超聲輔助酸水解提取山里紅葉中牡荊素的工藝優(yōu)化

邢文淼 陳 民 馮昌寅 孟憲明 田夢飛 牟璠松 羅 猛

(東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院，哈爾濱 150040)

山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.)薔薇落葉小喬木，山楂的一個變種，既是果樹，也是觀賞植物[1～2]。主要分布在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、河南、山東、江蘇、陜西、山西等地[3]。山里紅果實具有消食化積，行氣散瘀之功效[4]。另有記載其葉片具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的作用[5]。山里紅葉中含有多酚、三萜、花青素和有機酸等多種成分[6～8]。目前已從中分離得到的酚類化合物有綠原酸，牡荊素-4″-O-葡萄糖苷，牡荊素-2″-O-鼠李糖苷，葒草苷，蘆丁，牡荊素和金絲桃苷[9～10]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，牡荊素在增加冠狀動脈的血流量、保護心血管、降低血脂、防止腦缺血導致的中風、減輕性功能障礙和治療過敏性哮喘方面具有重要作用，但其在山里紅葉中的含量較低[11～15]。研究表明，山里紅葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷，牡荊素-2″-O-鼠李糖苷含量較高，所以可通過水解反應提高牡荊素含量[16～17]，以提高山里紅葉提取物活性。

本文利用單因素實驗對山里紅葉超聲提取過程中影響牡荊素得率的主要影響因素鹽酸濃度、超聲功率、提取時間、固液比、超聲溫度、乙醇濃度進行優(yōu)化。同時，研究了它們與牡荊素提取得率之間的規(guī)律趨勢；然后，應用正交設計優(yōu)化試驗，研究了鹽酸濃度、提取時間、固液比和超聲功率對山里紅葉提取得率的影響大小，并確定最佳提取工藝，為其綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

山里紅葉樣品采自東北林業(yè)大學，標本收集于東北林業(yè)大學教育部森林植物生態(tài)學重點實驗室。牡荊素標準品購于上海融合制藥技術有限公司；四氫呋喃(色譜級)購自Mreda Technology Inc，Made In USA；乙腈(色譜級)購自Dikma，Made In USA；磷酸(分析純)購自西隴化工股份有限公司；甲醇(色譜級)購自Dikma，Made In USA；鹽酸(分析純)購于天津市天力化學試劑有限公司。超純水由Milli-Q凈水系統(tǒng)制得。

1.1 樣品預處理

采收到的山里紅葉樣品于恒溫通風干燥箱40℃干燥至恒重后，細粉、過60目篩，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 牡荊素含量的測定

使用KQ-250DE超聲提取器進行樣品提取，將提取液濃縮，離心后取上清液，使用安捷倫1260型高效液相色譜儀，Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相組成：四氫呋喃-乙腈-水-磷酸(175∶30∶790∶0.38，V/V/V/V)。流速1.0 mL·min-1，進樣量20 μL，紫外檢測波長為350 nm。配制濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg·mL-1的牡荊素標準品，繪制牡荊素標準品曲線。測定山里紅葉提取物中牡荊素含量[18]。

1.3 單因素實驗

1.3.1 鹽酸濃度

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸濃度0、1、2、3、4 mol·L-1。提取溫度50℃，超聲功率500 W，提取時間30 min，將提取液過濾，重復3次。用2.2牡荊素含量的測定方法測定牡荊素的含量。

1.3.2 提取時間

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸濃度2 mol·L-1，提取溫度50℃，超聲功率500 W，提取時間10、20、30、40和50 min，將提取液過濾，重復3次。用2.2牡荊素含量的測定方法測定牡荊素的含量。

1.3.3 固液比

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，加入50%的乙醇溶液，酸濃度2 mol·L-1，提取溫度50℃，超聲功率500 W，提取時間30 min，將提取液過濾，重復3次。用2.2牡荊素含量的測定方法測定牡荊素的含量。

1.3.4 超聲功率

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸濃度2 mol·L-1，提取溫度50℃，超聲功率400，500，600，700和800 W，提取時間30 min，將提取液過濾，重復3次。用2.2牡荊素含量的測定方法測定牡荊素的含量。

1.3.5 超聲溫度

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入50%的乙醇溶液，酸濃度2 mol·L-1，提取溫度30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，超聲功率500 W，提取時間30 min，將提取液過濾，重復3次。用2.2牡荊素含量的測定方法測定牡荊素的含量。

1.3.6 乙醇濃度

準確稱量葉片粉末1.0 g，按照固液比1∶20，加入20%、30%、40%、50%和60%的乙醇溶液，酸濃度2 mol·L-1，提取溫度50℃，超聲功率500 W，提取時間30 min，將提取液過濾，重復3次。用2.2牡荊素含量的測定方法測定牡荊素的含量。

1.4 正交試驗

通過對單因素實驗結果的分析，可知超聲溫度和乙醇濃度對牡荊素得率的影響較小。故選擇影響較大的因素鹽酸濃度、提取時間、固液比和超聲功率進行正交試驗(表1)。

表1 正交試驗因素水平

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗重復3次。實驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6軟件分析(State-Ease公司，美國明尼蘇達州)。方差分析可表明超聲輔助提取法的擬合模型是否顯著。P<0.05時，即可認定為該模型與數(shù)據(jù)擬合適度。

2 結果與討論

2.1 山里紅葉中牡荊素提取工藝優(yōu)化

當鹽酸濃度為2 mol·L-1時(圖1A)，牡荊素得率最高。鹽酸濃度再升高，牡荊素得率呈現(xiàn)下降趨勢。原因是鹽酸濃度越高水解效果越好，當鹽酸濃度達到2～3 mol·L-1時，牡荊素-4″-O-葡萄糖苷和牡荊素-2″-O-鼠李糖苷已大部分轉(zhuǎn)化為牡荊素，酸濃度過高會破壞物質(zhì)本身結構，2 mol·L-1鹽酸濃度為最佳實驗條件。不同提取時間對牡荊素得率影響見圖1B，隨著時間的增加，牡荊素得率呈上升趨勢，但當提取時間超過30 min后，牡荊素得率略下降，這可能是在超聲波作用下，牡荊素在30 min左右達到了平衡，而后隨著時間的增加，其他物質(zhì)雜質(zhì)相繼溶出，故選擇提取時間30 min。在設置的固液比范圍內(nèi)，牡荊素得率隨著溶劑量的增加而增大，當固液比達到1∶20時，繼續(xù)增加溶劑量，牡荊素得率反而會下降(圖1C)。由于繼續(xù)增加溶劑量只會增加多糖化合物等雜質(zhì)的浸出，影響牡荊素得率，故選擇固液比1∶20。隨著超聲功率的增加，牡荊素得率先增加，在超聲功率達到500 W，牡荊素含量達到最大值，繼續(xù)提高超聲功率，得率緩慢下降(圖1D)?？赡艿脑蚴?，隨著功率的上升，溫度升高，溶劑溢出，降低牡荊素的提取率，故超聲功率選擇為500 W。在設定的提取溫度范圍內(nèi)，得率以50℃為分界線，出現(xiàn)先高后降的趨勢(圖1E)。原因可能是溫度變高會導致蛋白質(zhì)等脂溶性物質(zhì)不斷溶出，體系黏度升高，抑制牡荊素類物質(zhì)溶出，降低得率[14]。故選擇提取溫度為50℃。隨著乙醇濃度的增加，牡荊素得率呈上升趨勢，當乙醇濃度在50%時，繼續(xù)增加乙醇的濃度，牡荊素得率反而會下降(圖1F)。原因可能是乙醇濃度大于50%時，脂溶性的物質(zhì)溶解度增加，對牡荊素的溶出造成影響。故選取乙醇濃度為50%。

圖1 幾種因素對牡荊素得率的影響Fig.1 Effect of four factors on the vitexin

表2 牡荊素得率變化絕對值與對應影響因素

Table 2 Absolute value of the yield of vitexin and corresponding factors

影響因素Factors得率變化范圍Range of yield variation(mg·g-1)得率變化絕對值Absolute value of yield change(mg·g-1)變化幅度Amplitude of variation鹽酸濃度HCl concentration0.085～2.4672.38228.023超聲功率Ultrasonic power1.245～2.6011.3561.089提取時間Extraction time0.094～1.6781.58416.85固液比Solid-liquid ratio1.247～2.4351.1880.953超聲溫度Ultrasonic temperature1.254～2.3091.0550.841乙醇濃度Ethanol concentration1.925～2.5340.6090.316

表3 正交試驗結果

2.2 正交試驗因素選擇

在單因素實驗中，牡荊素得率與各影響因素如表2所示。乙醇濃度對牡荊素得率影響變化范圍是1.925～2.534 mg·g-1，得率變化的絕對值為0.609 mg·g-1，影響的變化幅度為0.316，與其他因素相比，對牡荊素得率影響較小，可以直接選取乙醇濃度50%為最佳實驗條件。同理，超聲溫度對牡荊素得率影響也比較小，超聲溫度對牡荊素得率影響變化范圍是1.254～2.309 mg·g-1，得率變化的絕對值為1.055 mg·g-1，影響的變化幅度為0.841，與鹽酸濃度、超聲功率、提取時間和固液比相比，超聲溫度對牡荊素得率的影響較小。所以在正交試驗中選取影響因素相對較大的因素：鹽酸濃度、超聲功率、提取時間和固液比進行正交試驗。

表4 正交試驗方差分析

2.3 山里紅葉提取牡荊素正交試驗

山里紅葉提取牡荊素得率的影響，在各個因素條件中，鹽酸濃度具有較大顯著性。因素影響順序為：鹽酸濃度>超聲功率>提取時間>固液比，結果見表3～4。說明鹽酸濃度在超聲輔助提取山里紅葉的過程中起著首要作用。正交優(yōu)化后的最優(yōu)提取條件為A2B3C2D2，即鹽酸濃度2 mol·L-1，提取時間40 min，固液比1∶20，超聲功率500 W。為驗證正交試驗，在最佳條件下進行3次試驗，牡荊素平均得率為2.603 mg·g-1。

3 結論

設計單因素試驗，研究了各個因素條件對牡荊素得率的影響，在此基礎上，通過設計正交優(yōu)化試驗得到最優(yōu)工藝。結果表明：影響牡荊素提取得率的因素順序為：鹽酸濃度>超聲功率>提取時間>固液比；最優(yōu)工藝條件為：鹽酸濃度2 mol·L-1、超聲功率500 W、提取時間40 min、固液比1∶20，在此最優(yōu)組合條件下，測定牡荊素得率為2.603 mg·g-1。