外周血ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平對(duì)乙肝后肝硬化患者Child分級(jí)和預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

詹有芳，張 玨△，王 鵬

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200021；2.上海市浦東新區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，上海 201206

肝硬化是我國(guó)常見(jiàn)疾病之一，它是由不同病因引起的慢性進(jìn)行性彌漫性肝病，病理上以肝臟彌漫性纖維化、再生結(jié)節(jié)和假小葉形成為特征[1-2]。肝硬化患者起病較為隱匿，病程持續(xù)較長(zhǎng)，發(fā)展緩慢[3]，是導(dǎo)致肝移植、肝癌及肝病相關(guān)死亡的重要危險(xiǎn)因素[4]。由于肝硬化病變較難控制，使患者生存質(zhì)量和生存時(shí)間都受到嚴(yán)重影響。因此，準(zhǔn)確評(píng)估肝硬化患者的嚴(yán)重程度對(duì)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和判斷疾病預(yù)后有重要參考價(jià)值[5]。本研究檢測(cè)了外周血乙醛脫氫酶(ALDH7A1)家族成員ALDH7A1 mRNA在不同Child分級(jí)乙肝后肝硬化患者中的表達(dá)水平，分析其與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性，進(jìn)一步考察ALDH7A1對(duì)Child分級(jí)的診斷識(shí)別能力，以及與不同并發(fā)癥的關(guān)系，旨在評(píng)估ALDH7A1在乙肝后肝硬化患者疾病進(jìn)展和預(yù)后中的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取乙肝后肝硬化患者90例，其中Child A、B和C級(jí)各30例作為乙肝后肝硬化組，參照《病毒性肝炎防治方案》[6]中有關(guān)乙肝后肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診并分級(jí)，其中男60例，女30例，年齡37～62歲，平均(50.05±1.21)歲。乙肝后肝硬化為慢性乙肝發(fā)展的結(jié)果，肝組織病理學(xué)表現(xiàn)為彌漫性肝纖維化及結(jié)節(jié)形成，二者必須同時(shí)具備才能診斷。(1)代償性肝硬化指早期肝硬化，一般屬Child A級(jí)，可有輕度乏力、食欲減弱或腹脹癥狀，尚無(wú)明顯肝功能衰竭表現(xiàn)。血清清蛋白(ALB)水平降低，但仍≥35 g/L，血清總膽紅素(TBIL)≤35 μmol/L，凝血酶原活動(dòng)度>60%。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平輕度升高，AST水平可高于ALT，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平可輕度升高?？捎虚T靜脈高壓，如輕度食管靜脈曲張，但無(wú)腹水、肝性腦病或上消化道出血。(2)失代償性肝硬化指中、晚期肝硬化，一般屬Child B、C級(jí)，有明顯肝功能異常及失代償征象，如血清ALB<35 g/L，明顯黃疸，血清TBIL>35 μmol/L，ALT和AST水平升高，凝血酶原活動(dòng)度<60%?；颊呖沙霈F(xiàn)腹水、肝性腦病及門靜脈高壓引起的食管、胃底靜脈明顯曲張或破裂出血。Child評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1,將所記分?jǐn)?shù)相加，根據(jù)總分分為A、B、C級(jí)。A級(jí)≤6分；B級(jí)>6～9分；C級(jí)>9分。另選取健康志愿者30例作為健康對(duì)照組，其中男20例，女10例，年齡35～60歲，平均(47.63±12.37)歲。兩組研究對(duì)象性別和年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

表1 Child肝功能分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 合并嚴(yán)重心、膽、腎、內(nèi)分泌、造血系統(tǒng)及精神神經(jīng)疾病者；妊娠或哺乳期婦女。

1.3方法 標(biāo)本及信息收集：采集各研究對(duì)象清晨空腹乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血5 mL，用淋巴細(xì)胞分離液獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用TRIzol試劑(Thermo，美國(guó)，型號(hào)：15596026)提取細(xì)胞總RNA，-80 ℃保存待測(cè)。另抽取各研究對(duì)象靜脈血5 mL，分離血清，檢測(cè)ALT、AST、ALB、TBIL、透明質(zhì)酸(HA)等臨床指標(biāo)水平。同時(shí)記錄肝硬化患者食管胃底靜脈曲張、消化道出血、自發(fā)性腹膜炎、脾大等并發(fā)癥信息。實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)：將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參。ALDH7A1上游引物序列：5′-CAT GGC GTG AGT GAA GGA C-3′，下游引物序列：5′-CAG GGC AAT AGG TCG TAA TAA CC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGG TAT CGT GGA AGG ACT CAT GAC-3′，下游引物序列：5′-ATG CCA GTG AGC TTC CCG TTC AGC-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt表示ALDH7A1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1健康對(duì)照組和乙肝后肝硬化組不同Child分級(jí)患者ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。與健康對(duì)照組比較，乙肝后肝硬化組不同Child分級(jí)的患者ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Child A級(jí)組比較，Child B級(jí)組和Child C級(jí)組ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Child B級(jí)組比較，Child C級(jí)組ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平雖有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 健康對(duì)照組和乙肝后肝硬化組不同Child分級(jí)的患者ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平比較

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與Child A級(jí)組比較，#P<0.05。

2.2乙肝后肝硬化患者ALDH7A1 mRNA與臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性分析 乙肝后肝硬化患者ALT水平為(102.51±62.07)U/L，AST水平為(138.70±72.35)U/L，ALB水平為(32.31±15.46)g/L，TBIL水平為(58.18±34.72)μmol/L，HA水平為(218.16±133.98)ng/mL，Child得分為(8.57±4.32)分。ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平與肝損傷指標(biāo)ALT、AST呈負(fù)相關(guān)(r=-0.57、-0.59，P<0.05)，與肝臟生物合成能力指標(biāo)ALB呈正相關(guān)(r=0.37，P<0.05)，與肝臟解毒能力指標(biāo)TBIL呈負(fù)相關(guān)(r=-0.72，P<0.05)，與纖維化指標(biāo)HA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64，P<0.05)，與Child得分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.539，P<0.05)。

2.3ALDH7A1 mRNA在不同Child分級(jí)的乙肝后肝硬化患者中ROC曲線分析 為衡量ALDH7A1 mRNA對(duì)不同Child分級(jí)的乙肝后肝硬化患者的診斷識(shí)別能力，對(duì)相鄰Child分級(jí)之間進(jìn)行ROC曲線分析見(jiàn)圖1，即Child A級(jí)組和Child B級(jí)組及Child B級(jí)組和Child C級(jí)組之間比較。ALDH7A1 mRNA對(duì)Child A級(jí)和Child B級(jí)的識(shí)別能力較強(qiáng)，ROC曲線下面積(AUC)為0.859，而對(duì)Child B級(jí)和Child C級(jí)的識(shí)別能力較弱，AUC僅為0.681。

注：A為Child A級(jí)和Child B級(jí)比較；B為Child B級(jí)和Child C級(jí)比較。

圖1乙肝后肝硬化患者不同Child分級(jí)間ROC曲線分析

2.4乙肝后肝硬化患者有無(wú)并發(fā)癥時(shí)ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖2。90例乙肝后肝硬化患者中出現(xiàn)食管胃底靜脈曲張58例，消化道出血48例，自發(fā)性腹膜炎29例，脾大33例，與無(wú)并發(fā)癥肝硬化患者比較，有并發(fā)癥患者ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 乙肝后肝硬化患者有無(wú)并發(fā)癥時(shí)ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

肝硬化是一種嚴(yán)重的肝臟疾病，該類患者的疾病進(jìn)展監(jiān)控和預(yù)后判斷一直是臨床研究的重要課題。早期肝硬化患者癥狀不甚明顯，發(fā)展至后期則會(huì)出現(xiàn)肝功能衰竭、肝酶水平逐漸升高、門靜脈高壓等癥狀，甚至出現(xiàn)出血傾向[7]。另一方面，肝硬化患者5年生存率高達(dá)85%以上，但發(fā)生腹水、肝腎綜合征、肝性腦病等不良事件后會(huì)導(dǎo)致患者病情快速惡化，大幅度降低患者5年生存率[8]。因此，對(duì)肝硬化患者進(jìn)行早期診斷和改善預(yù)后是目前急需解決的問(wèn)題。

ALDH7A1是乙醛脫氫酶家族成員之一[9]，乙醛脫氫酶家族與生物氧化關(guān)系密切，是線粒體內(nèi)重要的醛類氧化酶，能夠氧化多種有害的芳香醛和脂肪醛，防止其對(duì)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，是機(jī)體重要的保護(hù)因子之一[10]。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在Kuffer細(xì)胞和Ito細(xì)胞的激活及其膠原基因的表達(dá)，以及肝纖維化、肝硬化的形成過(guò)程中起重要作用，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可能是連接組織損傷、肝纖維化及肝硬化的紐帶[11]。有研究顯示，ALDH7A1能夠緩解乙醛等醛類和氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞毒性[12]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，ALDH7A1在藥物誘導(dǎo)的肝脂質(zhì)變性中呈時(shí)間/劑量依賴性增加[13]。

本研究采用qRT-PCR檢測(cè)不同Child分級(jí)的乙肝后肝硬化患者外周血ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，隨著Child分級(jí)增加，ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平逐漸下降，且ALDH7A1表達(dá)水平與肝損傷程度、肝生物合成能力、肝解毒能力、肝纖維化程度等多項(xiàng)臨床指標(biāo)具有相關(guān)性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ALDH7A1 mRNA表達(dá)水平對(duì)乙肝后肝硬化早期的Child A級(jí)和Child B級(jí)識(shí)別能力較強(qiáng)，具有一定的早期診斷價(jià)值。同時(shí)，ALDH7A1 mRNA低表達(dá)患者預(yù)后較差，可能出現(xiàn)食管胃底靜脈曲張、消化道出血、自發(fā)性腹膜炎、脾大等多種并發(fā)癥，說(shuō)明ALDH7A1對(duì)乙肝后肝硬化的預(yù)后也具有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，ALDH7A1可能是乙肝后肝硬化疾病進(jìn)展監(jiān)控和預(yù)后判斷的一項(xiàng)潛在生物標(biāo)志物，在臨床上具有重要參考價(jià)值。