野大黃散提取物的毒性分析

田其真，蔡丙嚴，程 漢，郝福星，黃銀云

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

野大黃散提取物是將中藥野大黃散(野拔子、土大黃、癩蛤蟆草、苧麻根等組成)，經(jīng)水煮、蒸餾、醇沉、減壓干燥等工藝加工成的中藥復(fù)方制劑。野拔子，又名野壩子、野巴子，是云南的一種藥食同源植物，其味辛、涼，具有清熱解毒、疏風(fēng)解表、利濕、消食化積的功效[1]。野拔子水、醇提取物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，均具有較強的抑制作用[2]。土大黃為蓼科植物鈍葉酸模及羊蹄的根與根莖，其性涼，味辛、苦，具有清熱行瘀、殺蟲、解毒等功效[3]。土大黃的蒽醌類、黃酮類成分具有抗流感病毒、呼吸道合胞病毒及止咳平喘作用[4-5]。癩蛤蟆草，藥名為荔枝草，本品味苦、辛，性涼，歸肺、胃、腎經(jīng)，具有清熱解毒、利尿消腫、涼血止血等功效[6]。癩蛤蟆草提取物為黃酮類、萜類、揮發(fā)油類等多種類型的化合物，具有止咳平喘、抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑菌等多種藥理作用[7-8]。苧麻根是蕁麻科苧麻屬植物苧麻根莖，主要含黃酮類和三萜類化合物，具有清熱解毒、止血、止痛、抗病毒、安胎等功效[9-10]。獸醫(yī)臨床上對動物病毒性疾病常使用抗生素防止繼發(fā)感染，但抗生素過量使用帶來的耐藥性和藥物殘留問題日益突出。2018年4月，我國發(fā)布《關(guān)于開展獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作的通知》，明確了養(yǎng)殖業(yè)抗生素減用和限用的時間表。面對嚴格規(guī)范的獸藥管理政策，開發(fā)用于提高畜禽免疫力、增強動物抗病能力且低毒、低殘留的中藥制劑，是畜牧業(yè)防制疫病的有效途徑[11]。野大黃散提取物中的上述4味中藥成分，性味寒涼，具有清熱解毒、涼血止血及安胎等功效，符合中獸醫(yī)對病毒性疾病的治療原則。方中大部分藥物含有黃酮類、蒽醌類等生物大分子成分，具有抗炎、抗病毒、止咳平喘及止血等活性[12-13]。筆者所在課題組前期對野大黃散提取工藝進行了研究，制備了野大黃散提取物。通過觀察野大黃散提取物對小鼠的急性毒性和亞慢性毒性作用，評價其用藥安全性，旨在為野大黃散提取物的獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 野大黃散提取物

野大黃散提取物是將中藥野大黃散(中藥野拔子18 g、土大黃14 g、癩蛤蟆草24 g和苧麻根10 g)，經(jīng)水煮、蒸餾、醇沉、減壓干燥等工藝制備而成，復(fù)方提取物相當(dāng)于原生藥含量為1 g/mL。

1.2 試驗動物

健康昆明(KM)小鼠，體質(zhì)量(20±0.20)g，由揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2012-0004。飼養(yǎng)在室溫20～25 ℃的鼠籠中，自由采食和飲水，觀察適應(yīng)3 d。試驗給藥前停食12 h，給藥后4 h內(nèi)禁食，但不禁水。

1.3 主要試劑與儀器

天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)測定試劑盒，均購自江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司。小鼠分泌型球蛋白(sIgA)和血清IgG ELISA檢測試劑盒，均購自美國R D 公司。CPA電子天平為德國Sartorius公司產(chǎn)品，Exigo eos Vet動物血細胞分析儀為瑞典Exigo公司產(chǎn)品，D280全自動生化分析儀為江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Sunrise酶標(biāo)儀為瑞士Tecan公司產(chǎn)品。

1.4 急性毒性試驗

預(yù)試驗：取小鼠60只，雌雄各半，隨機分為A—F，共6組，每組10只，試驗前禁食12 h，不限制飲水。A—E組為給藥組，分別對應(yīng)野大黃散提取物1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 g/kg 5個劑量組，一次對各劑量組小鼠灌胃給藥0.8 mL/只，F(xiàn)組為對照組，灌服等體積生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，觀察記錄小鼠的飲食、行為變化、是否有中毒或死亡癥狀出現(xiàn)，統(tǒng)計各組死亡及存活數(shù)量，采用改良寇氏法計算半數(shù)致死量(Median lethal dose，LD50)。

正式試驗：取小鼠20只，雌雄各半，隨機分為2組，10只/組，試驗前禁食12 h，不限制飲水。給藥組以野大黃散提取物的最高質(zhì)量濃度(1 g/mL)，一次給藥0.8 mL/只，于24 h內(nèi)灌胃3次，每次間隔6 h，累積灌服的給藥總量為120 g/kg，即為最大耐受給藥量(Maximal tolerable dose，MTD)，對照組灌服等體積的生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，并記錄小鼠中毒癥狀及死亡情況。

1.5 亞慢性毒性試驗

取小鼠80只，雌雄各半，隨機分為4組，每組20只。A—C組為野大黃散提取物給藥組，分別以20 g/kg(高劑量)、10 g/kg(中劑量)及2 g/kg(低劑量)一次灌胃給藥0.8 mL/只，分別相當(dāng)于靶動物推薦劑量的100、50、10倍，連續(xù)給藥35 d，D組為對照組，灌服等體積的生理鹽水。試驗期間小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食，每日觀察精神狀態(tài)、行為反應(yīng)、糞便性狀等，每周稱體質(zhì)量。

1.5.1 樣品采集 在第35 天末次給藥后，對小鼠禁食不禁水12 h，稱取體質(zhì)量。摘眼球采血，每組采集18只小鼠的血液，其中抗凝血6份用于檢測血常規(guī)指標(biāo)，6份血清用于檢測生化指標(biāo)，6份血清用于檢測免疫學(xué)指標(biāo)。逐只剖檢小鼠，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、睪丸/子宮等稱質(zhì)量，計算臟器指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器濕質(zhì)量/體質(zhì)量)。對采集的臟器肉眼觀察，并采用福爾馬林溶液常規(guī)固定，進行病理組織檢查。

1.5.2 血常規(guī)檢測 用全自動血液分析儀檢測小鼠抗凝全血中的紅細胞數(shù)(RBC)、白細胞數(shù)(WBC)、淋巴細胞數(shù)(LYMPH)、單核細胞數(shù)(MONO)和中性粒細胞數(shù)(NEUT)。

1.5.3 血生化檢測 用全自動血生化分析儀測定血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素氮含量。

1.5.4 免疫學(xué)檢測 參照試劑盒說明書操作，分別檢測呼吸道、腸道sIgA和血清中的IgG免疫水平。

1.5.5 病理組織檢查 將采集的各臟器用福爾馬林溶液常規(guī)固定后，送至江蘇啟動子生物科技有限公司進行石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野大黃散提取物的急性毒性試驗

由表1可知，與生理鹽水對照組比較，野大黃散提取物給藥組在預(yù)試驗期間，小鼠采食、飲水、精神狀態(tài)、行為活動均未出現(xiàn)明顯異常，未發(fā)生中毒和死亡現(xiàn)象。分別從5.00、10.00、20.00 g/kg 3個劑量組中隨機選取3只小鼠脫臼處死，剖檢觀察心臟、肝臟、腎臟等臟器，均未見病理變化。小鼠給予野大黃散提取物前后的體質(zhì)量變化差異不顯著(P>0.05)。因此，無法確定野大黃散提取物的半數(shù)致死量，表明野大黃散提取物毒性極小。

表1 野大黃散提取物的急性毒性試驗結(jié)果Tab.1 Acute toxicity test results of Yedahuang powder extract

正式試驗期間，給藥組小鼠每天3次累積灌服120 g/kg的野大黃散提取物，與生理鹽水對照組比較，小鼠外觀、精神、行為、糞便等均無異常，各組小鼠均無死亡情況，剖檢各臟器均無肉眼可見病變。在無法確定半數(shù)致死量的情況下，測得MTD>120 g/kg，結(jié)果表明，小鼠的最大給藥量為120 g/kg，相當(dāng)于臨床用藥量0.2 g/kg的600倍，表明野大黃散提取物無毒性作用。

2.2 野大黃散提取物的亞慢性毒性試驗

2.2.1 小鼠臨床表現(xiàn) 與生理鹽水對照組比較，各給藥組小鼠采食、飲水、行為活動、糞便等均正常，且口角、眼、鼻等處無分泌物，體質(zhì)量增加，試驗過程中未出現(xiàn)死亡小鼠。

2.2.2 對小鼠體質(zhì)量的影響 由表2可知，與生理鹽水對照組比較，高劑量組與低劑量組在1～35 d體質(zhì)量差異不顯著，中劑量組至第21天后體質(zhì)量顯著上升(P<0.05)。

表2 野大黃散提取物對小鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effects of Yedahuang powder extract on body weight of mice g

注:同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note: Different letters in the same column show significant difference (P<0.05), the same below.

2.2.3 對小鼠臟器指數(shù)的影響 由表3可知，與生理鹽水對照組比較，僅中劑量給藥組小鼠脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，各組心臟、肝臟、肺臟、腎臟及胸腺指數(shù)等差異均不顯著。

2.2.4 對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 由表4可知，與生理鹽水對照組比較，中、低劑量給藥組小鼠淋巴細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，高劑量組中性粒細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，其余指標(biāo)均無顯著差異。

表3 野大黃散提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響Tab.3 Effects of Yedahuang powder extract on organ index of mice

表4 野大黃散提取物對小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of Yedahuang powder extract on blood routine indexes in mice

2.2.5 對小鼠血清生化指標(biāo)的影響 由表5可知，與生理鹽水對照組比較，各劑量給藥組天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素氮含量差異不顯著。

表5 野大黃散提取物對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of Yedahuang powder extract on serum biochemical indexes in mice

2.2.6 對小鼠免疫學(xué)指標(biāo)的影響 由表6可知， 與生理鹽水對照組比較，中劑量組、低劑量組呼吸道與腸道sIgA、血清IgG 差異顯著(P<0.05)。

表6 野大黃散提取物對小鼠免疫學(xué)指標(biāo)的影響Tab.6 Effects of Yedahuang powder extract on immunological indexes of mice ng/ml

2.2.7 對小鼠臟器組織的影響 用藥第35天時，將各試驗組小鼠頸椎脫臼處死，剖檢，小鼠各臟器組織均無肉眼可見病變。取各組小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、小腸、睪丸/子宮做組織病理切片，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，20 g/kg給藥組與生理鹽水對照組小鼠臟器組織鏡檢結(jié)果見圖1。由圖1可知，2組小鼠臟器組織結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)現(xiàn)顆粒變性、水泡變性和壞死點等變化。結(jié)果表明，2組小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、小腸、睪丸/子宮組織未出現(xiàn)明顯的病理變化。

3 結(jié)論與討論

急性毒性試驗是新藥生物安全評價的重要指標(biāo)，其結(jié)果不僅能確定受試藥物中毒作用方式和中毒反應(yīng)，也可為后續(xù)亞慢性毒性試驗劑量分組提供參考依據(jù)[14]。半數(shù)致死量是藥物體內(nèi)急性毒性試驗的關(guān)鍵指標(biāo)，也是對藥物急性毒性進行分級的標(biāo)準(zhǔn)[15]。本研究急性毒性試驗因受野大黃散提取物劑量和小鼠灌胃給藥的影響，無法給予小鼠更大劑量的藥物，無法測出其半數(shù)致死量。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WTO)有關(guān)外源性化學(xué)物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)和《保健食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》中所規(guī)定的藥物急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)半數(shù)致死量>15 000 mg/kg給藥劑量時，視為無毒[16]。本試驗中最大劑量組為20 000 mg/kg，因此可認定野大黃散提取物無毒。對無法測出半數(shù)致死量的藥物，根據(jù)中國新獸藥研發(fā)規(guī)范與申報指南的要求，需測定其最大耐受給藥劑量[17]。本試驗中小鼠最大耐受給藥劑量為120 g/kg，相當(dāng)于靶動物推薦臨床用藥0.2 g/kg的600倍，試驗7 d內(nèi)均未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)和死亡現(xiàn)象，且采食、飲水和排便等活動正常，各臟器剖檢未見無明顯的病理學(xué)變化。說明野大黃散提取物對小鼠無急性毒性及致死性損傷，屬于實際無毒中藥制劑。

A—D分別為高劑量給藥組心臟、肝臟、腎臟、脾臟；E—H分別為對照組心臟、肝臟、腎臟、脾臟I—L分別為高劑量給藥組肺臟、小腸、睪丸、子宮；M—P分別為對照組肺臟、小腸、睪丸、子宮A—D:Heart,liver,kidney and spleen in the high dose group; E—H:Heart,liver,kidney and spleen in the control groupI—L:Lung,intestine,testis and uterus in the high dose group; M—P:Lung,intestine,testis and uterus in the control group圖1 野大黃散提取物高劑量組小鼠各臟器組織病理學(xué)變化(400×)Fig.1 Histopathological changes of various organs of mice in high dose group of Yedahuang powder extract(400×)

亞慢性毒性試驗是評價藥物或毒物亞慢性危害的主要依據(jù)，可判斷藥物對靶器官和受試動物的累積作用，并明確安全的可重復(fù)給藥劑量值區(qū)間[18-21]。為更好地發(fā)現(xiàn)藥物的亞慢性毒性作用，在亞慢性毒性試驗中，小鼠連續(xù)以灌胃方式給藥35 d，較一般采用的28 d喂養(yǎng)試驗多7 d。試驗期間野大黃散提取物各劑量組小鼠均未出現(xiàn)死亡及明顯的中毒反應(yīng)，采食、飲水、行為活動均無異常。與生理鹽水對照組比較，各劑量給藥組小鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟等組織剖檢形態(tài)完好，組織切片鏡檢均無顯著的病理學(xué)變化。脾臟指數(shù)與血液中淋巴細胞數(shù)均屬于免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)[22]，臟器指數(shù)結(jié)果表明，中劑量給藥組能顯著提高脾臟指數(shù)。血常規(guī)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，給藥組中、低劑量均能提升小鼠淋巴細胞數(shù)，表明野大黃散提取物中、低劑量有刺激淋巴細胞增殖作用。高劑量組中性粒細胞數(shù)升高,表明小鼠有輕微的炎癥反應(yīng)，可能是長期的灌胃給藥刺激所致。藥物亞慢性毒性試驗中檢測靶動物的血生化指標(biāo)，可作為判定藥物對主要臟器是否具有毒性的重要依據(jù)[23]。通常天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素氮和肌酐是評價心臟、肝臟、腎臟功能是否正常的重要血生化指標(biāo)[24-25]。血生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，野大黃散提取物各劑量給藥組與生理鹽水對照組天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酐、尿素氮差異不顯著，提示野大黃散提取物對心臟、肝臟、腎臟等臟器無明顯的損傷作用。血清免疫學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，野大黃散提取物對灌胃小鼠的呼吸道、腸道sIgA及血清中IgG水平具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，但具體調(diào)節(jié)機制尚需進一步研究。

通過觀察灌胃給藥后小鼠的臨床表現(xiàn)、體質(zhì)量、臟器指數(shù)、組織病理學(xué)變化，以及測定血清生化和免疫學(xué)等多項指標(biāo)，綜合判定野大黃散提取物的毒性。結(jié)果表明，野大黃散提取物無毒副作用，是安全性較高的中藥制劑。