外泌體在哺乳動物胚胎附植中的作用研究進(jìn)展

賀艷娟，劉德武，吳珍芳，洪林君，蔡更元

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

哺乳動物胚胎附植是妊娠中非常重要的階段。大部分的妊娠失敗是由于附植失敗，如大白豬、長白豬等瘦肉型豬種有約30% 的胚胎死亡發(fā)生在附植期，是限制母豬產(chǎn)仔數(shù)提高的主要因素[1]。子宮腔是精子從陰道遷移至輸卵管進(jìn)行受精的獨特場所，胚胎附植前的最后發(fā)育和附植的早期步驟都發(fā)生在這里。子宮腔中的內(nèi)容物為這些生理過程的發(fā)生提供適宜的環(huán)境。胚胎附植是囊胚在子宮內(nèi)進(jìn)一步發(fā)育、遷移、定位并最終與子宮壁建立密切聯(lián)系的過程。胚胎進(jìn)入子宮腔后，胚胎與母體子宮內(nèi)膜的相互作用使很多細(xì)胞因子發(fā)生功能改變，從而促進(jìn)胚胎發(fā)育、子宮內(nèi)膜容受性和子宮腔微環(huán)境發(fā)生同步反應(yīng)[2]。

近年來，外泌體（Exosomes）作為一種新的細(xì)胞間交流媒介在胚胎-子宮內(nèi)膜的信息交流中發(fā)揮著重要作用[3]。外泌體被首次命名以來的時間軸及其在胚胎附植中的作用見圖1[4-12]。雖然外泌體很早被定義但外泌體在胚胎附植中的作用在近幾年才剛剛開始被描述和理解。研究發(fā)現(xiàn)，來源于子宮內(nèi)膜[13]、植入前胚胎[14]、胚胎干細(xì)胞[15]和胎盤[16]中的外泌體能夠影響母體子宮環(huán)境和胚胎發(fā)育。因此，本文主要對當(dāng)前應(yīng)用于外泌體提取與鑒定的方法進(jìn)行總結(jié)，并著重討論不同來源外泌體中蛋白質(zhì)和miRNA 對胚胎附植的影響。

1 外泌體

1.1 外泌體的介紹 外泌是直徑為30～150 nm 的雙層膜胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），起源于核內(nèi)體（Endosome），內(nèi)含核小體，不僅能與質(zhì)膜相互融合，還可以將囊泡釋放到細(xì)胞外空間介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息交流[17-19]。胞外囊泡包括外泌體、微囊泡（直徑為100～1 500 nm）和凋亡小體（直徑為500～2 000 nm），這些胞外囊泡包裹著不同的載體物質(zhì)，如脂質(zhì)、mRNA、microRNAs、DNA 和蛋白質(zhì)，這些物質(zhì)的變化取決于細(xì)胞的來源和表型[20]。外泌體幾乎存在于所有的體液中，如尿液、精液、腦脊液、乳液、唾液、心包液、血液和子宮腔液，并且在許多細(xì)胞培養(yǎng)液上清中也發(fā)現(xiàn)了外泌體，如人類子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞以及來自胎盤的原發(fā)性滋養(yǎng)層細(xì)胞均可釋放外泌體。

外泌體中含有豐富的蛋白質(zhì)，一般分為胞內(nèi)蛋白和膜蛋白，其中胞內(nèi)蛋白有調(diào)節(jié)外泌體應(yīng)激反應(yīng)的熱休克同源蛋白70（Heat Shock Cognate Protein 70，HSC70）、轉(zhuǎn)運所需的內(nèi)體分選復(fù)合物ESCRT 蛋白（Endosomal Sorting Complexes Required For The Transport）和細(xì)胞內(nèi)源性蛋白（Alix、TSG10 和Rab 蛋白家族）等；外泌體膜蛋白有鑒別外泌體的可靠標(biāo)志物——四跨膜蛋白超家族（CD63、CD81、CD9、CD82 等）、膜聯(lián)蛋白、整聯(lián)蛋白、磷脂酶D、神經(jīng)酰胺和中性鞘磷脂酶2 等[20-22]，外泌體所含的蛋白不同，其行使的功能就會不同。

外泌體是具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的一種胞外囊泡，因此，脂質(zhì)也是外泌體的基本成分。外泌體的脂質(zhì)有神經(jīng)鞘磷脂（SM）、膽固醇（Chol）、磷脂酰膽堿（PC）等。其中鞘磷脂和膽固醇可以相互作用參與細(xì)胞膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及蛋白轉(zhuǎn)運等過程[23]。

外泌體內(nèi)還含有大量核苷酸，如microRNA（miRNA）、信使RNA（mRNA）、長鏈非編碼RNA（lncRNA）等[24]。外泌體所包含的RNA 統(tǒng)稱為外泌體穿梭RNA（esRNA），esRNA 通過外泌體轉(zhuǎn)運與靶細(xì)胞膜融合后，釋放到靶細(xì)胞基質(zhì)，之后通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞的生命活動[25]。

1.2 外泌體產(chǎn)生機(jī)制 在細(xì)胞的核內(nèi)體系統(tǒng)中，細(xì)胞通過內(nèi)吞的方式將蛋白質(zhì)、mRNA 和microRNA 等信息物質(zhì)包裹形成內(nèi)吞小泡，內(nèi)吞小泡之間進(jìn)行相互融合形成早期核內(nèi)體（Early Endosomes，EEs）。之后ESCRT-0與EEs 的泛素化結(jié)合位點特異性結(jié)合，在ESCRT-I 和ESCRT-II 的催化作用下質(zhì)膜內(nèi)陷以出芽的方式形成小泡，通過ESCRT-III 進(jìn)行剪切，使其與EEs 質(zhì)膜分離形成成熟的多泡體（Multivesicular Bodies，MVBs）[26-29]。MVBs 中含有大量直徑在30～150 nm 的囊泡，MVBs 通過 Rab GTPase 家族蛋白Rab27a 和Rab27b 促進(jìn)靶向位點與其突觸結(jié)合蛋白 4（Syna-potagmin-Like Proteins 4，Slp4）進(jìn)行結(jié)合，從而與細(xì)胞膜融合將包含的囊泡釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，而這些囊泡就是外泌體[29-31]。

1.3 外泌體的生物學(xué)功能功能 外泌體已經(jīng)被證實是細(xì)胞間信息交流的一種新方式，它們可以將特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、microRNA 和DNA 等轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，從而重新編碼和改變靶細(xì)胞功能[32]。外泌體不僅在抗原呈遞、免疫刺激和抑制活性、癌癥發(fā)生與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化、胚胎細(xì)胞間的信號傳遞、脂質(zhì)、RNA、DNA 轉(zhuǎn)移中起著重要作用[33]，而且在血管生成[34]、免疫調(diào)節(jié)[35]和炎癥[36]中均扮演了關(guān)鍵的角色。

2 外泌體提取與鑒定

近年來，外泌體在細(xì)胞生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)方面的研究越來越多，但在外泌體的分離與提純方法方面還有很多不足。在細(xì)胞外囊泡的生物學(xué)領(lǐng)域，很多文獻(xiàn)對微泡與外泌體的命名沒有細(xì)致區(qū)分。雖然這2 種細(xì)胞外囊泡有一些共同的貨物（如mRNA、miRNA、非編碼RNA、DNA、胞漿蛋白和膜蛋白等），但有特異的物質(zhì)和某些蛋白質(zhì)被單獨包裝在一個亞型的囊泡中，像四跨膜蛋白超家族ESCRT 組分、TSG101 和整合素在外泌體中是特有的，KIF23、CSE1L、ARF6 和EMMPRIN 等在微泡中是特有的。外泌體的膜直徑為30～150 nm，密度在碘克沙醇中為1.10～1.12 g/mL；而微泡的膜直徑為100～1 500 nm，密度在碘克沙醇中為1.17～1.20 g/mL，因此可以利用選擇性膜和密度梯度法將微泡和外泌體進(jìn)行過濾分離。在外泌體的提取方法中超速離心法[37]、試劑盒法[38]和密度梯度離心法[39]比較受研究者青睞，在鑒定方法中研究者通常會通過電子顯微鏡[33]、納米顆粒追蹤分析技術(shù)[40]和蛋白質(zhì)印跡[41]等方法對其進(jìn)行鑒定。

3 外泌體對胚胎附植的影響

外泌體在人類、綿羊、老鼠和牛等哺乳動物的子宮腔液中存在。在胚胎附植前和胎盤發(fā)育過程中，外泌體介導(dǎo)的信息交流是啟動妊娠的關(guān)健。研究發(fā)現(xiàn)，受體細(xì)胞內(nèi)的生物過程可能受到其他細(xì)胞所釋放的外泌體的影響，如在人的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌的外泌體可被胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞吸收并影響其細(xì)胞功能[42]（圖2）。通過外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)來源于子宮內(nèi)膜和植入前胚胎來源的外泌體所攜帶的蛋白質(zhì)中有很多與胚胎附植相關(guān)，如胚胎的遷移、黏附和侵入等生物效應(yīng)。miRNA作為外泌體重要的組成部分，是近年來外泌體研究的一個熱點。不同來源外泌體miRNA 可以調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、侵襲及血管生成能力，并能調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與凋亡[43]。因此，子宮腔液中不同來源外泌體的蛋白質(zhì)和miRNA 在胚胎-母體的信息交流中非常重要。

3.1 子宮內(nèi)膜來源的外泌體對胚胎附植的作用 子宮內(nèi)膜上皮是一種動態(tài)組織，在發(fā)情或月經(jīng)周期中隨著卵巢類固醇激素的變化，其形態(tài)和功能發(fā)生特征性變化。來源于不同生理狀態(tài)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞所分泌的外泌體，其所含的信息物質(zhì)（蛋白質(zhì)、miRNA 等）也會不同。用經(jīng)過雌激素或雌激素加孕酮處理的人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分離純化外泌體并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)用激素處理后的外泌體中蛋白質(zhì)組分有顯著改變[5]，通過功能分析發(fā)現(xiàn)其差異的糖蛋白及整聯(lián)蛋白與滋養(yǎng)層細(xì)胞的黏附、遷移、侵入和細(xì)胞外基質(zhì)降解有關(guān)，而這些功能都是胚胎正常附植不可或缺的。并且這些子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌的外泌體能被胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞所吸收，并能通過黏著斑激酶（FAK）信號通路促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的黏附能力。說明來源于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的外泌體在胚胎附植期可以被胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞吸收并分泌特異的蛋白增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜的黏附能力，從而促使胚胎附植。在綿羊中，Burns 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，來源于母體的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒enJSRVs 可以通過子宮內(nèi)膜分泌的外泌體傳輸?shù)脚咛ゼ?xì)胞，而且enJSRV 與胚胎所分泌的妊娠識別信號分子-干擾素τ在表達(dá)量上有顯著的時空關(guān)聯(lián)，推測enJSRVs 可能是一種母體來源的妊娠啟動信號分子，通過外泌體轉(zhuǎn)運到胚胎，促進(jìn)胚胎分泌干擾素，從而實現(xiàn)母胎間的信號交流，促進(jìn)胚胎附植。此外，子宮腔液中外泌體miRNAs 的表達(dá)模式妊娠與非妊娠狀態(tài)下存在顯著差異。在豬中，Bidarimath 等[1]在豬子宮內(nèi)皮細(xì)胞系培養(yǎng)液上清中分離到外泌體，并證實外泌體中miRNA能夠通過外泌體進(jìn)入到滋養(yǎng)層細(xì)胞中發(fā)揮作用。因此，哺乳動物胚胎附植期子宮腔液中外泌體miRNA 和蛋白是重要的母胎信號交流因子，子宮內(nèi)膜細(xì)胞可以選擇性地把miRNA 和蛋白自包裝進(jìn)外泌體，然后主動分泌到子宮腔液中，最終miRNA 和蛋白可以通過外泌體運輸?shù)阶甜B(yǎng)層細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，從而影響胚胎附植。以上研究說明，外泌體在胚胎附植中具有非常重要的作用。

3.2 影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞外泌體分泌的因素 外泌體在子宮內(nèi)膜與胚胎之間進(jìn)行精準(zhǔn)通訊，以及子宮內(nèi)膜不同細(xì)胞類型之間的相互作用會受到體內(nèi)和體外環(huán)境因素的刺激從而影響其功能。Braundmeier 等[45]在體外用人類子宮內(nèi)膜細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，卵巢類固醇激素雌二醇和細(xì)胞因子白介素-1β調(diào)控外泌體是從子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌的。此外，作者還發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C 激活劑PMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate）激活細(xì)胞內(nèi)鈣通道顯著增加了含EMMPRIN 外泌體的釋放。EMMPRIN是一種刺激金屬蛋白酶（MMP）生成并協(xié)調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的蛋白。同時，研究進(jìn)一步表明子宮上皮細(xì)胞分泌含有EMMPRIN 的外泌體會刺激子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞MMP 的產(chǎn)生從而影響其功能[45]。從而可以得知，在體內(nèi)的一些生物因子可以影響子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌外泌體并且影響子宮內(nèi)膜不同類型細(xì)胞的功能。

除激素及細(xì)胞因子外，Koh 等[46]研究發(fā)現(xiàn)氧氣含量也會影響子宮內(nèi)膜來源外泌體中的有效成分。在牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下收集的外泌體數(shù)量比富氧環(huán)境中多。通過對其蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境中外泌體的特異蛋白質(zhì)種類比富氧環(huán)境下多，其中低氧環(huán)境中的外泌體中存在金屬蛋白酶域蛋白10（ADAM10）[46]。ADAM10 是一種蛋白水解酶，可以調(diào)控細(xì)胞凋亡也可以介導(dǎo)E-鈣粘蛋白脫落影響細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移[47]。這表明在附植過程中當(dāng)機(jī)體受到外界不良刺激時，子宮內(nèi)膜間質(zhì)的細(xì)胞功能及其外泌體的釋放和外泌體內(nèi)容物會發(fā)生改變，從而影響胚胎與子宮內(nèi)膜的相互作用。以上2 個實驗表明胚胎在附植過程中子宮內(nèi)膜外泌體的分泌會受到來自體內(nèi)或體外因素的影響從而影響自身分泌及其功能。

3.3 胚胎來源的外泌體對胚胎附植的影響 在胚胎附植過程中，除了子宮內(nèi)膜能夠通過分泌外泌體到子宮腔液中來調(diào)控胚胎附植外，胚胎自身也可以分泌外泌體。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎分泌的外泌體可以改變子宮內(nèi)膜形態(tài)及其基因表達(dá)譜，從而調(diào)控胚胎的定位與侵入促進(jìn)胚胎附植[48]。這也進(jìn)一步表明，子宮內(nèi)膜與胚胎附植之間的交流不是一個單向過程，而是母體與胚胎之間的雙向信號傳遞。在體外培養(yǎng)胚胎實驗中發(fā)現(xiàn)，群體培養(yǎng)的胚胎比單獨培養(yǎng)的胚胎發(fā)育更好，這可能是胚胎通過旁分泌影響了鄰近胚胎的發(fā)育，最近研究發(fā)現(xiàn)外泌體在這一過程中發(fā)揮重要作用[8]。通過孤雌生殖和核移植胚胎共同培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，核移植胚胎從孤雌生殖胚胎的培養(yǎng)基中吸收外泌體，顯著提高了核移植胚胎的體外發(fā)育[8]。通過對這些外泌體的分析發(fā)現(xiàn)，其包含有全能基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Nanog在內(nèi)的多種mRNA[8]。因此，胚胎可以利用外泌體作為一種傳遞方式，不僅與母體子宮內(nèi)膜交流，也可以與彼此溝通。

miRNA 主要通過與靶基因3'UTR 結(jié)合，通過阻遏基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯或引起靶基因mRNA 的降解來發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，在哺乳動物中約70% 的基因表達(dá)受到miRNA 的調(diào)控，其在動物生殖器官廣泛存在，與繁殖性狀高度相關(guān)[49]。在對胚胎來源的外泌體研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA 可以調(diào)控早期胚胎發(fā)育的生物過程。這些miRNA 被分泌到外泌體中，進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境被細(xì)胞吸收從而影響基因表達(dá)。Kropp 等[50]通過檢測培養(yǎng)了5～8 d 的牛胚胎中miRNA 的分泌發(fā)現(xiàn)，成功發(fā)育到囊胚期的胚胎與發(fā)育失敗或退化的胚胎之間miRNA表達(dá)存在的差異，在退化胚胎的培養(yǎng)基中，miR-25、miR -302c、miR 196a2 和miR -181 表達(dá)量較高。這些研究表明，特異性miRNA 的分泌可能與胚胎的發(fā)育能力有關(guān)。因此，可以使用特異性miRNA 作為生物標(biāo)志物為成功妊娠選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎。

4 展 望

外泌體是一種新發(fā)現(xiàn)的“細(xì)胞信號”途徑，近年來已被越來越多的研究者所青睞，對外泌體的研究主要集中在細(xì)胞通訊與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)理、藥物載體和生物標(biāo)志物篩選3 個方面。哺乳動物胚胎的成功附植依賴于胚胎與母體子宮內(nèi)膜之間的協(xié)同交流，子宮腔液中的外泌體能夠行使母體與胚胎間信息傳導(dǎo)的功能。目前的研究主要集中在子宮腔液外泌體蛋白質(zhì)和miRNAs 的成分解析，及其在胚胎附植方面進(jìn)行的功能性研究。外泌體的研究中還存在很多不足，如導(dǎo)致一個現(xiàn)象的發(fā)生是由外泌體中的一種成分調(diào)控還是多種成分調(diào)控；外泌體識別定位靶細(xì)胞機(jī)制；外泌體中的物質(zhì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，它們的作用是靶細(xì)胞還是靶細(xì)胞中的細(xì)胞器等。外泌體包含的貨物大部分?jǐn)?shù)據(jù)來源于長期傳代的細(xì)胞系，很少來源于原始組織。因此，它們在體內(nèi)的相關(guān)性尚不清楚。同時，子宮腔液外泌體中脂質(zhì)、mRNA 等的研究還鮮有報道。另外，為了更好地了解外泌體在胚胎與母體之間發(fā)揮的信息橋梁作用，還需要進(jìn)一步明確子宮腔液中胚胎來源外泌體和子宮內(nèi)膜來源外泌體的區(qū)別。對以上問題的深入研究，能夠進(jìn)一步解析胚胎附植過程中重要的信號調(diào)控機(jī)制，這不僅能為提高家畜動物的繁殖力提供重要科學(xué)依據(jù)，也能為人類不孕不育、輔助生殖等領(lǐng)域的研究提供新的思路。