223例兒童白血病30種融合基因檢測結(jié)果分析

黃倩雯，陳海雷，黃 燕，沈妙娜，劉 勇

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科血液室，廣東廣州 510120

兒童白血病在兒童惡性腫瘤中所占比例最高，且發(fā)生率呈逐漸上升趨勢[1]。目前采用MICM分型對初診患兒進(jìn)行實驗室診斷和分型，使白血病的診斷從細(xì)胞形態(tài)學(xué)水平上升到分子生物學(xué)水平，不僅對研究白血病發(fā)病、復(fù)發(fā)、耐藥機(jī)制和生物學(xué)特征有重大意義，而且對指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后也有實用價值[2]。本研究對223例初發(fā)或復(fù)發(fā)的血液腫瘤患兒進(jìn)行回顧性分析，以明確30種融合基因篩查在兒童白血病腫瘤中的分布情況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 對2017年5月至2019年4月本院223例初發(fā)或復(fù)發(fā)白血病患兒進(jìn)行回顧性分析，其中男124例，女99例，年齡1個月至14歲，平均(5.5±3.2)歲。采用實時熒光探針PCR進(jìn)行融合基因檢測，包括急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)常見的如BCR-ABL1、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、MLL和PML-RARα相關(guān)等30種融合基因，見表1。

表1 PCR反應(yīng)液及融合基因檢測

續(xù)表1 PCR反應(yīng)液及融合基因檢測

1.2方法

1.2.1免疫分型和細(xì)胞遺傳學(xué) 選取肝素鈉抗凝骨髓2～3 mL，予PBS清洗2遍后進(jìn)行計數(shù)，每管控制細(xì)胞數(shù)在5×105～1×106個，采用四色直接免疫熒光法標(biāo)記，包括B系、T系和髓系的常用抗體，如CD3、CD8、CD19、CD20、CD33和CD117等40種，采用流式細(xì)胞儀FACSCalibur(美國BD公司)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢測。同時進(jìn)行染色體核型分析和FISH探針分析，包括N-MYC、TCF-PBX1、ETO-AML1、PML-RARα、CBFβ-inc(16)、MLL、BCR-ABL、TEL-AML1、CCND-IgH、ALK和MALT1等。

1.2.2RNA提取及濃度測定 取EDTA抗凝骨髓200 μL，按照TIANGEN醫(yī)藥有限公司的RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取，使用nanodrop測定RNA濃度，其A260/A280應(yīng)在1.9～2.1，A260/A230≥2.0，濃度應(yīng)>0.02 μg/μL。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄 采用廈門至善生物醫(yī)藥有限公司的30種白血病相關(guān)融合基因試劑提取盒進(jìn)行檢測，首先將反轉(zhuǎn)錄試劑及LF Positive Control裂解，然后配制反轉(zhuǎn)錄體系，將配制好的反轉(zhuǎn)錄體系按照37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄完畢后，取10 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入40 μL H2O，經(jīng)該試劑盒中內(nèi)參檢測Ct值≤30時，該標(biāo)本RNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA方可進(jìn)入后續(xù)的融合基因相關(guān)檢測。

1.2.4檢測體系配制 取出試劑盒中各種反應(yīng)液室溫融化，并振蕩混勻后，離心數(shù)秒，每個樣品使用A～H 8管PCR mix檢測。根據(jù)樣品數(shù)量n，分別配制8管mix。取n×19.8 μL mix和n×0.2 μL LF polymerase加到1.5 mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，離心。將配好的A～H 8管mix分別以20 μL分裝于PCR管中。取5 μL稀釋好的樣品或陰、陽性對照cDNA加到每個PCR反應(yīng)管中，離心數(shù)秒。

1.2.5PCR擴(kuò)增與分析 采用ABI7500儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：預(yù)變性50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；Touchdow循環(huán)：95 ℃ 20 s，65 ℃ 1 min(每個循環(huán)下降1 ℃)，72 ℃ 1 min，10個循環(huán)；PCR循環(huán)：95 ℃ 20 s，56 ℃ 32 s(4通道采光，F(xiàn)AM、HEX、ROX、Cy5)，72 ℃ 1 min。擴(kuò)增結(jié)束后在擴(kuò)增曲線界面進(jìn)行分析。以軟件默認(rèn)設(shè)定3～15個循環(huán)的平均熒光信號為基線，在陰性對照無擴(kuò)增情況下，閾值設(shè)定在無擴(kuò)增曲線樣本的最高點，且以陰性對照未檢出為原則，確定起始閾值。

2 結(jié) 果

2.130種融合基因篩選診斷情況 223例初發(fā)或復(fù)發(fā)白血病患兒進(jìn)行30種融合基因篩選，綜合MICM國際通用的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)最終診斷分布為：B-ALL 152例，T-ALL 9例；AML 49例；其他13例，分別為非霍奇金淋巴瘤B系(B-NHL)2例，非霍奇金淋巴瘤T系(T-NHL)1例，混合型急性白血病1例，分類不明急性白血病2例，幼年型粒單核細(xì)胞白血病(JMML)1例，慢性粒細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)AML1例，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)5例。

2.2融合基因陽性分布特點 223例患兒中融合基因陽性率為43.0%(96/223)，其中B-ALL陽性率為32.2%(49/152)，T-ALL陽性率為22.2%(2/9)；AML陽性率為75.5%(37/49)；其他病例陽性率為61.5%(8/13)。ALL中最常見的融合基因陽性率分別為：TEL-AML1 15.5%(25/161，BCR-ABL1 4.3%(7/161)，E2A-PBX1 3.7%(6/161)，AML-MTG16 1.9%(3/161)，MLL-AF4、MLL-AF10、MLL-ENL、TLS-ERG、MLL-AF6均為1.2%(2/161)；AML中最常見的融合基因陽性率分別為：AML1-ETO20.4%(10/49)，PML-RARα16.3%(8/49)，CBFβ-MYH11 10.2%(5/49)，DEK-CAN6.1%(3/49)，MLL-AF10 8.2%(4/49)，MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF1p、NPM-MLF、TEL-ABL、SET-CAN、BCR-ABL1均為2.0%(1/49)。SIL-TAL1見于B-ALL，而MLL-AF4和MLL-AF10在ALL和AML中均可出現(xiàn)。

2.3融合基因與免疫分型的關(guān)系 分別選取本研究中ALL和AML最常見的兩種融合基因TEL-AML1和AML1-ETO，對其免疫分表型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，24例TEL-AML1陽性病例中有22例免疫表型為com-B-ALL,僅2例為Pre-B-ALL，共同特點為CD45陰性，TdT陽性，無跨系表達(dá)；10例AML1-ETO陽性病例中有2例伴CD19跨系表達(dá)。

2.4融合基因與染色體核型分析和熒光原位雜交(FISH)的結(jié)果比較 96例融合基因陽性患兒同時進(jìn)行染色體和FISH檢測，染色體結(jié)果為異常核型43例，正常核型35例，另外18例因無分裂象等原因無結(jié)果；而FISH結(jié)果中58例異常，26例正常，12例無結(jié)果。在共同陽性的病例中，3種方法學(xué)融合基因和易位結(jié)果均一致。

3 討 論

過去幾十年，通過建立白血病危險因素和研究其生物學(xué)機(jī)制，兒童整個生存期已大為改善，分子遺傳學(xué)從基因途徑提供了有益信息。大部分白血病存在染色體結(jié)構(gòu)異常，包括缺失、重復(fù)、倒位、易位等，導(dǎo)致原癌基因及抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白。有些基因是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)基因發(fā)生變異時，產(chǎn)生白血病表型，直接影響下游信號傳遞途徑，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)、凋亡障礙、分化障礙等[3]。

有文獻(xiàn)報道，約有85%的兒童白血病可檢測出克隆型染色體異常，其中平衡性易位最為常見，并導(dǎo)致融合基因產(chǎn)生，融合基因特定易位的存在已證實在白血病的惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[4]。融合基因的檢測有助于兒童白血病的危險分層，判斷預(yù)后，并有助于選擇合適的化療方案。兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病中，最常見的是t(12；21)(p13；q22)染色體易位，形成融合基因TEL-AML1，其余較常見的如t(4；11)(q21；q23)染色體易位，形成MLL-AF4,嬰兒白血病發(fā)生率達(dá)60%以上[5]；t(1；19)(q23；p13)染色體易位形成E2A-PBX1，檢出率為5.8%[6]；t(9；22)(q34；q11)染色體易位形成BCR-ABL1，檢出率為3%～5%[7]。有研究表明，E2A-PBX1、BCR-ABL1與MLL-AF4轉(zhuǎn)歸類似，多數(shù)預(yù)后較差，并與疾病初診時的高白細(xì)胞計數(shù)和年齡偏大相關(guān)[8]。

根據(jù)文獻(xiàn)報道，MLL融合基因的多樣化是由于MLL伙伴基因可與30多種不同基因發(fā)生融合，常見的兩種MLL融合基因AF9和AF4在ALL和AML中均可發(fā)現(xiàn)，其中AF9常見于白血病M4、M5型，偶見于M1、M2型[9]。本研究中融合基因AF4和AF10陽性率較AF9高，且在ALL和AML中均有發(fā)生，AF9陽性只見于1例診斷為M4的患者中。MLL-AF10在ALL和AML中均有發(fā)生，其發(fā)病機(jī)制少見報道。TLS-ERG融合基因為較罕見的融合基因之一，在ALL和AML患兒中均可發(fā)生，根據(jù)北京兒童醫(yī)院血液腫瘤中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,該融合基因在兒童新診治的白血病中發(fā)生率僅為0.7%，對于ALL患兒的治療及預(yù)后影響不大，但伴有TLS-ERG融合基因的AML患兒治療困難，預(yù)后較差[10]。90%以上的CML患者存在Ph染色體及BCR-ABL1融合基因，治療關(guān)鍵在于慢性期是否能獲得分子水平的緩解，以甲磺酸伊馬替尼為代謝的酪氨酸激酶抑制劑，是CML的一線治療藥物[11]。

國外文獻(xiàn)報道，AML1-ETO常常伴有CD19表達(dá)[12]，本研究24例TEL-AML1病例中其免疫表型22例為com-B-ALL，且CD45陰性，TdT陽性，說明該融合基因可能僅出現(xiàn)在白血病的某一分化階段；而AML1-ETO常常伴有CD19的表達(dá)，與文獻(xiàn)[12]報道一致，因此通過確認(rèn)免疫分型的結(jié)果可預(yù)判推測某種融合基因陽性。

綜上所述，融合基因?qū)Π籽〉脑\斷、鑒別診斷及危險分層、預(yù)后評估、靶向治療均有重要指導(dǎo)意義，重視并加強(qiáng)對白血病30種融合基因的檢測，有助于提高兒童白血病的診治水平。