基于聚苯胺納米孔的DNA分析

趙 怡 石曉雨 孫 紅 姚付軍 亢曉峰

(西北大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 合成與天然功能分子化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西安 710069)

1 引 言

作為一種簡單、快速、免標(biāo)記的生物傳感技術(shù)[1]，納米孔單分子分析在分析化學(xué)[2]、生物物理[3,4]、環(huán)境化學(xué)[5]等領(lǐng)域受到越來越廣泛的關(guān)注。納米孔單分子分析的原理是基于納米孔阻塞電流變化的幅度和頻率，實(shí)現(xiàn)對分析對象的分子尺寸、分析物濃度等物理化學(xué)性質(zhì)的定性和定量分析[6]。目前，生物和固態(tài)納米孔已被廣泛應(yīng)用于單分子化學(xué)反應(yīng)、單分子檢測以及單分子DNA測序等領(lǐng)域，涉及的研究對象包括金屬離子[7,8]、有機(jī)小分子[9]、多肽[10]、酶[11]、蛋白質(zhì)[11]、DNA[12]、RNA[13]等。目前，納米孔DNA分析面臨兩個(gè)主要挑戰(zhàn): (1) DNA的穿孔速率過快; (2) DNA的穿孔幾率較低，限制了納米孔核酸檢測的靈敏度和選擇性。為解決這一問題，研究者發(fā)展了多種策略，以提高納米孔對DNA的捕獲率或延緩DNA的穿孔速率，包括電壓控制、溫度控制、鹽梯度、pH值調(diào)控、采用高粘度緩沖溶液等[14～16]。本研究組以往的研究表明，采用四甲基氯化銨(TMACl)替代傳統(tǒng)的KCl溶液，能夠有效降低DNA的穿孔速率，并增加納米孔對DNA的捕獲效率[17]。但這些策略多集中于對實(shí)驗(yàn)條件的改變，而且會(huì)對生物孔所依賴的磷脂雙分子層膜的穩(wěn)定性帶來較大的影響。因此，發(fā)展一種可進(jìn)行化學(xué)修飾的固體納米孔分析技術(shù)，并將其應(yīng)用于對DNA的分析檢測是非常必要的。

聚苯胺(PANI)是目前研究最廣泛的一種導(dǎo)電聚合物。由于具有較好的電化學(xué)活性、化學(xué)穩(wěn)定性及生物相容性等特點(diǎn)，PANI成為一種適宜的基底材料制備化學(xué)、生物傳感器和納米器件[18,19]。近年來，基于PANI納米結(jié)構(gòu)和復(fù)合材料構(gòu)建的生物傳感器在小分子、DNA和微生物分析檢測中展現(xiàn)出良好的信號(hào)放大效應(yīng)和抗干擾特性[20～22]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Axopatch 200B膜片鉗放大器和1440A A/D數(shù)字轉(zhuǎn)換器(美國Axon Instruments公司); 4040A函數(shù)發(fā)生器(美國BK Precision公司); 6487型皮安計(jì)(美國Keithlay公司)。

苯胺(分析純, ≥99.5%，成都科龍化工試劑廠); (NH4)2S2O8(分析純, ≥99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); 單離子徑跡聚碳酸酯膜(PC膜，德國GSI研究所); DNA(上海生物工程股份有限公司); HCl(分析純，36%～38%， 四川西隴科學(xué)有限公司); NaCl(分析純≥99.5%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); KCl(分析純, ≥99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); LiCl(分析純, ≥99.5%，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心); 三羥甲基氨基甲烷(分析純, ≥99.5%，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司); NaOH(分析純, ≥99.5%， 重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司); 實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.25 MΩ·cm)。DNA序列見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 PC膜的刻蝕[24]分別用95%乙醇、水洗滌單離子徑跡PC膜。將PC膜固定在電解池中間，用紫外燈在254 nm波長下照射膜的兩面各2 h，向電解池兩端均加入5 mol/L NaOH刻蝕液。Ag/AgCl作為工作電極，插在PC膜兩側(cè)的電極槽中。施加1 V恒定電壓，以實(shí)時(shí)表征單孔的通道電流隨刻蝕時(shí)間的變化。達(dá)到所需電流值時(shí)停止刻蝕，并用1 mol/L HCl和超純水清洗膜，得到單孔PC膜。

表1 本研究所用的DNA序列

Table 1 DNA sequences used in this study

DNA序列Name堿基序列Sequence單鏈DNASingle-stranded DNA (ssDNA)5'-TGC ACG GTC GAT CAA GTA C-3'雙鏈DNADouble-stranded DNA (dsDNA)5'-TGC ACG GTC GAT CAA GTA C-3'3'-ACG TGC CAG CTA GTT CAT G-5'

2.2.2 聚苯胺修飾單孔PC膜移取275 μL苯胺單體(An)溶于10 mL 1 mol/L HCl溶液中，攪拌均勻后得An-HCl溶液; 向反應(yīng)池兩端各加入2 mL An-HCl溶液，浸泡12 h; 稱取0.2282 g (NH4)2S2O8(APS)溶于10 mL 1 mol/L HCl中，攪拌均勻，得到APS-HCl溶液; 吸出反應(yīng)池一端的An-HCl溶液，并用水洗滌數(shù)次后，加入APS-HCl溶液。反應(yīng)4 h后，依次用乙醇、水清洗，于室溫下干燥24 h。

2.2.3 聚苯胺納米孔的電化學(xué)性能檢測將單孔PC膜、修飾有聚苯胺的單孔PC膜分別固定在電解池中，Ag/AgCl為工作電極，電解池兩端均加入2 mL電解質(zhì)溶液，用皮安計(jì)以掃場方式輸出-1～1 V電壓，得通道I-V曲線。

2.2.4 DNA的預(yù)處理ssDNA、dsDNA粉末樣品分別以3000～4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 min; 向DNA樣品離心管中均加入滅菌水，配制濃度為100 μmol/L DNA母液; 高速渦旋2～3 min使DNA溶液混勻; DNA樣品加熱到95℃，自然冷卻至室溫; dsDNA需將互補(bǔ)鏈混勻; 將所得樣品于4 ℃保存。

2.2.5 聚苯胺納米孔DNA分析向電解池兩端均加入緩沖液(cis端接地，另一端為trans端)，在cis端加入適量DNA，用膜片鉗放大器采集穿孔信號(hào)，儀器采樣頻率為100 kHz，濾波頻率為3 kHz。使用pClamp10.3和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，平均滯留時(shí)間直方圖(τoff)滿足單指數(shù)分布，平均阻塞電流直方圖(ΔI)滿足高斯分布。

3 結(jié)果與討論

3.1 聚苯胺納米孔的制備及電化學(xué)表征

圖1 (A)聚苯胺(PANI)納米孔檢測DNA穿孔過程的示意圖，灰色部分為基底-單離子徑跡聚碳酸酯膜(PC膜)，綠色表示PANI涂層; (B)PANI的化學(xué)結(jié)構(gòu); (C)PC納米孔刻蝕過程的電流-時(shí)間變化，插圖為刻蝕電流為0～0.5 nA時(shí)的電流-時(shí)間曲線; (D)PC納米孔修飾PANI前后，通道I-V曲線的對比，插圖為放大后的PANI納米孔的通道I-V曲線。實(shí)驗(yàn)條件: 1 mol/L KCl， 10 mmol/L Tris-HCl，pH= 7.0Fig.1 (A) Schematic of DNA analysis by polyaniline (PANI) nanopore, Single-ion track polycarbonate membrane (PC membrane) is shown as gray section, PANI is shown as green section; (B) Chemical structure of PANI; (C) The current-time changing for the PC nanopore etching process, the inset is current-time curve between 0 and 0.5 nA; (D) Comparison of single-channel I-V curves between bare nanopore and PANI nanopore, the inset shows I-V curve of PANI nanopore. Experimental condition: 1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0

3.2 PANI納米孔對ssDNA的穿孔行為的研究

采用未修飾且具有相似孔徑大小的PC膜納米孔開展了ssDNA穿孔實(shí)驗(yàn)，研究表明，在0.1 mol/L KCl溶液中， +900 mV 電壓作用下， 未檢測到ssDNA的穿孔信號(hào)(圖2A)。這可能是由于ssDNA穿孔速率太快，超出了單通道儀器檢測的分辨率。然而，將ssDNA加入到聚苯胺納米孔的檢測池中，可以看到明顯的電流阻塞信號(hào)。修飾聚苯胺后的納米孔基線波動(dòng)較大，這可能是由于孔內(nèi)壁聚苯胺涂層不均勻引起。對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在ssDNA不存在時(shí)，或施加-900 mV電壓，無電流阻塞信號(hào)產(chǎn)生，證明此信號(hào)確實(shí)是由ssDNA與聚苯胺納米孔相互作用產(chǎn)生。圖2B為ssDNA穿孔滯留時(shí)間柱狀圖，通過單指數(shù)擬合發(fā)現(xiàn)，其值為τoff=(1.14 ± 0.05) ms，因此ssDNA的平均穿孔速率約為48.2 μs/base。同其它納米孔相比(DNA穿孔速率約1～20 μs/base)[17,25～28]，DNA在聚苯胺納米孔的穿孔速率減小2.4～48倍。這是由于帶正電荷的聚苯胺與帶負(fù)電荷的DNA存在著靜電相互作用，延緩了DNA的穿孔時(shí)間。圖2C為ssDNA阻塞電流的柱狀圖，符合高斯分布，其統(tǒng)計(jì)值ΔI= (7.01 ± 0.14) pA。為了驗(yàn)證聚苯胺對ssDNA存在著靜電相互作用，進(jìn)行了聚苯胺納米孔對ssDNA的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)。向緩沖液加入ssDNA(終濃度0.5 μmol/L)，經(jīng)10 h靜態(tài)吸附后，對PANI納米孔進(jìn)行電化學(xué)I-V表征。如圖2D所示，相比于未進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)的聚苯胺納米孔，吸附DNA后的聚苯胺納米孔在正電壓下的電流值變小，而在負(fù)電壓下電流值變大，并且吸附DNA后，PANI納米孔幾乎不具有整流效應(yīng)。這是由于PANI納米孔對DNA的靜電吸附作用使得內(nèi)部的電荷分布發(fā)生了變化，孔壁中原本帶正電荷的PANI被吸附的DNA覆蓋后，表面的電荷發(fā)生中和，導(dǎo)致孔壁的凈電荷密度減小，因此納米通道無明顯的整流效應(yīng)。通過研究不同電壓下ssDNA的穿孔行為發(fā)現(xiàn)，穿孔時(shí)間隨著電壓的增加而逐漸減少，據(jù)此可推斷ssDNA穿過了聚苯胺納米孔(圖2E)。電壓依賴性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ssDNA的穿孔頻率隨電壓的增加而接近線性增大，表明擴(kuò)散控制的捕獲過程起主導(dǎo)作用(圖2F)。進(jìn)一步的研究表明，在0.1 mol/L KCl溶液中，當(dāng)施加電壓V<700 mV， 幾乎檢測不到DNA的穿孔信號(hào)，這可能是因?yàn)閟sDNA受到的電場力不足以克服聚苯胺對其的靜電吸引力，難以使DNA從管壁內(nèi)部脫附下來，并穿過納米通道。另外一個(gè)可能的因素是由于低電壓產(chǎn)生的電滲流較小，未能驅(qū)動(dòng)ssDNA進(jìn)入聚苯胺納米孔，因而也未產(chǎn)生阻塞電流。

圖2 ssDNA在PANI納米孔中的穿孔分析: (A)PANI修飾前后的PC納米孔對ssDNA分析的trace及特征穿孔信號(hào); (B、C) ssDNA穿孔信號(hào)的滯留時(shí)間柱狀圖和振幅柱狀圖; (D)加入DNA前后，PANI納米孔通道I-V曲線的變化(使用的電解液為1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7); (E)在PANI納米孔中，ssDNA的平均滯留時(shí)間隨電壓的變化; (F)聚苯胺納米孔對ssDNA的捕獲率隨電壓的變化。實(shí)驗(yàn)條件: 0.1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0； 電壓: + 900 mVFig.2 Translocation behavior of ssDNA in PANI nanopore： (A) Current trace and characteristic translocation signal of ssDNA in the nanopore before and after PANI modification (voltage: +900 mV); (B， C) Histograms of dwell time (τoff) and amplitude for ssDNA (0.1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0; voltage: +900 mV); (D) I-V curves of PANI nanopore before and after the DNA adsorption experiments (1 mol/L KCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.0); (E) Relationship between mean dwell time of ssDNA with voltage; (F) Capture rate of ssDNA vs voltage

在納米孔DNA分析中，多采用KCl或NaCl作為電解質(zhì)溶液，但其穿孔速率過快或穿孔幾率過低的缺點(diǎn)影響了納米孔單分子分析的靈敏度和分辨率。Kowalczyk等[25]研究發(fā)現(xiàn)，采用Li+作為ssDNA的抗衡離子，能夠有效減小其所帶電荷，增加其穿孔時(shí)間，分辨率至少提高10倍。最近，Hu等[29]研究表明，Li+可減少蛋白納米孔對長鏈ssDNA的捕獲能壘，使其穿孔幾率增強(qiáng)了10.23倍。

在0.1 mol/L LiCl溶液中，向檢測池cis端加入50 nmol/L ssDNA并施加+900 mV的電壓后，單通道電流trace及特征阻塞信號(hào)如圖3A所示。研究表明，相比于0.1 mol/L KCl溶液(τoff=(1.14 ± 0.05) ms)，ssDNA在0.1 mol/L LiCl溶液中阻塞電流信號(hào)的平均滯留時(shí)間統(tǒng)計(jì)值(τoff=(1.55 ± 0.14) ms)是其的1.36倍(圖3B)。當(dāng)Li+濃度增加到1 mol/L和3 mol/L時(shí)，ssDNA穿孔時(shí)間分別增加了2.35倍和8.91倍，其統(tǒng)計(jì)值分別為(3.64 ± 0.16) ms和(13.82 ± 0.76) ms。這是因?yàn)橄啾扔贙+，Li+與ssDNA具有更強(qiáng)的鍵合作用[27]，能有效降低ssDNA鏈上所帶的負(fù)電荷，因此,在相同電壓下，ssDNA在Li+溶液中受到較小的電泳力作用，導(dǎo)致其穿孔速率減慢。而且隨著Li+濃度增加，ssDNA的表面會(huì)結(jié)合更多的電荷抗衡離子，導(dǎo)致受到的電場驅(qū)動(dòng)力更小，因而穿孔時(shí)間更長。雖然DNA表面負(fù)電荷的減少使其受到聚苯胺靜電作用減小，導(dǎo)致穿孔速率增加，但電場力的主導(dǎo)作用使得ssDNA的滯留時(shí)間延長。研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度Li+能產(chǎn)生更大的ssDNA電流阻塞幅度。ssDNA在不同濃度LiCl中穿孔頻率如圖3D所示，在0.1 mol/L LiCl(+900 mV)中，ssDNA的穿孔頻率為(83.25 ±2.69) s-1，是同濃度KCl溶液中的1.30倍((64.07± 0.05) s-1)。在納米孔單分子分析中，電滲流(EOF)的大小影響分析物的穿孔頻率，當(dāng)EOF和EP的方向相同時(shí)，EOF越大，穿孔頻率越大。而EOF的強(qiáng)度依賴于施加在納米孔兩端的電壓、電解質(zhì)的濃度、電解質(zhì)的類型等因素。以往的研究表明，EOF在LiCl中的強(qiáng)度比在KCl中大[27,30]。因此，在本研究中，施加相同電壓(+900 mV)時(shí)，ssDNA在0.1 mol/L LiCl中穿孔幾率比在同濃度KCl中大。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，隨著Li+濃度增加，ssDNA的穿孔頻率降低，這與文獻(xiàn)[30]一致[30]。這可能是由于隨著鹽濃度增加，聚苯胺納米孔內(nèi)壁的正電荷受到的屏蔽效應(yīng)增大，導(dǎo)致孔的離子選擇性降低，進(jìn)而使EOF降低?？傊?，采用LiCl作為電解質(zhì)溶液可明顯增加聚苯胺納米孔對ssDNA的捕獲率，同時(shí)增加ssDNA的穿孔時(shí)間。

圖3 (A,B) ssDNA在不同濃度LiCl鹽中穿孔行為、特征阻塞信號(hào)及滯留時(shí)間柱狀圖; (C)在0.1 mol/L KCl以及不同濃度的LiCl中，ssDNA穿孔信號(hào)的平均滯留時(shí)間對比; (D)不同濃度的LiCl中，PANI納米孔對ssDNA捕獲率的比較。檢測電壓: +900 mVFig.3 (A,B) Typical current trace, characteristic event and dwell time histogram of ssDNA in different concentrations of LiCl; (C) Comparison of mean dwell time of ssDNA in 0.1 mol/L KCl and LiCl; (D) The capture rate of PANI nanopore in various concentrations of LiCl. Detection voltage: +900 mV

3.3 PANI納米孔對dsDNA穿孔行為的研究

為了進(jìn)一步拓展聚苯胺納米孔的應(yīng)用范圍，考察了dsDNA在0.1 mol/L LiCl中的穿孔行為。向檢測池中加入50 nmol/L dsDNA后，在電場力的作用下(+900 mV)，產(chǎn)生了類似ssDNA的阻塞電流信號(hào)(圖4A)。圖4B和4C是dsDNA滯留時(shí)間柱狀圖和振幅柱狀圖，分別經(jīng)單指數(shù)擬合和高斯擬合后，獲得的統(tǒng)計(jì)值為τoff=(1.25 ± 0.11) ms、ΔI=(13.34 ± 0.17) pA。隨著電壓的增加，dsDNA的穿孔時(shí)間逐漸減小，可推斷dsDNA也能穿過聚苯胺納米孔(圖4D); 且dsDNA的平均滯留時(shí)間比ssDNA短(圖4E)， 這是因?yàn)閐sDNA所帶負(fù)電荷比ssDNA多，受到較強(qiáng)的電場力; 同時(shí)，dsDNA的剛性螺旋結(jié)構(gòu)減弱了其與聚苯胺的親和力，因而能以更快的速率穿過納米孔。比較二者振幅大小發(fā)現(xiàn)(圖4F)，dsDNA穿過聚苯胺納米孔產(chǎn)生的阻塞電流幅度大于ssDNA，這是因?yàn)閐sDNA的直徑大于ssDNA的直徑，因此，由dsDNA“體積排阻效應(yīng)”造成的振幅比ssDNA大。由于ssDNA和dsDNA能很好的區(qū)分， 因而可以采用聚苯胺納米孔構(gòu)建生物傳感器，通過設(shè)計(jì)合適的DNA探針，實(shí)現(xiàn)與病理相關(guān)的目標(biāo)DNA的靈敏且快速的檢測。

圖4 PANI納米孔對dsDNA分析: (A)dsDNA 穿孔trace圖和特征信號(hào); (B)dsDNA的滯留時(shí)間柱狀圖; (C)dsDNA的振幅柱狀圖; (D)dsDNA 平均滯留時(shí)間隨電壓的變化; (E、F) dsDNA和ssDNA穿孔信號(hào)的比較。實(shí)驗(yàn)條件為: 0.1 mol/L LiCl (10 mmol/L Tris-HCl, pH=7), 檢測電壓: +900 mVFig.4 Analysis of dsDNA by PANI nanopore: (A) Current trace and characteristics signal of dsDNA; (B) Dwell time histogram of dsDNA; (C) Amplitude histogram of dsDNA; (D) Relationship between mean dwell time of dsDNA with voltage; (E， F) Comparison of dsDNA and ssDNA. Experimental conditions: 0.1 mol/L LiCl buffered with 10 mmol/L Tris-HCl, pH=7. The applied voltage was +900 mV

4 結(jié) 論

采用化學(xué)合成法將聚苯胺修飾在固態(tài)納米通道的內(nèi)壁，研究了ssDNA和dsDNA的穿孔行為究。結(jié)果表明，聚苯胺涂層對DNA的靜電相互作用是納米孔對DNA分析具有較高分辨率的主要原因。對電解質(zhì)類型和濃度的影響的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LiCl能夠延緩DNA的滯留時(shí)間，并提高聚苯胺納米孔的捕獲率。本研究提供了一種控制DNA穿孔行為的方法，具有操作簡單、價(jià)格低廉的優(yōu)勢。