熔融尿素法提取羊毛角蛋白機制

薩如拉，趙雪梅，宮川剛，棚橋光彥

(1.赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000； 2.日本岐阜大學(xué) 應(yīng)用生物科學(xué)部，岐阜縣 岐阜市501-1193)

近年來，隨著人口增加和經(jīng)濟的發(fā)展，資源消耗越來越多，溫室效應(yīng)、熱帶雨林減少、酸雨等環(huán)境問題日趨嚴(yán)重。如何通過生物質(zhì)資源的有效利用來減輕環(huán)境負(fù)擔(dān)引起廣泛關(guān)注。

除木質(zhì)資源外，生物質(zhì)資源還包括大量的蛋白質(zhì)、纖維等資源。羊毛在紡織過程中會產(chǎn)生大量廢棄物，如羊毛屑和落毛，羊毛屑和落毛中摻雜垃圾和異物，染色時會出現(xiàn)著色濃淡不均勻等，不適合作為工業(yè)原料。另外，每年大量生產(chǎn)的含羊毛衣料等紡織品產(chǎn)生的廢棄物——羊毛纖維大部分被焚燒或填埋處理，沒有得到有效利用，不僅污染了環(huán)境，也浪費了大量的蛋白質(zhì)資源[1]。羊毛角蛋白是天然蛋白質(zhì)，有優(yōu)良的生物相容性和親膚性，無毒無刺激，且富含多種氨基酸，在紡織、生物醫(yī)用材料和化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)空間和巨大的應(yīng)用價值[2-3]。

為了減輕環(huán)境負(fù)擔(dān)，進行可持續(xù)性開發(fā)，有必要開發(fā)廢棄羊毛的有效利用方法。目前羊毛角蛋白的提取主要有酸堿法[4]、還原法[5]、離子液體法[6]、氧化法[7]等，但這些方法存在高溫、溶劑昂貴且危險、溶劑難去除、周期長、效率低、不適宜工業(yè)化生產(chǎn)等缺點[2]。熔融尿素法是一種新型的羊毛角蛋白提取技術(shù)，羊毛的整個溶解過程只使用尿素，不添加其他任何化學(xué)試劑，最終尿素還可回收循環(huán)利用，是一種高效、經(jīng)濟、安全、快速、環(huán)保、適合工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)。但是，尿素溶解羊毛的機制還未見詳細(xì)的報道，鑒于此，以羊毛為原料，采用熔融尿素法溶解羊毛并提取角蛋白，同時測定角蛋白的分子質(zhì)量。另外，以標(biāo)準(zhǔn)化合物為原料，替代羊毛角蛋白中的官能團及化學(xué)鍵與尿素進行反應(yīng)，分析官能團及化學(xué)鍵的變化及相應(yīng)的反應(yīng)路徑，為闡明羊毛角蛋白在熔融尿素中溶解原理提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑及儀器設(shè)備

材料：羊毛購買于日本毛絨株式會社。標(biāo)準(zhǔn)化合物：香草醛、香草醇、香草酸、乙酰香草醛、甲酰香草酸、4-乙酰-3-甲酰芥子酸、水楊酰苯胺、3,3-二羥基二苯二硫醚、苯胺、酪氨酸。試劑：尿素、乙酸乙酯、氯化鈉、硫酸鈉、丙酮、丙烯酸酯，化學(xué)試劑均為分析純。儀器設(shè)備：高溫油浴鍋、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)儀、日本島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS)-QP5050A、日本電子核磁共振裝置(CP/MAS13C-NMR) ECA 500MHz。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶解羊毛角蛋白的分子質(zhì)量測定 準(zhǔn)確稱量10 g尿素放入試管，然后放入150 ℃恒溫油浴鍋中讓尿素完全熔融，在熔融尿素中加入1 g羊毛，反應(yīng)20 min后取出試管，加入5 mL蒸餾水(防止尿素迅速凝固)，放入透析袋中透析24 h、過濾，沉淀物為非水溶性角蛋白，濾液為水溶性角蛋白[8]。將水溶性角蛋白用10% SDS-PAGE法測定其分子質(zhì)量。

1.2.2 尿素與標(biāo)準(zhǔn)化合物的化學(xué)反應(yīng)

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)化合物的選擇 為了分析熔融尿素溶解羊毛的反應(yīng)機理，分別選用香草醛、香草醇、香草酸、乙酰香草醛、甲酰香草酸、4-乙酰-3-甲酰芥子酸、水楊酰苯胺、3,3-二羥基二苯二硫醚、苯胺、酪氨酸等標(biāo)準(zhǔn)化合物來替代羊毛角蛋白中的官能團及化學(xué)鍵(為適應(yīng)GC-MS分析，所選用的化合物都帶苯環(huán))，與尿素進行化學(xué)反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)化合物對應(yīng)的官能團及化學(xué)鍵見表1。標(biāo)準(zhǔn)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)化合物對應(yīng)的官能團、化學(xué)鍵Tab.1 Functional groups, chemical bonds corresponding to standard compounds

圖1 標(biāo)準(zhǔn)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of standard compounds

1.2.2.2 尿素與標(biāo)準(zhǔn)化合物的化學(xué)反應(yīng)及分析方法 于干燥試管中加入2 g尿素，在150 ℃油浴鍋中加熱至尿素熔融，再加入0.2 g標(biāo)準(zhǔn)化合物，150 ℃反應(yīng)20 min，取出試管加入8 mL的蒸餾水，冷卻至室溫，加入乙酸乙酯10 mL，進行3次分液。有機層由20 mL的食鹽水脫水1次，再使用硫酸鈉脫水，過濾除去硫酸鈉、濃縮，加入丙酮(1 mg/mL)溶解，進行GC-MS分析。水層冷凍干燥，加入吡啶和無水乙酸各10 mL，放置24 h進行乙酰化、濃縮，GC-MS分析。

GC-MS分析條件：進樣溫度230 ℃，氣化室溫度300 ℃，初始溫度為100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min速率上升至300 ℃，保持5 min，分析時間為30 min[9]。

測定儀器為GCMS-QP5050A；電離模式: EI (電子電離)；電壓:70 eV；毛細(xì)管柱:DB-5MS (J&W)，0.25 mm(I.D.)×30 m(L)×0.5 μm(有機層)；毛細(xì)管柱:Rtx-5Amine(水層)；載氣：He；測定方法: 掃描。

另外，使用13C-NMR對酪氨酸與尿素反應(yīng)物的有機層(溶媒為重丙酮)進行分析[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解羊毛角蛋白的分子質(zhì)量測定結(jié)果

熔融尿素溶解羊毛的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2。水溶性角蛋白的分子質(zhì)量為75 ku，一般低分子角蛋白分子質(zhì)量為40～60 ku，所以溶解羊毛角蛋白仍然保持著較高分子狀態(tài)。因此，可以判斷水溶性角蛋白的一級結(jié)構(gòu)沒有被破壞，只是空間結(jié)構(gòu)被破壞。

圖2 溶解羊毛角蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis results of dissolved wool keratin

2.2 尿素與標(biāo)準(zhǔn)化合物的反應(yīng)結(jié)果

香草醛和尿素與香草醛反應(yīng)產(chǎn)物的有機層的氣相色譜(GC)比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖3，香草醛與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑如圖4。GC色譜中，保留時間6.0～7.0 min時出現(xiàn)了香草醛失去醛基的化合物峰，保留時間12.0～13.0 min時出現(xiàn)了香草醛峰。尿素中帶有獨立電子對的氮攻擊香草醛羰基碳導(dǎo)致醛基從香草醛脫離。

圖3 香草醛和尿素與香草醛反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)
Fig.3 Comparison of organic layer GC of vanillin and urea and vanillin reaction products and structureof peak-corresponding compounds

圖4 香草醛與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑Fig.4 Chemical reaction pathway of vanillin and urea

香草酸和尿素與香草酸反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖5，香草酸與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑如圖6。香草酸也在保留時間6.0～7.0 min時出現(xiàn)了失去羧基的化合物峰，保留時間在15.0 min時出現(xiàn)了香草酸峰。由于尿素中帶有獨立電子對的氮奪走香草酸羧基的氫而導(dǎo)致羧基的脫離。

乙酰香草醛和尿素與乙酰香草醛反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜的比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖7，乙酰香草醛與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑如圖8。乙酰香草醛和尿素反應(yīng)后出現(xiàn)了3個峰，在保留時間6.0～7.0 min時出現(xiàn)了香草醛失去醛基的化合物峰，在保留時間12.0～13.0 min時出現(xiàn)了香草醛的峰，在保留時間14.0～15.0 min時出現(xiàn)了乙酰香草醛的峰。這說明乙酰香草醛和尿素的反應(yīng)是逐步進行的，雖然醛基和乙?；紩撾x，但反應(yīng)性能更高的乙?；让撾x，醛基后脫離。乙?；拿撾x與醛基相同，尿素中帶有獨立電子對的氮攻擊香草醛羰基碳而導(dǎo)致乙酰基的脫離。

圖5 香草酸和尿素與香草酸反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)Fig.5 Comparison of organic layer GC of vanillic acid and urea and vanillic acid reaction product and structure of peak-corresponding compounds

圖6 香草酸和尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑Fig.6 Chemical reaction pathway of vanillic acid and urea

圖7 乙酰香草醛和尿素與乙酰香草醛反應(yīng)產(chǎn)物的有機層 GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)Fig.7 Comparison of organic layer GC of acetyl vanillin and urea with acetyl vanillin reaction products and structure of peak-corresponding compounds

圖8 乙酰香草醛與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑Fig.8 Chemical reaction pathway of acetyl vanillin and urea

4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽和尿素與4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖9，4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑如圖10。4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽與乙酰香草醛相同也失去了乙?；诒Ａ魰r間21.5～22.0 min時出現(xiàn)了4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽失去乙?；幕衔锓澹Ａ魰r間22.0～22.5 min出現(xiàn)了4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽的峰。乙?；拿撾x過程與乙酰香草醛相同。

圖9 4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽和尿素與4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)Fig.9 Comparison of organic layer GC of 4-acetyl-3-ethyl succinate and urea and 4-acetyl-3-ethyl succinate reaction product and structure of peak-corresponding compounds

圖10 4-乙酰-3-乙基芥子酸鹽和尿素反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)路徑Fig.10 Chemical reaction pathway of 4-acetyl-3- ethyl succinate with urea

香草醇和尿素與香草醇反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖11，香草醇與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑如圖12。在保留時間13.0 min時出現(xiàn)了香草醇的醇羥基被氨基取代的化合物峰，緊接著出現(xiàn)香草醇的峰，最后在保留時間21.0 min時出現(xiàn)香草醇和尿素反應(yīng)產(chǎn)物的峰。其反應(yīng)路徑為：香草醇酚羥基氧的獨立電子對依次被擠出去，導(dǎo)致醇羥基被脫離；尿素中的氮攻擊不穩(wěn)定的第7位碳，最終尿素與香草醇結(jié)合；脫離羥基的氧攻擊尿素香草醇化合物的羧基碳而導(dǎo)致尿素的一部分被脫離，形成了香草醇的醇羥基被氨基置換的化合物。

圖11 香草醇和尿素與香草醇反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)Fig.11 Comparison of organic layer GC of vanillyl alcohol and urea and vanillyl alcohol reaction products and structure of peak-corresponding compounds

圖12 香草醇和尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑Fig.12 Chemical reaction pathway of vanillyl alcohol and urea

苯胺和尿素與苯胺反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜的比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖13，苯胺與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑如圖14。GC色譜中保留時間5.0 min前出現(xiàn)苯胺的峰，15.0 min附近出現(xiàn)了苯胺與尿素結(jié)合的化合物峰。苯胺氨基的氮向尿素羰基碳攻擊而合成了尿素與苯胺結(jié)合的化合物。

圖13 苯胺和尿素與苯胺反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)Fig.13 Comparison of organic layer GC of aniline and aniline and urea reaction product and structure of peak-corresponding compounds

圖14 苯胺與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑Fig.14 Chemical reaction pathway of aniline and urea

酪氨酸和尿素與酪氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜的比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖15，酪氨酸與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑如圖16。通常酪氨酸幾乎不溶于丙酮，不出現(xiàn)在GC色譜中，但與尿素反應(yīng)后保留時間23.0 min附近出現(xiàn)了與環(huán)化尿素結(jié)合的酪氨酸峰。尿素與酪氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的有機層13C-NMR分析結(jié)果如圖17，從圖17可以確定尿素與酪氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。酪氨酸氨基的氮向尿素羰基碳攻擊而導(dǎo)致尿素向酪氨酸結(jié)合，尿素氨基氮向酪氨酸羧基的羰基碳攻擊而形成環(huán)化結(jié)構(gòu)。

圖15 酪氨酸和尿素與酪氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的有機層GC色譜比較與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)Fig.15 Comparison of organic layer GC of tyrosine and urea and tyrosine reaction products and structure of peak-corresponding compound

圖16 酪氨酸與尿素的化學(xué)反應(yīng)路徑Fig.16 Chemical reaction pathway of tyrosine and urea

尿素與香草酸甲酯、水楊酰苯胺、3,3-二羥基二笨二硫醚沒有產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，即肽鍵及二硫鍵沒有斷裂。

尿素與香草醇反應(yīng)產(chǎn)物的水層GC-MS分析結(jié)果與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)如圖18。保留時間7.5 min附近檢測出尿素的二聚體，所有標(biāo)準(zhǔn)化合物與尿素反應(yīng)產(chǎn)物的水層都相同，既沒有原料轉(zhuǎn)變的化合物，也沒有原料本身，有必要改善試驗方法進行進一步的研究。

圖17 尿素與酪氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的有機層13C-NMR分析結(jié)果Fig.17 Organic layer 13C-NMR analysis of urea and tyrosine reaction products

圖18 尿素與香草醇反應(yīng)產(chǎn)物水層GC-MS分析結(jié)果與峰對應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)Fig.18 GC-MS analysis of aqueous layer of urea and vanillin reaction products and structure of peak-corresponding compounds

3 結(jié)論與討論

為了探明熔融尿素中羊毛溶解的機制，首先進行了溶解羊毛角蛋白的分子質(zhì)量測定，其次，選用一些標(biāo)準(zhǔn)化合物，替代羊毛角蛋白中的官能團與化學(xué)鍵，與尿素進行化學(xué)反應(yīng)，分析了反應(yīng)過程中化學(xué)鍵、官能團的變化及相應(yīng)的反應(yīng)路徑。

通過SDS-PAGE測得的溶解羊毛角蛋白分子量為75 ku，一般低分子角蛋白分子質(zhì)量為40～60 ku[12]，由此可以判斷熔融尿素中溶解后的羊毛角蛋白保持較高分子狀態(tài)。標(biāo)準(zhǔn)化合物與尿素的反應(yīng)中，尿素與官能團及化學(xué)鍵產(chǎn)生多種化學(xué)反應(yīng)。主要化學(xué)反應(yīng)為醛基、芳香環(huán)連接的羧基、乙?；鶑臉?biāo)準(zhǔn)化合物脫離；醇羥基、氨基、碳鍵連接的羧基與尿素結(jié)合；含有肽鍵和二硫鍵的化合物與尿素不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，說明蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)沒有被破壞，與分子質(zhì)量測定結(jié)果一致。因此，羊毛在熔融尿素中溶解的主要途徑是以氫鍵的斷裂、官能團的脫離及尿素與官能團的結(jié)合等方式來完成的。另外，酪氨酸的氨基和羧基均跟尿素反應(yīng)形成環(huán)化結(jié)構(gòu)，才能溶于有機溶劑中，并從GC-MS的分析中能檢測。所有標(biāo)準(zhǔn)化合物與尿素反應(yīng)產(chǎn)物的水層中，既沒有原料轉(zhuǎn)變的化合物，也沒有原料本身，因此下一步有必要改善試驗方法進行進一步的研究。王麗靜等[2]采用熔融尿素法在150 ℃處理羊毛30 min提取角蛋白，所得分子質(zhì)量為 45.3～66.2 ku。房啟海等[3]采用熔融尿素法在160 ℃處理50 min提取角蛋白，所得分子質(zhì)量為25～37 ku。本研究中采用熔融尿素法150 ℃處理20 min，得到角蛋白的分子質(zhì)量為75 ku。這些結(jié)果表明，提取溫度和提取時間極有可能影響角蛋白的分子質(zhì)量。王麗靜[2]等采用ATR-FTIR 測試結(jié)果表明，熔融尿素法提取角蛋白分子結(jié)構(gòu)中仍然保留有二硫鍵，這與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究選用未知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化合物進行了試驗，雖然解釋了一些官能團的脫離、結(jié)合、化學(xué)鍵的反應(yīng)及分子質(zhì)量的大小等問題，但未解決羊毛角蛋白最終能否降解成氨基酸或短肽、尿素與氨基酸的詳細(xì)化學(xué)反應(yīng)路徑等問題。為了全面解釋羊毛在熔融尿素中的溶解機制，有必要選用分子質(zhì)量已知的蛋白質(zhì)及20種氨基酸為原料與尿素進行化學(xué)反應(yīng)，分析反應(yīng)過程及產(chǎn)物，更有必要優(yōu)化試驗方法及試驗條件。

隨著纖維產(chǎn)業(yè)的廢棄物、破舊的衣料等蛋白質(zhì)纖維日益增加，如何利用廢物纖維蛋白質(zhì)成為一個重要的課題，本研究利用熔融尿素法可以從廢棄的蛋白質(zhì)纖維中大量提取纖維蛋白質(zhì)，為下一步纖維蛋白的有效利用(比如加工成蛋白質(zhì)飼料或有機氮肥料等產(chǎn)品)提供了參考。