黃連解毒散和黃霉素對(duì)不同日齡肉雞回腸菌群結(jié)構(gòu)的影響

袁 林，李萬利，杜晨紅，王志祥，易寶弟，王明發(fā)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

歐洲養(yǎng)殖業(yè)自20世紀(jì)40年代開始在家禽飼料中添加抗生素，家禽的生長(zhǎng)速度和抗病性得到顯著提高[1]。然而，抗生素的廣泛使用卻帶來了一系列明顯的副作用，如耐藥性、過量的藥物殘留和消費(fèi)者的過敏反應(yīng)[2]。20世紀(jì)80年代，歐洲和美國(guó)對(duì)使用抗生素作為飼料添加劑做出了各種嚴(yán)格規(guī)定。1999年，歐盟禁止使用泰樂菌素、螺旋霉素、桿菌肽和維吉尼霉素等抗生素作為飼料添加劑。自2006年以來，歐盟成員國(guó)已完全停止使用所有的抗生素飼料添加劑，包括離子型抗生素[3]。2011年，歐盟宣布了針對(duì)抗微生物耐藥性的行動(dòng)計(jì)劃，旨在確保在人類和牲畜中正確使用抗生素，并改進(jìn)對(duì)獸醫(yī)抗生素的監(jiān)測(cè)。

黃連解毒湯(Coptidis decoction for detoxification，CDD)是中國(guó)常用的一種方劑，是由黃連、黃芩、黃柏、梔子4種草藥成分按3∶2∶2∶3的比例混合而成的水提物。CDD最早是唐代王燾發(fā)現(xiàn)的，在醫(yī)學(xué)著作中也有提及。近年來，該藥廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床實(shí)踐[4]。CDD在中國(guó)已廣泛用于治療胃腸道疾病、炎癥、心血管疾病，以及阿爾茨海默病[5-7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實(shí)了CDD的多種生物學(xué)活性，如降低2型糖尿病患者的血糖和血脂水平[8-9]，增加腦血流量，抑制血小板聚集，降低高血壓，改變自發(fā)性高血壓大鼠的基因表達(dá)譜[10-11]，通過抑制脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)形成和過氧化反應(yīng)，減少肝臟中甘油三酯的積累，從而預(yù)防動(dòng)脈硬化[5,12-14]。一些研究也證實(shí)了CDD的抗炎作用[8,15-16]。此外，在鯔魚養(yǎng)殖中，飼料中添加1%的CDD可以有效預(yù)防加格氏乳球菌感染，顯示了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的作用[17]。黃連解毒散(Coptidis powder for detoxification，CPD)為CDD的改良方劑，是由黃連、黃芩、黃柏、梔子按2∶4∶4∶3的比例混合而成的粉劑。在獸醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)中，CPD廣泛用于治療敗血癥、痢疾等急性炎癥[18]。黃霉素(Flavomycin,FLA)是一種磷酸多糖抗生素，通過干擾肽聚糖的生物合成來抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，肽聚糖是細(xì)胞壁的一種結(jié)構(gòu)成分[19]。黃霉素作為飼料添加劑在畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用由來已久。細(xì)菌對(duì)黃霉素的抵抗力較低，且黃霉素與其他抗生素的交叉抵抗也很少見。黃霉素的抗菌譜相對(duì)較窄，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效，但對(duì)革蘭氏陰性菌作用較弱[20-21]。不同種類的腸球菌對(duì)黃霉素的敏感性不同，例如黃霉素對(duì)糞腸球菌有明顯的抑制作用，但對(duì)屎腸球菌沒有這種抑制作用[22-23]。然而，關(guān)于FLA和CPD對(duì)家禽腸道菌群宏觀結(jié)構(gòu)調(diào)控作用的研究尚無報(bào)道。為此，采用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)測(cè)定16S rDNA區(qū)，研究FLA(5 mg/kg日糧)和CPD(1.25 g/kg日糧)對(duì)肉雞回腸微生物群的影響，揭示肉雞日糧中添加FLA提高肉雞生長(zhǎng)性能的作用機(jī)制，為中草藥添加劑CPD在肉雞日糧中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃霉素購(gòu)自德國(guó)赫斯特公司，黃連解毒散(商品名為驅(qū)疫健)購(gòu)自鄭州后羿制藥有限公司。

1.2 供試動(dòng)物與分組

選取180只1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞，隨機(jī)分成3組(每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只)，分別飼喂基礎(chǔ)飼糧(對(duì)照組，CK)、基礎(chǔ)日糧添加5 mg/kg FLA(FLA組)、基礎(chǔ)日糧添加1.25 g/kg CPD(CPD組)。飼養(yǎng)過程自由采食和飲水，并提供24 h人工光照。第1周溫度保持在35 ℃，之后每周逐漸降低3 ℃，直到22 ℃。所有日糧均以粉料進(jìn)行飼喂，基礎(chǔ)日糧成分及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。在試驗(yàn)的第21天和第42天，禁食12 h后對(duì)肉雞稱質(zhì)量，以重復(fù)為單位記錄采食量，計(jì)算平均日增質(zhì)量(ADG)和料肉比(FCR)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) Tab.1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

注：預(yù)混料為每千克飼糧提供維生素A 12 500 IU、維生素D33 000 IU、維生素E 20 IU、維生素K32.5 mg、維生素B12 mg、維生素B26 mg、維生素B63.5 mg、維生素B120.02 mg、D-泛酸12 mg、煙酸35 mg、葉酸1.5 mg、生物素0.2 mg、銅10 mg、鐵60 mg、鋅75 mg、錳100 mg、碘0.70 mg、硒0.15 mg。營(yíng)養(yǎng)水平均為計(jì)算值。
Note: The premix provides the following for per kg of the diet:VA 12 500 IU, VD33 000 IU, VE 20 IU, VK32.5 mg, VB12 mg, VB26 mg, VB63.5 mg, VB120.02 mg, D-pantothenic acid 12 mg, nicotinic acid 35 mg, folic acid 1.5 mg, biotin 0.2 mg, Cu 10 mg, Fe 60 mg, Zn 75 mg, Mn 100 mg, I 0.70 mg, Se 0.15 mg. Nutrient levels are all calculated values.

1.3 樣本采集和DNA提取

在試驗(yàn)的第15、25、35天，每組隨機(jī)抽取3只雞，共27只雞，用乙醚麻醉，頸靜脈出血致死。將回腸內(nèi)容物立即取出，置于無菌管內(nèi)，冷凍于液氮中，之后冷凍至80 ℃，直至使用。根據(jù)細(xì)菌DNA試劑盒(Omega公司，上海)使用說明書，從回腸內(nèi)容物(250 mg)中提取細(xì)菌基因組DNA。使用Nanodrop公司(美國(guó))的Nanodrop 1000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度和純度。

1.4 測(cè)序和數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌16S rDNA(V3—V4)區(qū)域引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s， 50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。利用Illumina Hiseq 2500 測(cè)序平臺(tái)對(duì)供試肉雞回腸微生物樣品進(jìn)行測(cè)序(百邁客生物科技有限公司，北京)。

使用Flash軟件將原始DNA片段組合成原始的PE reads，并通過獨(dú)特的條形碼分配到每個(gè)樣本[24]。根據(jù)QIIME (V1.8.0)中UCLUST的規(guī)定[25]，將高質(zhì)量的reads進(jìn)行生物信息學(xué)分析形成每個(gè)樣本的有效reads，根據(jù)QIIME (V1.8.0)中UCLUST的規(guī)定[26]，基于97%的序列相似性將其聚合成操作分類單元(OTU)。依據(jù)Mothur(v1.30)計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon)和OTU豐度來進(jìn)行Alpha多樣性分析[27]。對(duì)于Beta多樣性分析，通過Metastats進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)物種豐度差異顯著的處理組[28]。利用PICRUSt軟件，通過對(duì)應(yīng)于每個(gè)OTU的Greengenes id獲得與OTU對(duì)應(yīng)的KEGG和COG系列信息，計(jì)算KEGG和COG的豐度，并從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)信息中獲得途徑、EC信息和OTU豐度，從而計(jì)算每個(gè)功能類別的豐度，P值閾值為0.05[29]。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用ANOVA對(duì)各組間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著性用Waller-Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞回腸微生物序列分析和質(zhì)量過濾

從27個(gè)肉雞回腸微生物樣本中共獲得2 158 433個(gè)PE reads，平均每個(gè)樣本產(chǎn)生的PE reads數(shù)為79 942。過濾后，獲得1 762 037個(gè)優(yōu)化序列，平均每個(gè)樣本有65 261個(gè)。去除24 093個(gè)嵌合體后，平均每個(gè)樣本的有效reads數(shù)為64 368，平均長(zhǎng)度為423。

2.2 FLA和CPD對(duì)肉雞回腸微生物Alpha多樣性的影響

隨著日齡的增長(zhǎng)，OTU的數(shù)量逐漸減少，35 日齡時(shí)差異顯著(P<0.05)，但同一日齡時(shí)各處理組之間沒有顯著差異(表2)。相同日齡時(shí)各處理組間香農(nóng)指數(shù)無顯著差異，由于香農(nóng)指數(shù)與樣品的微生物多樣性具有正相關(guān)性[30]，可見,日糧中添加FLA或CPD并沒有改變同一日齡肉雞回腸微生物多樣性。CPD組15 日齡回腸微生物多樣性顯著高于35 日齡。

表2 FLA和CPD對(duì)肉雞回腸微生物群落Alpha多樣性的影響Tab.2 Effects of FLA and CPD on Alpha diversity of ileal microbial community in broilers

注：同一列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。
Note: In the same column, those with different superscript letters mean significant difference(P<0.05).

2.3 FLA和CPD對(duì)肉雞回腸微生物Beta多樣性的影響

肉雞35日齡各處理組回腸微生物在屬水平上差異顯著的菌群見表3。從表3可以看出，F(xiàn)LA組黃桿菌屬、鏈球菌屬、擬無枝酸菌屬、柯林斯菌屬、 甲基念珠菌屬、單胞菌屬、理研菌科RC9群、褐藻屬、微小桿菌屬和北里孢菌屬的豐度顯著低于對(duì)照組，北里孢菌屬、假單胞菌屬和兩面神菌屬的豐度顯著低于CPD組。CPD組克雷伯氏菌屬、黃桿菌屬、擬無枝酸菌屬、甲基念珠菌屬、理研菌科RC9群、CL500-29海洋桿菌群的豐度顯著低于對(duì)照組，克雷伯氏菌屬的豐度顯著低于FLA組。

2.4 FLA和CPD對(duì)肉雞回腸菌群16S基因功能的影響

從KEGG代謝途徑的二級(jí)分類水平中發(fā)現(xiàn)，CPD組回腸微生物序列的信號(hào)分子和相互作用功能顯著高于FLA組(P<0.05)(表4)。COG功能預(yù)測(cè)表明，F(xiàn)LA組回腸微生物序列中細(xì)胞支架功能 在25日齡時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)和CPD組(P<0.05)。35日齡時(shí)，F(xiàn)LA組回腸微生物序列轉(zhuǎn)錄功能顯著高于對(duì)照組和CPD組(P<0.05)，但對(duì)照組回腸微生物序列翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶功能顯著高于FLA組(P<0.05)。

表3 肉雞35日齡回腸微生物在屬水平上差異顯著的菌群Tab.3 The flora of ileum microorganism in broiler at 35 days with significant difference at genus level

注：此表僅顯示了在屬分類水平上組間差異顯著的細(xì)菌。
Note: This table only shows the bacteria with statistical significance of the differences between groups at the level of the genus taxonomy.

2.5 FLA和CPD對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

肉雞生長(zhǎng)性能指標(biāo)見表5。不同處理組肉雞的料肉比無顯著差異。1～42日齡FLA和CPD組肉雞日增質(zhì)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 FLA和CPD對(duì)肉雞回腸菌群16S基因功能的影響Tab.4 Effects of FLA and CPD on 16S gene function of chicken ileal flora by PICRUSt

注：此表僅顯示了肉雞同一日齡時(shí)差異顯著的回腸菌群16S基因功能。
Note: This table only shows the 16S gene function of ileal microflora with significant difference at the same age of broilers.

表5 FLA和CPD對(duì)肉雞日增質(zhì)量和料肉比的影響Tab.5 Effects of FLA and CPD on ADG and FCR in broilers

注：同一行中肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。
Note: The different superscript letters in the same row mean significant difference (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

本研究采用Illumina Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)測(cè)定了肉雞回腸微生物16S rDNA基因的V3—V4區(qū)，研究了日糧中添加FLA和CPD對(duì)肉雞生長(zhǎng)過程中回腸菌群結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)LA和CPD對(duì)35日齡肉仔雞回腸的微生物組成有顯著影響，同時(shí)影響了回腸微生物基因功能和肉雞生長(zhǎng)性能。研究表明，不同日糧組肉雞回腸內(nèi)容物的微生物多樣性隨日齡的變化具有相似性，與TOROK等[31]的結(jié)果一致。先前的研究表明，肉雞腸道微生物群的多樣性隨著日齡的增長(zhǎng)而增加，回腸微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)分為3～5日齡、5～12日齡和12～17日齡3個(gè)主要階段，第一階段穩(wěn)定性差[32-34]。然而，在本研究中，在15～35日齡階段，隨著日齡的增長(zhǎng)，對(duì)照組OTU數(shù)量和香農(nóng)指數(shù)值(與微生物多樣性正相關(guān))逐漸減少。推測(cè)肉雞回腸中的微生物多樣性在15 d時(shí)達(dá)到峰值，然后逐漸減少，直至腸道發(fā)育成熟。GAO等[35]研究表明，抗生素延緩了肉雞腸道菌群的成熟，從而解釋了本研究中FLA組25日齡回腸微生物多樣性最高，隨后下降。

FLA可以通過抑制糞腸球菌、葡萄球菌和一些革蘭氏陰性細(xì)菌(包括梭桿菌屬和普雷沃菌屬)來提高腸道微生物穩(wěn)定性[20-21]。對(duì)人體腸道微生物的研究表明，梭桿菌屬、乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬受到抑制，而腸球菌屬對(duì)FLA有抵抗力[36]。由于FLA作為一種飼料添加劑很少被牲畜吸收，所以其在牲畜產(chǎn)品中的殘留量非常低，由此產(chǎn)生的高安全性保證了其在牲畜生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用[19]。以往的研究表明，在動(dòng)物飼料中添加FLA可以降低肉雞中沙門氏菌和梭狀芽孢桿菌的發(fā)病率并調(diào)節(jié)瘤胃菌群的結(jié)構(gòu)[37-38]。在對(duì)魚類的研究中發(fā)現(xiàn)， FLA的添加可以降低腸道中鏈霉菌和梭桿菌的相對(duì)豐度[39]。ZHOU等[40]研究表明，F(xiàn)LA添加到羅非魚飼料中會(huì)影響腸道中原有的菌群結(jié)構(gòu)。本研究中，F(xiàn)LA對(duì)肉雞原有的腸道菌群有顯著的調(diào)控作用，F(xiàn)LA組肉雞回腸內(nèi)包括黃桿菌屬、鏈球菌屬、擬無枝酸菌屬等10個(gè)屬的微生物相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組。黃桿菌屬是革蘭氏陰性、不運(yùn)動(dòng)、需氧的桿狀細(xì)菌屬，能分解除纖維素以外的多糖。黃桿菌屬中有3個(gè)種是魚類的致病菌。鏈球菌屬?gòu)V泛存在于動(dòng)物糞便和鼻咽中，醫(yī)學(xué)上重要的鏈球菌主要包括化膿性鏈球菌、病毒性鏈球菌、肺炎鏈球菌和無乳酸鏈球菌，引起動(dòng)物疾病的主要原因是化膿性炎癥和過敏反應(yīng)[41]。擬無枝酸菌屬的許多細(xì)菌最初被歸為鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬，直到發(fā)現(xiàn)這類細(xì)菌的細(xì)胞壁上缺乏霉菌酸才最終將其歸為擬無枝酸菌屬。該屬包含一些具有生物學(xué)意義的生物合成基因簇(Biosynthetic gene clusters，BGCs)，目前基于基因組分析的BGCs包括糖肽類抗生素、萬古霉素、利福霉素等[42]。然而，對(duì)土壤和水中獸藥的監(jiān)測(cè)表明，F(xiàn)LA進(jìn)入環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)高[43]。

關(guān)于CPD在畜禽養(yǎng)殖方面的研究較少，但中藥CDD(成分相似，但比例和加工工藝不同于CPD)已被證明對(duì)大鼠和小鼠具有抗菌和抗炎作用[44-45]?；瘜W(xué)分析表明，4種中草藥(黃連、黃芩、黃柏和梔子)的主要活性成分為黃酮類、生物堿和環(huán)烯醚萜類，4種中草藥作為整體處方使用時(shí)較單獨(dú)使用時(shí)抗炎作用更為顯著[46]。此外，最近的研究還表明，CDD具有免疫調(diào)節(jié)、抗補(bǔ)體、抗腫瘤、抗低血糖和抗菌活性[8]。侯少巖等[47]報(bào)道，肉雞日糧中添加適量的黃腐酸和黃連解毒散能顯著改善肉雞腸道菌群組成和消化酶活性，并且提高肉雞的生長(zhǎng)性能。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CPD顯著降低了肉仔雞腸道菌群克雷伯氏菌屬等6個(gè)屬的菌群豐度?？死撞暇鷮贋槟c桿菌科，革蘭氏陰性桿菌，其DNA中的GC含量為52%～56%，主要包括肺炎克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌和鼻硬結(jié)克雷伯氏菌。當(dāng)人體免疫力降低時(shí)，可引起各種感染，如菌血癥、尿路感染和軟組織感染[48]。肺炎克雷伯桿菌主要存在于腸道，口咽部很少。然而，當(dāng)體質(zhì)虛弱時(shí)，定殖在口咽的細(xì)菌可能成為肺部感染的來源。它能引起呼吸道感染，尿路感染，尤其是兒童肺炎。有時(shí)可導(dǎo)致嚴(yán)重?cái)⊙Y、腹膜炎和腦膜炎。同時(shí)也能引起其他動(dòng)物疾?。厚R肺炎、馬泌尿生殖道感染、牛乳腺炎和實(shí)驗(yàn)性小鼠肺炎[49-50]。

16S基因功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，不同處理組肉雞回腸微生物基因功能和代謝途徑存在顯著差異(如信號(hào)分子和相互作用、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞支架及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、分子伴侶)。根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)，腸道微生物群的編碼能力隨著日糧組成的變化而變化，在小鼠[51]和人類[52]的研究中也有相似的試驗(yàn)結(jié)果。

飼料中添加FLA和CPD顯著提高了肉雞1～42日齡日增質(zhì)量，但對(duì)其料肉比及1～21日齡生長(zhǎng)性能影響不顯著。與對(duì)照組相比，F(xiàn)LA組肉雞回腸內(nèi)包括黃桿菌屬、鏈球菌屬、擬無枝酸菌屬等10個(gè)屬的微生物相對(duì)豐度顯著降低，CPD組克雷伯氏菌屬等6個(gè)屬的菌群相對(duì)豐度顯著降低。提示CPD具有類似于FLA的調(diào)節(jié)肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。不同處理組肉雞回腸微生物基因功能和代謝途徑存在顯著差異，推測(cè)腸道微生物群的編碼能力可能受飼料添加劑的影響。