四種復(fù)合生物制劑對(duì)鯽魚(yú)生長(zhǎng)和免疫功能的影響

趙 碩，梁晶晶， 劉寶同， 王永慶，李永生

（青島根源生物集團(tuán)集團(tuán)有限公司，山東青島 266111）

2018年全國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量為4991.06萬(wàn)噸，同比增長(zhǎng)1.73%（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局，2019），伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加，養(yǎng)殖污染及用水緊缺問(wèn)題不斷加劇，在養(yǎng)殖過(guò)程中使用微生態(tài)制劑和酶制劑是提高飼料利用率、抑制有害菌、改善水體環(huán)境的重要手段之一。研究表明，微生態(tài)制劑和酶制劑在有效劑量下持續(xù)使用會(huì)改善腸道及生長(zhǎng)環(huán)境，降低不良環(huán)境下動(dòng)物的應(yīng)激和疾病發(fā)生率（鞠安琪等，2018；郭正富等，2018；楊鏗等，2016）。但這兩種制劑在添加到飼料時(shí)，多要經(jīng)過(guò)調(diào)制、制粒過(guò)程，這期間，活菌和酶蛋白會(huì)經(jīng)受高溫、高濕和高壓的過(guò)程。為解決這一添加難題，可單獨(dú)將菌、酶添加載體和黏合劑制成魚(yú)類(lèi)可攝食的顆粒，按一定比例添入成品飼料中，避免飼料加工過(guò)程對(duì)菌、酶有效成分的影響。本文將4種復(fù)合生物制劑通過(guò)冷制粒制成1.5 mm的顆粒，按5%的比例與商品飼料同時(shí)投喂，研究其對(duì)鯽魚(yú)生長(zhǎng)性能及血清免疫、抗氧化和理化指標(biāo)的影響，以期為生物制劑在鯽魚(yú)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼料制備 試驗(yàn)所用基礎(chǔ)日糧為山東某飼料有限公司1.5 mm沉水鯽魚(yú)顆粒料，將Ⅰ-Ⅳ四種復(fù)合生物制劑以發(fā)酵麩皮和面粉為載體采用濕法冷制粒工藝制成顆粒，粒徑1.5 mm，在基礎(chǔ)日糧中分別添加5%。四種復(fù)合生物制劑的主要成分見(jiàn)表1。

表1 四種復(fù)合生物制劑主要成分

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用鯽魚(yú)于2018年10月購(gòu)自青島市即墨王圈水庫(kù)，規(guī)格為100～150尾/kg。購(gòu)回后在室內(nèi)水族箱循環(huán)水系統(tǒng)暫養(yǎng)馴化一周，水溫（27±2）℃，采用電磁式空氣泵連續(xù)充氣、直流變頻水泵進(jìn)行循環(huán)，流量12000 L/h，每個(gè)水族箱長(zhǎng) 39 cm、寬 39 cm、高 33 cm，有效水體 50 L，全系統(tǒng)32個(gè)水族箱，3 h完成一次循環(huán)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)選?。?.0±1.0）g/尾的鯽魚(yú)120尾，分為5組，每組4個(gè)水族箱，每個(gè)水族箱6尾，分組情況如表2所示。投餌量按體重3%～4%投喂，每日投喂三餐，投喂時(shí)間為8:30、12:30、16:30，每餐少量多次投喂。2018年11月1日正式開(kāi)展試驗(yàn)，養(yǎng)殖試驗(yàn)為期45 d。水族箱頂鋪蓋紗網(wǎng)以防止鯽魚(yú)跳出。日常水質(zhì)保持以下指標(biāo)：淡水、pH 8.0±0.4、氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.05 mg/L，水溫26～28℃，溶氧≥4 mg/L。每天換水10%，換水過(guò)程中溫度上下波動(dòng)不超過(guò)3℃。如氨氮、亞硝超標(biāo)，適當(dāng)增加換水量。

表2 試驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

1.4 試驗(yàn)指標(biāo)

1.4.1 健康狀況 試驗(yàn)結(jié)束，每箱取2尾鯽魚(yú)進(jìn)行解剖，測(cè)量體長(zhǎng)、腸道長(zhǎng)度，觀察腸道韌性和肝臟、膽、腎臟及性腺發(fā)育情況。

1.4.2 糞便中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量 試驗(yàn)后期，分別收集A組和E組鯽魚(yú)糞便，2000 r/min離心5 min，棄去上清，留下糞泥備用。稱取1 g糞泥，重懸于100 mL無(wú)菌水中，搖床振蕩30 min，做成10-2懸液，取一部分懸液于試管中，75℃水浴20 min。采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂涂布法分別測(cè)定A組和E組糞便中水浴前后的異養(yǎng)細(xì)菌含量。

1.4.3 生長(zhǎng)指標(biāo) 養(yǎng)殖初始和結(jié)束，逐一對(duì)水族箱中鯽魚(yú)進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，計(jì)算增重率、特定生長(zhǎng)率、餌料系數(shù)及成活率。

增重率（WGR）/%=[（Wt-W0）/W0]×100；

餌料系數(shù)（FCR）=F/（ Wt-W0）；

成活率（SR）/%=T活/T總×100；

式中：W0為初始平均體重，g；Wt為結(jié)束平均體重，g；F 為攝食量（投喂量-殘餌量），g；T活為結(jié)束時(shí)成活尾數(shù)，T總為開(kāi)始時(shí)總尾數(shù)。

1.4.4 血清免疫、抗氧化和理化指標(biāo) 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)水族箱取2尾鯽魚(yú)，在低溫下尾靜脈采血，采用超低溫離心機(jī)12000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶 （SOD）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT），均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.5 CCl4攻毒試驗(yàn) 養(yǎng)殖結(jié)束后，剩余鯽魚(yú)停食一天，均按0.5 mL/10 g體重進(jìn)行腹腔注射50%濃度CCl4（經(jīng)橄欖油稀釋?zhuān)?，注射后?天開(kāi)始繼續(xù)投喂對(duì)應(yīng)基礎(chǔ)飼料與生物制劑，每天記錄各組死亡情況，并分別在第7天和第14天取4尾魚(yú)尾靜脈采血，采用超低溫離心機(jī)12000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定血清GOT酶活。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)結(jié)果以 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)，以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 成活率與解剖觀察 45 d養(yǎng)殖期間鯽魚(yú)健康狀態(tài)良好，所有處理組成活率均為100%。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過(guò)解剖對(duì)每組鯽魚(yú)內(nèi)臟健康狀況進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示腸道韌性良好，肝臟偶見(jiàn)花肝和土黃色，多數(shù)顏色正常，各組之間無(wú)顯著性差異；膽略大，可能與稱重前提前饑餓24 h有關(guān)；腎臟正常。此外，對(duì)腸道與體長(zhǎng)比例進(jìn)行了分析，C和D兩組腸體比有增加趨勢(shì)，E組有降低趨勢(shì)（圖1），推測(cè)與C組添加大量的丁酸梭菌以及D組添加了適量的綠原酸等植物提取物有關(guān)。

2.2 糞便中異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量 試驗(yàn)期間對(duì)A、E兩組鯽魚(yú)糞便中的異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，只投喂基礎(chǔ)日糧的鯽魚(yú)糞便中異養(yǎng)細(xì)菌含量為5.4×108cfu/g，其中芽孢數(shù)量為 4.4×106cfu/g。而投喂了添加生物制劑后，糞便中異養(yǎng)細(xì)菌含量為1.5×109cfu/g，其中芽孢為 5.0×107cfu/g，說(shuō)明飼喂復(fù)合生物制劑后其會(huì)在魚(yú)腸道中大量繁殖，排出的糞便含有大量繁殖后的芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)體，此外還含有少量未萌發(fā)的芽孢，數(shù)量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于只投喂飼料的對(duì)照組（P＜0.05），其中糞便中異養(yǎng)菌的含量比對(duì)照組提高了2.7倍，芽孢的含量比對(duì)照組提高了11.4倍。

2.3 生長(zhǎng)性能 由表3可知，B組和E組鯽魚(yú)增重率分別比對(duì)照組提高6.5%和9.5%；餌料系數(shù)分別比對(duì)照組降低11.0%和6.9%。通過(guò)不同生長(zhǎng)周期的增重率數(shù)據(jù)分析可知，在投喂相應(yīng)的生物制劑15 d后B組和E組增重率均已高于其他組別，30～45 d這種優(yōu)勢(shì)一直保持（表4）。

表3 鯽魚(yú)生長(zhǎng)性能檢測(cè)結(jié)果

表4 鯽魚(yú)不同養(yǎng)殖時(shí)間增重率%

2.4 血清免疫、抗氧化和理化指標(biāo) 由圖2～5可知，C組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量均低于對(duì)照組（P≥0.05），B組兩者均高于對(duì)照組，而C、D兩組兩種指標(biāo)與對(duì)照組相比趨勢(shì)不一致，整體組間差異不顯著（P≥0.05）。E組血清堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶含量均高于對(duì)照組（P＜0.05），堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶分別比對(duì)照組提高了16.3%和24.1%，D組與對(duì)照組均值相當(dāng)，B、C兩組兩種指標(biāo)與對(duì)照組相比趨勢(shì)不一致，整體組間差異不顯著（P≥0.05）。

2.5 CCl4攻毒試驗(yàn) 養(yǎng)殖45 d后采用CCl4進(jìn)行攻毒顯示，這種攻毒方式鯽魚(yú)死亡率整體較低，15 d累計(jì)死亡率對(duì)照組為 （28.33±8.25）%，B、C組 15 d未出現(xiàn)死亡，D、E組分別為（10.00±7.02）%和（16.7±11.79）%。 但血清谷草轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定結(jié)果顯示，CCl4攻毒會(huì)引起其含量變化，前期飼喂不同的生物制劑，對(duì)攻毒后谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化趨勢(shì)有影響。攻毒7 d和14 d后對(duì)照組和D組谷草轉(zhuǎn)氨酶均呈降低趨勢(shì)，B、C、E三組先升高后降低。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)4個(gè)試驗(yàn)組均低于對(duì)照組（圖 6）。

3 討論

多種益生菌、酶制劑和植物提取物復(fù)配而成的生物制劑，經(jīng)低溫制粒后在養(yǎng)殖中使用，通過(guò)檢測(cè)糞便中異養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量顯示，飼料中添加生物制劑后可顯著增加腸道異養(yǎng)菌數(shù)量。增重率和餌料系數(shù)結(jié)果顯示，飼喂顆粒復(fù)合生物制劑后飼料利用率提高、生長(zhǎng)性能改善。所有組別在一個(gè)養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)，養(yǎng)殖全程未發(fā)生病害，包括對(duì)照組和投喂生物制劑組內(nèi)臟各器官均處于健康狀態(tài)。

對(duì)益生菌、酶制劑和植物提取物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已有較多研究，表明這3類(lèi)生物制劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和免疫都有一定改善作用 （王明陽(yáng)等，2018；李軍濤等，2018；劉夢(mèng)等，2017；張麗等，2017；張耀武等，2008）。但將多種益生菌、酶制劑與植物提取物復(fù)合后在鯽魚(yú)中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。本研究中對(duì)包括生長(zhǎng)、餌料系數(shù)、血清理化、抗氧化和免疫等指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，E組表現(xiàn)最佳，其使用的復(fù)合生物制劑Ⅳ主要組分包括木聚糖酶、中性蛋白酶等6種單酶（部分固體發(fā)酵復(fù)合酶），凝結(jié)芽孢桿菌、丁酸梭菌等8種益生菌，并添加了綠原酸、杜仲多糖等復(fù)合植物提取物。相較而言，B組未添加植物提取物，益生菌和酶制劑組分與E組相同，使用后效果略差于E組，但兩組均優(yōu)于對(duì)照組和其他兩個(gè)復(fù)合制劑組。

肝臟是魚(yú)體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性器官，其功能很強(qiáng)大，對(duì)來(lái)自體內(nèi)外的許多非營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì)，如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物等有生物轉(zhuǎn)化作用，具有很好的解毒功能和代謝功能，因此，肝臟更容易受到外環(huán)境、病毒、細(xì)菌等因素的影響。四氯化碳（CCl4）是經(jīng)典的肝損傷誘導(dǎo)劑（劉英娟等，2015；何秋霞等，2012）。本研究中采用 CCl4攻毒，嘗試探索飼喂復(fù)合生物制劑后對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明，飼喂不同的復(fù)合生物制劑后對(duì)CCl4損傷有明顯保護(hù)作用。在目前的高密度養(yǎng)殖中使用此類(lèi)制劑，可起到減輕魚(yú)類(lèi)消化道和肝臟負(fù)擔(dān)、改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境以及水體外環(huán)境的綜合作用，在抗生素替代中具有廣闊的應(yīng)用前景。試驗(yàn)中四氯化碳致死毒性不高，此外，CCl4對(duì)魚(yú)體注射處局部有一定腐蝕作用，是后期研究中采用此法進(jìn)行肝臟攻毒試驗(yàn)應(yīng)注意的事項(xiàng)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加復(fù)合生物制劑可改善鯽魚(yú)的生長(zhǎng)性能、免疫功能和抗氧化能力，并且對(duì)CCl4攻毒后的肝臟有明顯的保護(hù)作用，本研究中以復(fù)合生物制劑Ⅳ效果最佳。