是將覆蓋著鋁箔的金屬立方體部分浸入液氮中，使用移液管將含有胚胎的玻璃化液滴（約0.6 μL）置于金屬立方體的表面，通過接觸金屬表面在-196℃下進行冷凍[13]。體外成熟的牛卵母細胞經(jīng)SSV法冷凍后存活率和發(fā)育率較高[14]。SSV法具有商業(yè)優(yōu)勢，因為胚胎不會直接接觸液氮，減少了玻璃化冷凍過程對胚胎的污染風險。

2.1.3 Cryotop 冷凍法 如圖3所示，Cryotop法是將含有胚胎的玻璃化液滴（約0.1 μL）放在一個細的聚丙烯帶（寬×長×厚=0.4 mm×20 mm×0.1 mm）上，立即垂直浸入到液氮中完成冷凍過程，最后將Cryotop板蓋上塑料蓋，儲存在液氮中[15]。Do等[4]用該方法對牛胚胎冷凍保存，囊胚孵化率為90%，Cryotop法已經(jīng)被證明是一種簡單實用的玻璃化技術(shù)。

Cryotop法使用的玻璃化冷凍液體積最小，可增加冷凍（23 000℃/min）解凍速率(40 000℃/min)[16]，降低冷凍損傷。Kuwayama[16]認為，與任何其他玻璃化載體相比，使用Cryotop方法對囊胚的冷凍保存有更高的效率。

2.1.4 Cryoloop冷凍法 如圖4所示，Cryoloop法是將一個尼龍環(huán)（20 mm寬；內(nèi)徑0.5～0.7 mm）安裝在不銹鋼細管上，另一端插在冷凍瓶的蓋子上。玻璃化冷凍時，將囊胚放在涂有一層冷凍保護劑薄膜的尼龍環(huán)上，然后放入裝有液氮的冷凍瓶中[17]。Lane等[18]用Cryoloop法冷凍牛胚胎，解凍后胚胎孵化率達到80%。Cryoloop法冷凍速率高達到700 000℃/min，可減少與冷凍保護劑接觸的時間，減少了對細胞的毒性傷害。

2.1.5 微滴（Microdroplet）冷凍法 如圖5所示，微滴玻璃化法是將含有胚胎的玻璃化冷凍液直接放入液氮中，消除了容器壁的絕緣效果[10]。在吸管尖端做一個含胚胎的1 μL的微滴，溶液凝固后將吸管尖端浸入液氮中，切去1 cm的尖端，平衡后30 s后將胚胎置于液氮中冷凍[19]。Yang等[20]用微滴法成功冷凍保存了牛胚胎。微滴法冷凍過程中胚胎與液氮直接接觸，加快了冷卻速率，同時也容易使胚胎污染。

2.1.6 Vitri-Inga冷凍法 如圖6所示，Vitri-Inga是由一條薄的聚丙烯條帶（0.7 mm厚）和一個特別設(shè)計的圓頭組成的冷凍裝置，圓頭有一個小孔用來放置細胞，條帶的另一端與塑料手柄相連。冷凍過程中，將卵母細胞/胚胎放在Vitri-Inga條帶的孔中，然后立即浸入液氮中，冷凍速率為22 800℃/min[21]。Vitri-Inga是開放的冷凍裝置，胚胎與液氮直接接觸，容易受污染。

2.1.7 尼龍網(wǎng)（Nylon Mesh）冷凍法 如圖7所示，尼龍網(wǎng)冷凍法是將尼龍網(wǎng)（60 μm網(wǎng)徑）作為冷凍載體，將尼龍網(wǎng)剪成三角形，底高分別約1.0 cm和1.3 cm，用棉滌綸線（0.2 mm直徑）與尼龍網(wǎng)連接。使用前，用高壓鍋對尼龍網(wǎng)格滅菌，用濾紙吸去尼龍網(wǎng)格上多余的玻璃化液。將冷凍液中的卵母細胞/胚胎吸出放到尼龍網(wǎng)上，在30～50 s內(nèi)將尼龍網(wǎng)浸入裝有液氮的手柄上的2 mL聚丙烯管中，放入液氮中儲存[22]。尼龍網(wǎng)面積大，有利于冷凍細胞的恢復和減少細胞損傷。

2.1.8 紙容器（Paper Cryodevice）冷凍法 如圖8所示，紙容器是從半透明圖紙上剪下來的，其尺寸是可以裝入冷凍管中以儲存在液氮中。用移液管將胚胎放到紙容器尖端處，用鑷子將紙容器插入液氮中，在將其插入液氮之前去除過量的玻璃化冷凍液，在液氮下將其轉(zhuǎn)移到冷凍管中[23]。Kim等[24]首次使用紙容器對牛囊胚進行玻璃化冷凍，解凍后存活率高于95%，囊胚孵化率為73%，妊娠率為19.3%，產(chǎn)仔率12.3%。

紙容器玻璃化冷凍法操作簡單，成本較低，紙容器可吸收多余的冷凍保護劑溶液，可以使卵母細胞或胚胎周圍的玻璃化溶液的體積最小化，因此增加了冷凍和解凍速率，但是因為胚胎直接接觸液氮，所以容易污染[24]。

2.1.9 Hollow Fiber（HFV）冷凍法 如圖9所示，將一段25 mm長的中空纖維連接到注射針上，組成HFV裝置。HFV裝置與1 mL的注射器和吸管連接，將胚胎吸入中空纖維中。然后分離開Hollow fiber與注射針，用鑷子將含胚胎的Hollow fiber依次放入平衡液和冷凍液，最后投入液氮。HFV冷凍液體積較小，且容納的胚胎多[25]。Uchikura等[26]用Hollow fiber 法冷凍牛胚胎存活率為82.5%。

2.2 冷凍保護劑 冷凍保護劑被定義為能夠減少或防止細胞冷凍損傷的試劑，主要分為滲透性保護劑、非滲透性保護劑和抗凍蛋白。

2.2.1 滲透性抗凍保護劑 滲透性保護劑分子量小，容易穿過細胞膜，可使胚胎內(nèi)濃度達到玻璃化所需要的濃度，滲透性保護劑有乙二醇（EG）、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇（PG）和甘油等。滲透性保護劑能夠?qū)⒓毎麅?nèi)水分吸出從而減少細胞內(nèi)冰晶的形成，可用于早期胚胎冷凍，但是這類保護劑對細胞有一定的毒害作用。

EG是所有二元醇中最有效的冷凍保護劑，它具有低毒性和高膜滲透性，這種優(yōu)勢使其能夠在室溫下處理冷凍胚胎[27]。PG也有一定程度的防凍保護作用，通過固態(tài)CO2程序或液氮蒸汽在甘油中冷凍的方法胚胎的存活率相對較高，但存活率低于緩慢冷凍的胚胎[28]。

2.2.2 非滲透性抗凍保護劑 非滲透性冷凍保護劑是一些大分子物質(zhì)，不容易穿過細胞膜，如聚乙二醇（PEG）、蔗糖、葡萄糖、海藻糖和半乳糖等，可用于囊胚冷凍。蔗糖幾乎已經(jīng)成為玻璃化冷凍保護液的主要成分，這類保護劑作用于細胞外，在低溫下對胚胎沒有毒性作用[29]。非滲透性保護劑的作用是增加溶液滲透壓，避免細胞內(nèi)冰晶的形成，減少滲透性冷凍保護劑引起的化學毒性，提高玻璃化后囊胚的存活率。

2.2.3 抗凍保護劑組合 將滲透性抗凍保護劑和非滲透性抗凍保護劑按照一定比例混合使用，可提高玻璃化冷凍效率。

EG毒性小且滲透性強，所以形成的玻璃化狀態(tài)較差，DMSO與EG相比毒性較大且滲透性較差，但形成的玻璃化狀態(tài)較好。玻璃化冷凍使用25% EG+25%DMSO組合可使冷凍胚胎有較高的解凍率（75%）和孵化率（70%），因此將EG與DMSO等量比例混合使用效果較好[29]。

2.2.4 抗凍蛋白 抗凍蛋白（AFPs）是一種能吸附到冰晶表面并阻止其生長的蛋白質(zhì)，最早由Devriesde等[30]在海洋結(jié)冰地區(qū)的魚血液中鑒定出來。自從發(fā)現(xiàn)第1個AFP以來，不僅在易結(jié)冰地區(qū)更廣泛的魚類中發(fā)現(xiàn)了具有這些特性的蛋白質(zhì)，而且在許多植物和昆蟲中也發(fā)現(xiàn)了具有這些特性的蛋白質(zhì)。AFP能夠穩(wěn)定細胞膜，且可以與冰晶結(jié)合從而抑制冰晶生長和在冷凍液中的重結(jié)晶，進而保護細胞及其膜免受低溫損傷，提高冷凍保存的成功率。

AFP通過保持細胞膜的完整性和細胞內(nèi)ATP的含量，提高了小鼠胚胎的冷凍存活率和胚胎發(fā)育能力[31]。AFP可以保護冷凍牛卵母細胞的完整性，使其保持功能完整，對冷凍哺乳動物細胞的短期保存具有重要意義。

3 玻璃化冷凍牛胚胎應用情況

3.1 體內(nèi)生產(chǎn)胚胎 目前，通過超數(shù)排卵和人工授精的方法獲得的體內(nèi)囊胚，胚胎質(zhì)量最優(yōu)，其冷凍效果也最好。研究表明，牛體內(nèi)生產(chǎn)囊胚，采用玻璃化法冷凍后，存活率可達100%，擴張率可達90%以上，移植率可達50%以上[32]。

3.2 IVF胚胎 研究證實，與體內(nèi)胚胎相比，體外受精（IVF）牛胚胎對冷凍損傷更敏感，尤其是對緩慢冷凍的敏感性更強，主要是因為體外培養(yǎng)會使其細胞質(zhì)中脂類含量增加[33]。近年來，研究人員經(jīng)過大量努力，取得了一定的研究進展。

牛IVF囊胚采用OPS玻璃化法冷凍時，解凍后囊胚存活率可達90.5%[34]、孵化率達94%[11]，冷凍囊胚移植后妊娠率可達50%[8,35]、產(chǎn)犢率達100%[8]。同時，當牛IVF囊胚采用Cryotop玻璃化法進行冷凍時，存活率可達100%[36]，擴張率為96%[4]，移植妊娠率為46.8%、產(chǎn)犢率為34.3%[37]。用自動玻璃化設(shè)備對牛IVF囊胚玻璃化冷凍時，存活率為100%，卵裂率為54%[38]。

采用CVM玻璃化冷凍法、以16.5% EG+16.5%DMSO+0.5 mol/L 蔗糖為冷凍保護劑冷凍牛IVF囊胚，囊胚存活率為94.5%，孵化率為53.6%[39]。Kim等[24]研究表明，采用電子網(wǎng)格、塑料吸管和紙容器玻璃化法冷凍IVF牛囊胚，囊胚存活率分別為88%、86.7%和94.7%，孵化率分別為64.7%、46.7%和73%[24]。

3.3 ICSI胚胎 胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）是一種高效的輔助人和動物精子受精的治療方法。研究表明，ICSI囊胚比IVF囊胚對玻璃化冷凍更敏感，而完全擴張的ICSI囊胚和IVF囊胚玻璃化冷凍后有相似的存活能力，因此ICSI囊胚玻璃化冷凍階段在擴張囊胚為宜[40]。

Zhao等[41]用OPS冷凍法玻璃化冷凍牛ICSI胚胎，以15% EG+15% DMSO+0.3 mol/L蔗糖為冷凍保護劑，解凍后存活率為82.4%。Abdalla等[40]采用Cryotop冷凍法玻璃化冷凍第7天 ICSI 完全擴張囊胚，以15%EG+15% DMSO+0.5 mol/L蔗糖為冷凍保護劑，解凍后存活率為83%，孵化率為73%。

3.4 SCNT胚胎 近年來，體細胞核移植技術(shù)（SCNT）發(fā)展迅速，利用SCNT可以得到大量遺傳資源優(yōu)良的牛克隆胚胎。通常認為SCNT胚胎比IVF胚胎和體內(nèi)產(chǎn)生的胚胎對冷凍損傷更敏感，這可能是由于在去核和細胞注射過程中由顯微操作引起的透明帶完整性喪失造成的。

采用OPS法玻璃化冷凍牛SCNT囊胚的研究中，以40% EG+30% 聚蔗糖+0.5 mol/L蔗糖為冷凍保護劑時第60天妊娠率為33.3%，產(chǎn)犢率為33.3%[42]；以20%+20% DMSO+0.6 mol/L蔗糖為冷凍保護劑時第40天時妊娠率為43%，產(chǎn)犢率為16.7%[43]。同時，牛SCNT囊胚采用Cryotop玻璃化法進行冷凍時，以15%+15% DMSO+0.5 mol/L蔗糖為冷凍保護劑時存活率為69.8%[44]，以20%+20% DMSO+0.5 mol/L蔗糖為冷凍保護劑時存活率達80%，移植后第40天妊娠率為50%[45]。

另外,Nguyen等[46]采用細管法、以EG+蔗糖+聚蔗糖為玻璃化冷凍液對SCNT胚胎進行冷凍，SCNT胚胎存活率高達93%、孵化率高達95%；Lonergan等[47]采用SSV玻璃化冷凍法、以EG和DMSO為抗凍保護劑，SCNT囊胚移植后第25天妊娠率達67.7%。

4 展 望

胚胎冷凍保存技術(shù)是輔助生殖的重要手段。慢速冷凍技術(shù)操作復雜、降溫慢、耗時長，不適用胚胎冷凍。而玻璃化冷凍技術(shù)具有操作簡單、成本低、效率高等優(yōu)點，在生產(chǎn)上應用較多。隨著玻璃化冷凍方法和冷凍保護劑的不斷開發(fā)和優(yōu)化，牛胚胎玻璃化冷凍技術(shù)的冷凍效率勢必進一步提高，更加廣泛應用于實踐中，為胚胎的冷凍保存開辟了新的前景，推進了優(yōu)良種質(zhì)資源的利用和牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。