高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定血漿和尿液中鵝膏肽類毒素

魏佳會 陳 佳 吳弼東 陳作紅 吳劍峰* 謝劍煒*

1(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所， 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室， 北京 100850)2(中國人民解放軍第五醫(yī)學中心， 北京 100071) 3(湖南師范大學生命科學學院， 長沙 410081)

1 引 言

每年因誤食毒蘑菇導致中毒死亡的事件在世界各國時有發(fā)生，也是我國食物中毒事件中導致死亡的重要因素之一?？蓪е轮卸镜哪⒐椒N類較多，但引起死亡的主要是鵝膏菌，所占比例高達90%以上[1～4]。致死原因是其中含有的劇毒鵝膏肽類毒素，主要包括3類(鵝膏毒肽、鬼筆環(huán)肽、毒傘肽)[5]。鵝膏毒肽為慢性毒素，其主體結(jié)構(gòu)為雙環(huán)八肽，已鑒定的天然毒素有9種，人的致死劑量約為0.1 mg/kg[6]。其中，α-鵝膏毒肽(α-Amanitin)、β-鵝膏毒肽(β-Amanitin)在鵝膏菌中含量高、毒性強，是主要致死毒素，它們能選擇性抑制細胞RNA聚合酶的活性，阻止蛋白質(zhì)合成，最終導致肝臟等器官壞死[7～9]。鬼筆環(huán)肽為雙環(huán)七肽，屬于速效毒素，能專一性地打破絲狀肌動蛋白與球狀肌動蛋白之間的解聚與裝配平衡，動物靜脈或腹腔注射后，一般2～5 h后死亡。毒傘肽為單環(huán)七肽，其中毒機制與鬼筆環(huán)肽一致[10]，但目前圍繞毒傘肽的相關(guān)研究較少。

誤食含有鵝膏肽類毒素的毒蘑菇后，其中毒癥狀具有一定潛伏期，常在肝腎等細胞大量損壞后才出現(xiàn)[11]，且鵝膏毒肽在血漿及尿液中代謝快、濃度低，導致常用的檢測方法(如熒光檢測技術(shù)[12,13]、紫外-可見吸收光譜檢測技術(shù)[14]、放射免疫法[15～18]和酶聯(lián)免疫吸附法[19,20]等)無法進行有效檢測。因此，建立快速、有效的生物樣本中毒素的檢測方法，對于食物中毒的毒源鑒定和中毒病人的針對性治療具有重要意義。高效液相色譜(HPLC)因其具有靈敏度高、快速、準確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是蘑菇毒素分析檢測最常用的檢測技術(shù)。Maurer 等[21]最先將高效液相色譜(HPLC)應(yīng)用于毒蘑菇中鵝膏毒肽的分析檢測。為提高檢測靈敏度，Maurer等[22]采用免疫親和提取方法分析尿液中的α-Amanitin和β-Amanitin，有效減少了組分之間的相互干擾。陳作紅等[23]利用HPLC 對9種主要的肽類毒素(鵝膏毒肽和鬼筆毒肽)進行同時檢測，基于各組分色譜峰的保留時間與標樣比較以及峰面積與毒素含量之間的線性關(guān)系獲得肽類毒素的種類和含量。但毒蘑菇樣品因其種類較多，所含化學成分復(fù)雜，多種毒素同時有效分離困難, 而且僅依賴保留時間比對易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用尤其是串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem mass spectrometry，MS-MS)聯(lián)用技術(shù)因其具有樣品需要量少、高靈敏度、高精確度、高分辨率鑒定和量化目標分析物等突出優(yōu)勢，有效解決了多種蘑菇毒素同時檢測及確證等難點問題，已逐漸成為食品與生物樣品分析中的主流技術(shù)，并被應(yīng)用于中毒患者體液及生物樣本中鵝膏毒肽的檢測[3,14, 24～31]。如Filigenzi 等[32]采用液相色譜-多級線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法對中毒后人和動物的血清和肝臟蕈菌毒素進行定性與定量檢測，以MS/MS/MS 模式測定血清和肝臟中α-鵝膏毒肽的含量，方法的檢出限低于1 ng/g。 Tomková等[33]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽，檢出限可達1 μg/L; Zhang等[34]等采用UPLC-MS/MS測定血漿、血清及尿液中的鵝膏毒肽和鬼筆環(huán)肽，檢出限低于0.5 μg/L，并通過引入PRiME微洗脫技術(shù)，節(jié)省了人力和費用。魏佳會等[35]等通過收集12 種劇毒鵝膏菌子實體,優(yōu)化毒素提取方法, 采用 HPLC 法建立了12 種鵝膏菌的特征指紋圖譜, 并引入潑尼松為內(nèi)標, 比較了各子實體中毒素的相對含量差異; 基于高效液相色譜-電噴霧離子化-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-ESI-QTOF/MS) 技術(shù)對各毒素進行了鑒定。相關(guān)文獻報道中，檢測對象主要為鵝膏毒肽和鬼筆環(huán)肽，較少涉及毒傘肽。

本研究基于多種蘑菇毒素對照品，采用高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法，通過優(yōu)化樣品前處理方法和分析條件，有效解決了血液和尿液樣本中各類毒素提取回收率低的問題， 建立了一種可同時測定血漿和尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、二羥鬼筆環(huán)肽、丙氨酸羥毒傘肽及二羥毒傘肽共3類重要鵝膏肽類毒素的分析方法。本方法具有快速、準確、靈敏和回收率高的優(yōu)勢，每個樣品分析時間在10 min內(nèi)， 可用于鵝膏菌中毒患者生物樣本的定性與定量分析，為臨床準確識別毒蘑菇中毒提供了技術(shù)支持。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1200 HPLC色譜儀、Agilent 6430 三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Aglient公司); RVC 2-33 CD離心濃縮儀(德國Christ公司); KQ 250E超聲儀(昆山市超聲儀器廠); R200D電子天平(德國Sartorius公司); 3k30高速冷凍離心機(美國Sigma公司); RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠); 固相萃取儀(上?？普軆x器有限公司); Oasis HLB固相萃取柱、Oasis WCX固相萃取柱、Oasis Prime uElution HLB 96孔板均購自美國Waters公司。

α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、二羥鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)均購自美國Sigma公司，純度>95%; 二羥毒傘肽(Viroidin)、丙氨酸羥毒傘肽(Ala-viroidin)由本實驗室制備，純度>95%[35]; 微囊藻毒素LR Microcystin-LR(分析純，百靈威科技有限公司); 乙酸銨(98%,美國Acros Organics公司); 甲酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司); 甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司).實驗用水為超純水(電陰率為18.2 MΩ cm)，由MilL-Q 10 超純水機(美國Millipore公司)制備。中毒患者血尿樣品由湖南省湘雅醫(yī)院和湖南省人民醫(yī)院采集提供，0℃冰包運至本實驗室后,于-20℃保存，備用。

2.2 樣品前處理

采用固相萃取對樣品進行預(yù)處理[32]，具體操作步驟如下：選用固相萃取小柱HLB (1 mL，30 mg)，用1 mL甲醇、1 mL水依次活化，靜置平衡; 取500 μL樣品(血漿或尿樣)用超純水稀釋至1 mL，上樣，緩慢通過萃取柱，1 mL 5%甲醇(V/V)淋洗，2 mL 100%甲醇(V/V)分步洗脫，洗脫液在60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加入內(nèi)標微囊藻毒素(濃度為 1 μg/mL)10 μL，以90 μL 10%甲醇(V/V)復(fù)溶，14000 r/min離心，取上清液進行檢測。

2.3 毒素對照品的提取與分離

將采自云南、貴州、湖南等地的毒蘑菇干子實體研磨成粉末狀(部分樣品由湖南師范大學陳作紅教授提供)，參照文獻[35]中所述毒素提取方法處理樣品： 稱取2 g粉末于50 mL離心管中，加30 mL 含0.5%甲酸的50%(V/V)甲醇，室溫下，240 r/min振搖12 h，14000 r/min離心10 min，沉淀加入30 mL提取液，超聲30 s，同法離心，合并兩次上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入1 mL水復(fù)溶，同體積石油醚去脂，再次旋干后，用50%甲醇溶液復(fù)溶，過濾，得樣品提取液。采用制備液相色譜對提取液進行分離，色譜柱為Unisil 10-120 C18(21.2 mm×250 mm，21.2 μm); 流動相A為水，B為甲醇，采用梯度洗脫(0～40 min， 10%～50% B; 40～60 min， 50% B; 60～65 min， 50%～10% B); 流速15 mL/min; 柱溫： 40℃; 進樣量：1 mL; 檢測波長：295 nm。將收集的各組分經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再進行冷凍干燥，獲得毒素參考品。采用液相色譜及核磁共振對純度進行表征，純度不低于95%。

2.4 鵝膏肽類毒素的液相色譜分離條件

色譜柱：Capcell Core C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm)，保護柱：F3643 EXP Guard Cartridge Capcell Core C18S-2.7(2.1 mm×5 mm, 2.7 μm); 流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇，采用梯度洗脫(0～0.5 min，15%B; 0.5～5.0 min，15%～60% B; 5.0～6.0 min，60%～70% B; 6.0～9.5 min, 70% B; 9.5～9.6 min, 70%～15% B); 流速為 0.3 mL/min; 柱溫40℃; 進樣量10 μL。

2.5 鵝膏肽類毒素的質(zhì)譜檢測條件

電噴霧離子源(ESI); 正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式; 離子源溫度： 100℃; 霧化氣溫度： 325℃; 霧化氣氣流; 10.0 L/min; 噴霧電壓： 275 kPa; 毛細管電壓： 4 kV; 其它參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜的MRM 參數(shù)

Table 1 Mass spectrometry (MS) parameters for multiple reaction monitoring

毒素Toxins監(jiān)測離子對Mass transitions(m/z)碎片電壓Fragmentor(V)碰撞能Collision energy(eV)β-鵝膏毒肽 β-Amanitin920.4/259920.4/862505080α-鵝膏毒肽 α-Amanitin919.4/259919.4/862505080丙氨酸羥毒傘肽 Ala-viroidin869.4/237869.4/1582505080二羥鬼筆環(huán)肽 Phalloidin789.3/330789.3/1572504565二羥毒傘肽 Viroidin897.4/40897.4/237897.4/158250405080微囊藻毒素LR Microcystin-LR995.3/218995.3/1341807075

3 結(jié)果與討論

3.1 內(nèi)標的選擇

為建立鵝膏肽類毒素的定量檢測方法，參照文獻[36～40]，首先對內(nèi)標進行了篩選和優(yōu)化?？紤]到鵝膏肽類毒素為環(huán)狀多肽，且一般宜選結(jié)構(gòu)類似物作為內(nèi)標。本研究選取了利福平、微囊藻毒素RR(MC-RR)、微囊藻毒素LR(MC-LR)等主體結(jié)構(gòu)均為大環(huán)多肽的化合物作為內(nèi)標候選對象。 實驗結(jié)果表明，MC-LR的提取回收率、色譜保留時間及質(zhì)譜離子化效率均優(yōu)于利福平和MC-RR，因此，最終選擇MC-LR作為校正內(nèi)標。

3.2 樣品前處理方法優(yōu)化

由于血漿及尿液中鵝膏肽類毒素含量較低，一般較難進行直接檢測，需對其中所含的肽類毒素進行富集凈化處理。參照文獻[34,41～44]中的樣品預(yù)處理方法，對于血漿樣品，首先考察了直接以乙腈為沉淀劑的提取效果，結(jié)果表明，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽的回收率均低于50%。固相萃取柱是生物樣本分析中最常用的分離富集方法，本研究比較了Prime HLB μElution 96孔板、Waters Oasis HLB和Waters Oasis WCX共3種萃取小柱的提取效果，結(jié)果表明，Waters Oasis HLB對鵝膏毒肽、鬼筆環(huán)肽及毒傘肽的提取回收率均可達93.0%以上。分別考察了淋洗液和洗脫液對鵝膏肽類毒素凈化效果的影響，結(jié)果表明，淋洗液和洗脫液分別為甲醇-水(5∶95，V/V)和甲醇時，各毒素提取回收率最高，為使提取完全，最終選用2 mL甲醇進行分步洗脫。優(yōu)化后的前處理條件為：Waters Oasis HLB萃取小柱分離，淋洗液為5%甲醇溶液，洗脫液為2 mL甲醇，優(yōu)化提取效率的結(jié)果如圖1所示?；谏鲜銮疤幚矸椒ǎ瑢τ谀蛞簶颖?，還考察了微孔濾膜過濾-直接進樣的方式，結(jié)果表明，基質(zhì)干擾嚴重而且毒素損失多，故最終血漿、尿液都采用固相萃取分離方法對樣品進行凈化。

圖1 4種提取方法的提取效果對比圖Fig.1 Comparison of extration efficiency of four kinds of extraction methods

3.3 高效液相色譜分離條件優(yōu)化

分別采用水-甲醇、水-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相，在CAPCELL PAK C18(2.1 mm ×100 mm, 2.7 μm)、CAPCELL PAK AQ(2.1 mm ×100 mm, 2.7 μm)色譜柱上進行分離，結(jié)果表明，采用CAPCELL PAK C18(2.1 mm ×100 mm, 2.7 μm)色譜柱時，各毒素分離效果最佳。流動相中含一定比例乙腈時，其洗脫能力過強，導致β-鵝膏毒肽、α-鵝膏毒肽保留時間過于集中，色譜峰無法完全分離; 而將乙腈更換為10 mmol/L乙酸銨溶液時，有效改善了各鵝膏毒肽色譜峰形，分離效果明顯改善，最終確定流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為甲醇; 通過優(yōu)化梯度洗脫程序，實現(xiàn)了5種鵝膏類毒素的完全分離，且一次梯度洗脫分析僅需10 min， 5種毒素分離的總離子流色譜圖如圖2所示。

圖2 5種毒素分離的總離子流色譜圖1. α-鵝膏毒肽; 2. β-鵝膏毒肽; 3. 二羥鬼筆環(huán)肽; 4. 丙氨酸羥毒傘肽; 5. 二羥毒傘肽MC-LR微囊藻毒素-LRFig.2 High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) chromatograms of five amanita peptide toxins1, α-Amanitin; 2, β-Amanitin; 3, Phalloidin; 4, Ala-viroidin; 5, Viroidin; MC-LR: Microcystin-LR

3.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在電噴霧正離子模式MRM多反應(yīng)監(jiān)測模式下，優(yōu)化各項質(zhì)譜參數(shù)，使目標分析物離子的信號達到最佳。確定各毒素以及內(nèi)標的母離子， 根據(jù)離子對的豐度確定最佳碎片電壓(Fragmentor)以及碰撞電壓(CE)等。各毒素均監(jiān)測兩對特征離子對，其中豐度最大的作為定量離子對。 優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3.5 線性范圍、檢出限及定量限

以空白血漿及尿液配制濃度分別為5、20、50、100、250和500 μg/L的樣品，采用HPLC-MS/MS檢測，根據(jù)信噪比(S/N)大于3的標準確定檢出限(LOD)，信噪比(S/N)大于10的標準確定定量下限(LLOQ)。如表2所示，α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽在血漿和尿液中的檢出限均為0.5 μg/L，定量下限均為5 μg/L，線性范圍均為5～500 μg/L; 丙氨酸羥毒傘肽、二羥鬼筆環(huán)肽以及二羥毒傘肽在血漿、尿液中的檢出限均為0.2 μg/L，在血漿、尿液中的定量下限分別為2 和1 μg/L，其定量上限均為500 μg/L; 5種鵝膏毒肽在各自濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.9990～0.9998。本方法可同時測定血漿/尿液基質(zhì)中包括鵝膏毒肽、鬼筆環(huán)肽以及毒傘肽在內(nèi)3類鵝膏肽類毒素，靈敏度高、線性范圍寬， 能夠滿足公共衛(wèi)生突發(fā)事件、法醫(yī)毒物學和臨床毒物學檢測的需要。

表2 血漿與尿液樣品中鵝膏毒肽分析方法的線性方程、檢出限及定量下限

Table 2 Calibration curves, detection limits and quantitation limits for amainta peptide toxins in plasma and urine sample

3.6 準確度和精密度

采用人空白血漿和尿液進行準確度和精密度實驗，按照生物分析方法學指導原則[45]，回收率和精密度采用定量下限(LLOQ)樣品和質(zhì)控樣品進行評估，包括批內(nèi)回收率、精密度和批間回收率、精密度。每個分析批次包括4個濃度水平分別為定量下限(LLOQ)、低濃度質(zhì)控樣品(LQC)、中濃度質(zhì)控樣品(MQC)和高濃度質(zhì)控樣品(HQC)，每個濃度點由5份獨立樣品組成，在血漿及尿液中分別加入5種毒素的混合標準溶液以及內(nèi)標溶液，處理后進樣檢測。根據(jù)線性范圍配置4點不同濃度的質(zhì)控(QC)樣品，混合均勻后，再按樣品前處理方法進行操作，色譜分析結(jié)果見表3，血漿中各毒素的準確度為92.2%～114.7%， RSD在1.4%～10.9%之間; 尿液中的準確度為92.6%～103.7%，RSD在1.9%～9.8%之間。上述結(jié)果表明，所建立的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法準確、可靠，符合分析方法的要求。

表3 血漿和尿液樣品中鵝膏毒肽分析方法的準確度和精密度

Table 3 Accuracy and precision of this method for detection of Amainta toxins in plasma and urine

毒素Toxins血漿 Blood日內(nèi) Intra-day (n=5)加標濃度Added(ng/L)準確度Accuracy(%)精密度RSD(%)日間 Inter-day(n=5)準確度Accuracy(%)精密度RSD(%)尿液 Urine日內(nèi) Intra-day (n=5)加標濃度Added(ng/L)準確度Accuracy(%)精密度RSD(%)日間 Inter-day (n=5)準確度Accuracy(%)精密度RSD(%)α-鵝膏毒肽α-Amanitinβ-鵝膏毒肽β-Amanitin二羥鬼筆毒傘肽Phalloidin二羥毒傘毒Viroidin丙氨酸羥毒散素Ala-viroidin5104.04.4102.45.2599.03.899.63.510104.74.397.46.910102.59.8102.77.0200100.42.599.23.5200102.44.0102.33.0375103.93.0100.76.037598.95.6100.23.9594.99.699.46.5596.91.996.73.81098.47.298.46.71094.75.497.84.5200104.62.1106.06.820094.53.199.06.5375111.03.6104.67.137592.73.498.17.55111.25.7114.45.7195.38.998.67.710103.86.8100.66.8297.72.8100.14.320097.24.1100.74.120093.35.598.05.9375106.57.8104.67.837595.25.499.35.42103.110.9111.56.4197.46.1103.77.9592.22.998.05.4293.26.995.65.5200103.11.4103.94.920093.94.796.76.3375106.71.8102.27.037592.62.498.36.62114.77.5110.37.5197.43.398.15.15101.33.593.14.7296.25.299.35.6200107.73.499.15.220099.24.599.73.6375107.43.4101.28.837592.84.198.36.8

3.7 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

當采用液相色譜質(zhì)譜法對生物樣品進行檢測時，常存在較嚴重的基質(zhì)干擾?？疾炝?批來自解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心的正常血漿，以及低質(zhì)控(LQC)、高質(zhì)控(HQC)兩個濃度水平，每個濃度水平獨立配制3份。將5種混合標準溶液配制在初始比例的流動相中得到樣品A; 對空白血漿、尿液進行處理得到空白基質(zhì)，再在空白基質(zhì)中加入5種毒素混合標準溶液得到樣品B; 在空白的血漿、尿液中加入5種毒素混合標準溶液后再進行處理得到樣品C; 對樣品A和B同時進行檢測，響應(yīng)值[(B-A)/A×100%]即為基質(zhì)效應(yīng)(ME)，對B和C同時進行檢測，響應(yīng)值C/B即為回收率(RE)。結(jié)果如表4所示， 血漿和尿液中5種毒素的回收率為90.1%～114.6%，除個別添加濃度稍有基質(zhì)效應(yīng)外，其它條件下基質(zhì)不影響血漿或尿液中各種鵝膏肽類毒素的檢測，滿足測定要求。

3.8 實際中毒樣品分析

采用優(yōu)化的液相色譜質(zhì)譜方法對9名疑似毒蘑菇中毒患者的血漿及尿液樣品進行了分析。樣品采樣時間在食用后48～72 h，在不同時間點采集了11份血漿與18份尿液樣品，按人員以A至M進行編號(如D1～Dn為同一人的樣品)，檢測結(jié)果如表5所示，僅在一位中毒患者不同時間點采集的兩份血漿樣品中檢出α-鵝膏毒肽(D2與D5)，含量分別為3.4和4.4 μg/L，其尿液樣品中還檢出β-鵝膏毒肽和二羥鬼筆環(huán)肽，含量分別為28.8和13.8 μg/L; 另一患者僅在其尿液樣品中檢出二羥鬼筆環(huán)肽，含量為9.2 μg/L。所采集的血漿及尿液樣品中均未檢出毒傘肽。

表4 血漿及尿液樣品的回收率與基質(zhì)效應(yīng)

Table 4 Recoveries and matrix effect (ME) of amainta peptide toxins in urine and plasma sample(n=3)

毒素Toxins血漿 Blood加標濃度Added(μg/L)回收率Rcovery(%)基質(zhì)效應(yīng)ME(%)尿液 Urine加標濃度Added(μg/L)回收率Rcovery(%)基質(zhì)效應(yīng)ME(%)α-鵝膏毒肽α-Amanitinβ-鵝膏毒肽β-Amanitin二羥鬼筆毒傘肽Phalloidin二羥毒傘毒Viroidin丙氨酸羥毒散素Ala-viroidin10110.85.01098.64.7375105.09.137595.86.51098.09.21099.47.0375100.48.437590.13.410100.312.2298.310.1375103.59.637594.22.35107.414.6295.47.537598.07.137596.85.45113.87.6291.43.7375114.610.737593.65.6

表5 9名疑似毒蘑菇中毒患者的血漿及尿液中毒樣品的檢測結(jié)果

Table 5 Detection results of plasma and urine samples from 9 suspected poisoning patients by mushroom

樣品類型Type of samplesα-鵝膏毒肽α-Amatoxin(μg/L)β-鵝膏毒肽β-Amatoxin(μg/L)二羥鬼筆環(huán)肽Phalloidin(μg/L)血漿樣品(D2)Plasma3.4--血漿樣品(D5)Plasma4.4--尿液樣品(D7)Urine-28.813.8尿液樣品(E2)Urine--9.2

4 結(jié) 論

基于高效液相色譜/三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，采用固相萃取前處理方式，建立了可同時檢測血漿及尿液中α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、二羥鬼筆環(huán)肽、二羥毒傘肽、丙氨酸羥毒傘肽共3類5種鵝膏肽類毒素的分析方法。本方法具有凈化效果好、回收率和靈敏度高、涉及毒素范圍廣和適用性強等優(yōu)勢，能夠滿足鵝膏肽類毒素定性與定量分析的要求，為毒蘑菇中毒事件的診斷及救治提供了重要的技術(shù)支持。