電化學(xué)發(fā)光法測定鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原的性能驗證

杜秀環(huán)，陶 耕

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，福建泉州 362000

鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCCA)是1977年由KATO等[1]從子宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌組織分離的TA-4的一個亞片段，TA-4是相對分子質(zhì)量為48×103的糖蛋白，該蛋白是一種癌抗原。SCCA以SCCA1和SCCA2兩種亞型存在,兩種亞型均在肺、外陰、宮頸下部、食管和皮膚的鱗狀上皮細(xì)胞中共同表達(dá)，而且均可在血清中被檢測到。在鱗狀上皮細(xì)胞癌(SCC)，特別是肺癌、宮頸癌患者血液中兩種SCCA亞型水平均有升高。近年來眾多文獻(xiàn)表明，SCCA血清水平與肺癌和宮頸癌的腫瘤分期、大小、治療后殘余腫瘤、復(fù)發(fā)或進(jìn)展、生存率相關(guān)[2-4]。德國羅氏診斷公司近來推出電化學(xué)發(fā)光法檢測SCCA試劑盒，本實驗室擬開展此項目，根據(jù)ISO15189實驗室認(rèn)可的要求[5]，驗證檢測系統(tǒng)的基本分析性能符合本實驗室及臨床需求，與廠家資料一致，才可用于臨床檢測。因此,本實驗室對羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測SCCA的精密度、正確度、線性范圍、參考區(qū)間及可報告范圍進(jìn)行驗證,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年8月1日至11月30日在本院就診的患者和健康體檢者血清，標(biāo)本無溶血、黃疸及乳濁。

1.2儀器與試劑 羅氏公司Cobas e601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，所用試劑為其原裝配套試劑(批號32267301)、標(biāo)準(zhǔn)品(批號33315501)、質(zhì)控品(批號29984599)。

1.3方法

1.3.2正確度驗證 根據(jù)CLSI EP15-A3文件要求[6]，選擇德國羅氏公司提供的具有定值的兩種濃度質(zhì)控品，連續(xù)檢測3次，取平均值，計算其絕對值和相對偏差，絕對值=測定值-靶值，相對偏差=絕對值/靶值×100%。若相對偏差<1/2允許總誤差(TEa),結(jié)果可接受，其正確度被認(rèn)可。

1.3.3線性范圍驗證 根據(jù)NCCLS EP6-A文件要求[7]，選擇低濃度(L)和高濃度(H)兩種濃度的患者標(biāo)本各1份，并且要求其分別接近廠家提供的參考范圍的下限和上限，按5L、4L+H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H配制成6種濃度的血清，每種濃度的血清連續(xù)檢測2次，取其平均值作為實測值，并計算每種濃度的預(yù)期值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：將實測值與預(yù)期值進(jìn)行回歸統(tǒng)計，若斜率在0.97～1.03,r2≥0.975 0，則為線性范圍驗證通過。

1.3.4參考區(qū)間驗證 選擇本院健康體檢者血清標(biāo)本20份，男女各10份，年齡18～65歲。參考NCCLS C28-A2文件[8]，如果20例受試者中≤2例的檢測結(jié)果不在廠家提供的參考區(qū)間內(nèi)，則說明本實驗室可直接引用試劑說明書提供的95%置信區(qū)間。

1.3.5可報告范圍驗證 收集臨床高值標(biāo)本1份，其濃度為60 ng/mL,用廠家配套的稀釋液分別以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16進(jìn)行手工稀釋，并重復(fù)檢測2次，取其平均值，同時將高值標(biāo)本原倍檢測2次，取其平均值作為標(biāo)本靶值。根據(jù)稀釋倍數(shù)計算其目標(biāo)值，回收率=測定均值/目標(biāo)值×100%，回收率允許誤差為80%～120%。回收率在允許誤差范圍的最大稀釋比例參考臨床可報告范圍上限計算?？蓤蟾娣秶舷?最大稀釋倍數(shù)×標(biāo)本靶值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel 2007軟件及SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析處理，計算相關(guān)系數(shù)和回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1精密度驗證 見表1。SCCA低值和高值質(zhì)控血清批內(nèi)CV分別為2.19%、1.20%，均小于廠家試劑說明書的5.00%、6.50%；批間CV分別為5.43%、2.72%，符合廠家提供的批間CV<10.00%。

表1 批內(nèi)及批間不精密度比較

2.2正確度驗證 見表2。SCCA低值和高值質(zhì)控血清測定均值均在允許范圍內(nèi)，其相對偏差分別為3.68%、0.98%，相對偏差均小于1/2TEa,驗證通過。

表2 正確度驗證結(jié)果

2.3線性范圍驗證 不同濃度范圍血清檢測均值與理論值見表3，以理論值為Y，實測值為X進(jìn)行回歸分析得線性方程：Y=1.020 3X-0.277 9,r2=0.998 5，見圖1。其斜率為0.97～1.03,r2>0.975 0,驗證試驗得出的線性范圍為0.14～58.12 ng/mL，與廠家說明書提供的結(jié)果(0.10～70.00 ng/mL)比較一致。

表3 線性范圍驗證結(jié)果(ng/L)

2.4參考區(qū)間驗證 廠家試劑說明書提供的中國健康個體95%參考范圍為2.7 ng/mL(95%CI:2.2～3.3 ng/mL),此次驗證試驗20例健康體檢者SCCA檢測值為0.98～2.01 ng/mL，均在廠家聲明的參考區(qū)間范圍內(nèi)，說明實驗室可直接引用廠家提供的參考區(qū)間。

圖1 線性范圍回歸分析

2.5可報告范圍驗證 收集到的臨床高值標(biāo)本濃度及其各稀釋梯度的檢測結(jié)果見表4，各稀釋梯度檢測結(jié)果的回收率均在80%～120%，最大稀釋比例為1∶16，可報告范圍上限為59×16=944.00 ng/mL。

表4 可報告范圍驗證結(jié)果

3 討 論

SCCA的生物功能是抑制酶活性，SCCA1能抑制木瓜蛋白酶類半胱氨酸蛋白酶，SCCA2能抑制糜蛋白酶類絲氨酸蛋白酶、組織蛋白酶G和胃促胰酶。在正常鱗狀上皮細(xì)胞中，SCCA可抑制細(xì)胞凋亡和參與鱗狀上皮分化，而在鱗狀上皮細(xì)胞癌中，其參與腫瘤細(xì)胞的生長增殖[9-10]，是反映鱗癌生物學(xué)特性的重要腫瘤標(biāo)志物之一。目前，SCCA已廣泛應(yīng)用于鱗癌特別是肺癌和宮頸癌的疾病診斷、病情監(jiān)測及療效評價。

目前，用于檢測SCCA的免疫放射法因放射性同位素的輻射影響已逐漸遭到淘汰，而ELISA重復(fù)性差，操作復(fù)雜，線性范圍窄，現(xiàn)較多實驗室使用的是精確度高、檢測快速的化學(xué)發(fā)光免疫分析法。電化學(xué)發(fā)光免疫分析是繼放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析之后發(fā)展起來的一項最新免疫測定技術(shù)，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)且檢測快速，為免疫診斷提供了一個新方向。電化學(xué)發(fā)光法檢測SCCA能以等摩爾方式檢測人血清和血漿中SCCA總量(SCCA1和SCCA2)。根據(jù)ISO15189：2007《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》要求，臨床實驗室在使用新的檢測試劑或系統(tǒng)時，應(yīng)對廠家聲明的各項性能指標(biāo)進(jìn)行驗證。本研究主要針對電化學(xué)發(fā)光法檢測SCCA的精密度、正確度、線性范圍、參考區(qū)間及可報告范圍進(jìn)行驗證。

在正確度驗證試驗和精密度驗證試驗中，本研究均采用了試劑配套的質(zhì)控品。正確度是檢測結(jié)果與被測量物真值之間的接近程度，以偏差來表示，偏差越大正確度越差。在正確度驗證檢測中，將檢測結(jié)果與廠家給定的質(zhì)控品靶值進(jìn)行比較，其低值與高值檢測結(jié)果均在允許范圍內(nèi)，相對偏差分別為3.68%和0.98%，均小于1/2TEa，表明該檢測系統(tǒng)性能良好，正確度較高。精密度是在規(guī)定條件下獲得的獨立測量結(jié)果之間的接近程度，通常用CV表示。在該驗證試驗中，SCCA低值與高值質(zhì)控品批內(nèi)CV分別為2.19%、1.20%，批間CV分別為5.43%、2.72%，均小于廠家提供的參數(shù)。低值SCCA批間CV相對較高，可能與其濃度較低及揮發(fā)有關(guān)。

線性范圍是整個檢測系統(tǒng)對應(yīng)于系列分析濃度的儀器最終輸出的信號間是否呈恒定比例的性能，是一項很重要的檢測系統(tǒng)性能分析指標(biāo)。每個實驗室的檢測系統(tǒng)實際條件各不相同，因此，應(yīng)建立自己的線性參數(shù)，不應(yīng)該直接引用廠家的線性范圍。本研究的線性范圍為0.14～58.12 ng/mL，與廠家說明書提供的0.10～70.00 ng/mL比較一致，因此高于此檢測上限的標(biāo)本應(yīng)進(jìn)行稀釋后再測定，才能得到可靠的結(jié)果。由于各個地區(qū)環(huán)境、人們生活習(xí)慣等不同，因此生理生化指標(biāo)也不同，推薦每個實驗室應(yīng)根據(jù)目標(biāo)人群建立各自的期望參考范圍。由于試劑成本較高，以及各方面因素限制，本實驗室擬采用試劑說明書提供的參考區(qū)間并進(jìn)行驗證。本研究選取的20例健康個體SCCA檢測結(jié)果均在廠家提供的參考區(qū)間內(nèi)，因此，本實驗室可直接引用試劑說明書提供的95%置信區(qū)間。在可報告范圍驗證中，由于可收集到的高值標(biāo)本受限，只收集到60.00 ng/mL標(biāo)本1例，用此標(biāo)本進(jìn)行驗證得到SCCA的可報告范圍上限為944.00 ng/mL。

綜上所述，電化學(xué)發(fā)光法檢測SCCA的主要性能指標(biāo)達(dá)到了廠家說明參數(shù)或相關(guān)指標(biāo)，能滿足臨床檢測的要求，可用于臨床檢測。