維生素D檢測與慢性腎臟病研究進展*

李園夢 綜述，俸家富，2△ 審校

1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學檢驗部，四川瀘州 646000；2.綿陽市中心醫(yī)院檢驗科，四川綿陽 621000

維生素D(VitD)是一組親脂性甾體類固醇衍生物的統(tǒng)稱，其亞組分很多，但與人體健康相關的主要是VitD2和VitD3，其中VitD2主要來源于植物性膳食，而VitD3主要通過光照經皮膚合成，少數(shù)來源于動物性膳食[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，VitD除了與骨骼疾病[2-4]、血脂紊亂[5]和自身免疫性疾病[6]等有關外，還發(fā)現(xiàn)其缺乏或不足與慢性腎臟病(CKD)的發(fā)生和發(fā)展密切相關[7]。CKD是臨床上多見的一種慢性疾病，因其發(fā)病率較高而知曉率較低，已成為全球一大公共衛(wèi)生問題。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，VitD缺乏或不足可能與CKD發(fā)病、病情嚴重程度及預后有關，特別是在晚期CKD患者和腎移植患者中，對VitD的依賴表現(xiàn)更加明顯[8-10]。本文就VitD缺乏與CKD的關系綜述如下。

1 VitD的生理功能與流行病學

VitD本身并無生物活性，只有在肝臟和腎臟中分別經碳25號位和碳1號位上的2次連續(xù)羥基化生成1,25(OH)2D后，才能成為有生化功能的活性物質。1,25(OH)2D的生理功能包括：通過內分泌功能調節(jié)骨骼和礦物質代謝；抑制細胞增殖、腎素生成和血管生成；促進細胞終末分化、胰島素生成和巨噬細胞抗菌肽生成；調節(jié)免疫系統(tǒng)(抑制適應性免疫但促進先天性免疫的調節(jié))等[11]。1,25(OH)2D在小腸、腎臟和骨組織中的一系列正常生理生化代謝活動受鈣(Ca)、磷(P)、甲狀旁腺激素(PTH)及成纖維細胞生長因子-23(FGF-23)等物質調節(jié)。在小腸中，1,25(OH)2D3與腸黏膜細胞受體相結合形成復合物，進入核染色體，促進信使核糖核酸合成，并讓相關基因在細胞質內表達轉化為鈣結合蛋白，從而增強小腸對Ca的吸收[12]。當1,25(OH)2D3水平降低時，小腸Ca、P吸收減少，血Ca循環(huán)水平較低，促進了PTH水平反應性升高，并將其釋放至腎臟及骨組織器官中[12]。在腎臟中，PTH通過抑制腎小管上皮細胞增殖，促進氫氧化酶(也稱1α-羥化酶)基因表達，同時抑制24-羥化酶活性，以增強1,25(OH)2D3產生，進而增強腎小管對Ca的重吸收能力[12]。在骨組織中，PTH還可與1,25(OH)2D3共同作用，從骨細胞中動員Ca，并將其釋放到血液中，從而使低血Ca恢復到正常水平[12]。相反，當血清1,25(OH)2D3水平升高時，血Ca循環(huán)水平較高，促使PTH水平反應性降低，從而通過負反饋調節(jié)進一步抑制1,25(OH)2D3產生。

眾所周知，VitD是人體內必需的營養(yǎng)素。有研究表明，VitD缺乏或不足現(xiàn)象日益嚴重，其逐漸成為全球公認的公共衛(wèi)生問題[13]。我國一些研究發(fā)現(xiàn)，柳州市城區(qū)1～3歲兒童VitD缺乏和不足率達12.94%，4～6歲兒童VitD缺乏和不足率達39.81%[14]。麗水市區(qū)22～38歲孕婦血清25(OH)D缺乏率為54.20%，嚴重缺乏率為35.70%[15]。廣州市區(qū)夏季(5～10月)40歲以上人群中，男性VitD嚴重缺乏、缺乏和不足分別占7.56%、33.19%和34.45%；女性VitD嚴重缺乏、缺乏和不足分別占6.53%、40.63%和37.22%[16]。銀川地區(qū)中老年體檢者血清VitD缺乏和不足達到81.03%[17]。由此可見，我國VitD缺乏或不足涉及的人群十分廣泛，從新生兒到中老年人等各年齡段均可出現(xiàn)，由此提示臨床醫(yī)生應關注和重視患者的VitD營養(yǎng)狀況，特別是VitD缺乏的高風險群體。

2 VitD檢測

2.1VitD的認識 通常所說的VitD是一個通用術語，其既不考慮VitD代謝物之間的結構和功能差異，也不代表某種具體VitD簡寫形式或羥化結構式。只有當使用25(OH)D、25(OH)D2、25(OH)D3或1,25(OH)2D這些縮略式時，才是特指VitD的某種特定羥化結構形式。因此，通常所說的VitD檢測是指檢測其某種具體結構形式[如25(OH)D或1,25(OH)2D]或某些結構形式的組成成分[如25(OH)D2、25(OH)D3]及這些成分之和，而具體是檢測哪種羥化結構形式，取決于其采用的是何種檢測方法，不同VitD比較見表1。

2.2VitD檢測方法 關于VitD的檢測，目前國內外臨床實驗室常用方法主要有兩大類，一類是免疫分析法，目前應用最多的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和化學發(fā)光分析法(CLIA)，后者包括電化學發(fā)光分析法(ECLIA)，此外，放射免疫法(RIA)和免疫比濁法(即全自動生化法)也有部分應用[18]；另一類是色譜法，目前臨床實驗室應用較多的主要包括：高效液相色譜分析法和液相色譜-串聯(lián)質譜分析法(LC-MS/MS)。

表1 不同VitD比較

2.2.1免疫分析法特點 RIA使用的試劑對實驗操作人員和環(huán)境具有潛在的放射性污染風險，并且其放射性廢物處理過程復雜繁瑣；ELISA中酶促反應與反應溫度、孵育時間、加樣是否準確和洗板是否干凈等因素有關，此外，其靈敏度和特異度不理想，且易有基質效應干擾或與其他非目標羥基化合物發(fā)生交叉反應；CLIA、ECLIA和全自動生化法具有全自動和高通量的優(yōu)點。由于VitD結合蛋白(DBP)與VitD代謝物中間產物[如25(OH)D、1,25(OH)2D和24,25(OH)2D等]結合的親和力不同，導致DBP釋放效率有所差異、非等效檢出25(OH)D2或25(OH)D3、C3-epi-25(OH)D3[與25(OH)D3具有相同結構但在立體化學構型上不同的分子]對VitD代謝物中間產物的交叉反應性、異嗜性抗體的干擾或者缺乏國際測定標準等因素導致各種免疫分析方法間的檢測結果變異太大[19]。免疫分析法共有的缺點是只能檢測總25(OH)D水平，無法單獨檢測25(OH)D2和25(OH)D3水平和相對比例，比如羅氏診斷只能檢測25(OH)D3水平。

2.2.2色譜法特點 色譜法與傳統(tǒng)免疫分析法相比不同的是：LC-MS/MS定量分析法是國際上公認的測量25(OH)D的金標準，它可通過特定的相對分子質量和質量碎片區(qū)分25(OH)D2和25(OH)D3和其他類似代謝化合物，以同時檢測其血清25(OH)D2和25(OH)D3水平，該法抗干擾能力強，且靈敏度、特異度、準確性和重現(xiàn)性均很好，但通量低(標本前處理耗人工和時間)、儀器昂貴，且需要專業(yè)操作人員，這在一定程度上限制了它的使用。由于市面上供應的VitD補充劑包括植物來源的VitD2和動物來源的VitD3，因此，為了保證兩種來源的VitD補充劑水平均能被準確檢測出，國際上推薦應該同時檢測25(OH)D2和25(OH)D3[20]，這就意味著臨床VitD檢測應該首選LC-MS/MS，且要求該方法能夠區(qū)分25(OH)D的C3-差向異構體(可通過調整反相色譜柱，延長運行時間來解析C3-差向異構體)，以消除C3-差向異構體對25(OH)D2和25(OH)D3的干擾，從而避免對25(OH)D的高估。

2.3血液循環(huán)結合VitD、游離VitD及生物可利用VitD解讀 上述檢測方法主要用來檢測總25(OH)D、25(OH)D2、25(OH)D3和1,25(OH)2D水平，其在血液循環(huán)中還可進一步細分為結合和游離2個部分，其中有85%～90%的25(OH)D/1,25(OH)2D主要與DBP結合，此外還有10%～15%的25(OH)D/1,25(OH)2D與清蛋白(ALB)結合，而游離VitD(即與DBP和ALB均不結合的循環(huán)VitD)僅占很小一部分，不到1%[游離25(OH)D約占0.03%，游離1,25(OH)2D約占0.40%]。生物可利用VitD(BAVD)是由游離25(OH)D和25(OH)D與ALB結合2個部分共同組成，因為與ALB結合的部分易發(fā)生解離，使其可穿過細胞膜。因此，BAVD可進入細胞以進一步產生具有內分泌或旁分泌作用的活性代謝產物1,25(OH)2D。

根據(jù)以上內容可間接估算出游離25(OH)D水平：游離25(OH)D=[25(OH)D2+25(OH)D3]×0.03%。此外，游離25(OH)D水平也可以采用商業(yè)化的ELISA試劑盒或LC-MS/MS方法直接測得。早期游離25(OH)D水平是使用來自Bikle DD的公式[21]間接估算可得：游離25(OH)D=總25(OH)D/(1+KaALB×CALB+KaDBP×CDBP)，其中KaALB和KaDBP代表各自的親和常數(shù)，CALB和CDBP代表各自的水平，采用此公式計算有一個前提是Ka不變。游離1,25(OH)2D水平也可使用此公式計算。當知曉游離25(OH)D水平后，BAVD可以通過以下公式計算得出：BAVD=(KaALB×CALB×1)-游離25(OH)D[22]。

2.4VitD參考范圍 25(OH)D是人體循環(huán)VitD水平的主要儲存形式，約占總VitD的95%及以上，因其半衰期長，達14～21 d，且不受循環(huán)系統(tǒng)中血Ca和PTH水平影響，因此其被公認為是評價受試者VitD營養(yǎng)狀況最客觀的指標。美國醫(yī)學研究所(IOM)[23]和美國內分泌學會臨床應用指南(EnS)[11]制定的一般人群和高風險人群VitD的參考范圍見表2，需注意表中VitD特指血清25(OH)D水平，即25(OH)D2與25(OH)D3之和。

表2 血清VitD的參考范圍

注：1 ng/mL=2.5 nmol/L。

3 VitD與CKD

3.1CKD患者常見原發(fā)疾病及并發(fā)癥 CKD的臨床特征是患者腎功能逐漸喪失，表現(xiàn)為腎結構和腎功能的不可逆性改變。引起CKD發(fā)生的常見原發(fā)疾病主要包括：糖尿病腎病、高血壓腎病、微小病變和慢性腎小球腎炎等。這類患者隨著腎臟功能下降，可導致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進、心血管疾病、礦物質和/或骨代謝紊亂等并發(fā)癥。

3.2CKD患者VitD水平 國內外許多臨床研究表明，CKD患者可能是VitD缺乏或不足的高危人群：我國南方FENG等[9]和FENG等[10]的觀察性研究結果顯示，1～2期CKD患者VitD不足和缺乏可達92.3%，其中52.5%的患者為VitD不足，39.8%的患者為VitD缺乏；3～5期透析前CKD患者VitD不足和缺乏高達96.7%，其中57.2%的患者為VitD不足，39.5%的患者為VitD缺乏；并且還發(fā)現(xiàn)4期和5期CKD患者血清25(OH)D水平低于3期CKD患者。新加坡3～5期透析前CKD患者VitD不足和缺乏可達86.8%，其中57.7%的患者為VitD不足，29.1%的患者為VitD缺乏[24]。尼泊爾成人腎移植受者中VitD不足和缺乏可達72.6%，其中53.8%的患者為VitD不足，18.8%的患者為VitD缺乏[25]。韓國1～5期透析前CKD患者VitD缺乏的患病率為70.2%[26]。意大利CKD兒童患者25(OH)D缺乏的患病率為32.0%，其中5期CKD透析患者占51%[8]。由此可見，低血清25(OH)D水平在CKD患者中極為常見。

3.3影響CKD患者VitD水平的因素 在CKD患者中，由于腎功能障礙導致VitD代謝失調，使VitD、Ca、P、PTH和FGF-23之間的相互作用被破壞，最終導致1,25(OH)2D循環(huán)水平降低,其可能原因有：日曬不足，導致通過光照經皮膚合成的1,25(OH)2D減少；皮膚色素沉著過度及限制進食富含VitD食物等因素，減少了1,25(OH)2D的內源性合成；腎小球濾過率逐漸降低限制了底物25(OH)D向1α-羥化酶的遞送，從而減少了1,25(OH)2D的產生；VitD受體水平降低；內吞性受體巨蛋白減少使25(OH)D-DBP復合物重吸收至近端腎小管受阻，導致25(OH)D-DBP復合物在尿中排泄增加，使底物25(OH)D相對減少，最終導致1，25(OH)2D生成減少；尿中DBP的排泄丟失；有效腎單位減少限制了腎近端管狀細胞中1α-羥化酶的數(shù)量；腎功能下降導致的磷酸鹽持續(xù)保留和FGF-23水平增加；增加的FGF-23直接抑制CYP27B1和促進CYP24A1酶活性，使1,25(OH)2D合成減少。

有研究表明，影響CKD患者VitD缺乏的危險因素有：低堿性磷酸酶、高清蛋白、高總膽固醇[27]和高全段甲狀旁腺激素水平等[25]。然而，VitD缺乏與腎小球濾過功能間的關系尚存爭議。據(jù)報道，3～5期透析前CKD患者血清25(OH)D水平隨著估計腎小球濾過率(eGFR)降低而下降[10]。然而，也有研究認為，血清25(OH)D水平隨eGFR下降而增加，甚至有研究認為25(OH)D和/或1,25(OH)2D水平與eGFR無關[25,28]。還有研究發(fā)現(xiàn)，eGFR下降與VitD缺乏呈正相關，但該學者經過對基線eGFR進行校正后發(fā)現(xiàn)，eGFR下降與VitD缺乏無關，因此認為基線eGFR水平可能混淆了25(OH)D與eGFR的關系[29]。

3.4VitD及其類似物的腎臟保護作用 CKD的標志是蛋白尿、腎小球硬化和腎小管間質纖維化。同時，腎臟也是VitD代謝的靶器官。除了經典的Ca和P調節(jié)外，VitD也是細胞炎性反應、細胞增殖分化和細胞凋亡的重要調節(jié)因子。VitD及其類似物主要通過減少蛋白尿排泄(抑制足細胞損傷)、抑制腎小球硬化(抑制細胞增殖和阻滯細胞周期)、抑制腎小管間質纖維化、抑制炎性反應和阻滯腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，以此防止或減輕腎損傷，從而延緩CKD病情進展，實現(xiàn)對腎臟的潛在保護作用。

綜上所述，VitD缺乏不僅在人群中廣泛存在，而且也是導致腎功能損傷，促進CKD患者疾病發(fā)展和高致死率的危險因素。因此，血清VitD亞組分的檢測作為CKD發(fā)生和發(fā)展?jié)撛诘纳飿酥疚?，可能對CKD早期診斷、療效監(jiān)測和預后評估等有重要臨床意義。