熱應激對豬禽腸道健康的影響及其機制研究進展

熊云霞，王 麗，易宏波，蔣宗勇

（廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，農業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，國家畜禽育種重點實驗室，廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣東廣州 510640）

恒溫動物存在一個最適生長環(huán)境溫度范圍，當外界溫度過高，超過上限，機體難以通過神經內分泌系統自主調節(jié)，就會出現行為和生理代謝異常、機體損傷等現象，即熱應激反應。隨著全球氣候變暖及畜禽養(yǎng)殖產業(yè)集約化生產模式的發(fā)展，豬、雞、鴨等普遍為大規(guī)模籠養(yǎng)、圈養(yǎng)，在熱帶、亞熱帶地區(qū)，熱應激成為影響畜禽夏季生產性能的重要因素，主要表現為畜禽采食量降低[1]、生長放緩、飼料轉化率降低、抗病能力減弱，甚至出現個體死亡，給畜牧業(yè)帶來巨大的經濟損失。早期有關畜禽熱應激的研究主要集中在對動物行為、生產性能、生理生化指標的影響等方面，而近年來的研究主要針對采食、腸道健康和機體免疫的影響及機理展開工作。腸道作為機體營養(yǎng)物質消化吸收的主要位點、免疫防御的第一道屏障，不可避免地成為畜禽熱應激研究的首要熱點。有研究發(fā)現，熱應激導致畜禽胃腸道消化吸收功能降低，黏膜通透性增加，有害物質遷移、易位，誘發(fā)機體免疫反應，菌群結構失衡，屏障功能受損[2-5]。本文從消化吸收功能和屏障功能兩方面綜述有關熱應激對豬禽腸道健康的影響及其機制的最新進展，為生產實踐提供一定的理論參考。

1 熱應激對豬禽腸道消化吸收功能的影響

1.1 熱應激對腸道消化功能的影響 恒溫動物降低采食從而降低消化代謝產熱，是機體應對高溫環(huán)境的有效策略。溫熱環(huán)境下，機體散熱能力有限，通常會導致體溫升高。動物采食中樞下丘腦弓狀核的抑食神經元前黑素細胞皮質素原（Proopiomelanocortin，POMC）可表達高溫感受器-瞬時受體電位離子通道V1（Transient Receptor Potential ion Channel V1，TRPV1），熱信號激活TRPV1 進而激活抑食神經元POMC，抑制采食[6]。同時熱應激影響腸道食欲肽的分泌，腸道組織中膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）基因表達顯著升高，CCK 可刺激抑制胃排空的迷走神經纖維，進而通過采食中樞調控抑制采食和胃排空，延緩食物繼續(xù)進入腸道。消化過程分為物理消化和化學消化。研究發(fā)現，高溫環(huán)境下，機體腸道蠕動變慢[7]，胃腸道消化酶分泌減少、活性降低。Pearce 等[8]研究發(fā)現，溫熱環(huán)境下豬的空腸食糜淀粉酶和胰蛋白酶活性等顯著降低，回腸蔗糖酶和麥芽糖酶分別降低30% 和24%。綜上，熱應激條件下機體采食、消化同時受到中樞神經和腸道內分泌的調控。而生產實踐發(fā)現，熱應激畜禽在天氣突然變涼爽后并不能立即恢復采食，而是存在1 周左右的延遲時間，可能是受損胃腸道的修復時間。因此可以認為，短時間熱應激對采食的影響應該主要考慮中樞神經的調控作用；而長時間的熱應激應綜合考慮中樞調控和腸道內分泌的作用，且應著重考慮整個腸道的健康狀況。

1.2 熱應激對腸道吸收功能的影響 腸絨毛是小腸的主要黏膜結構，是營養(yǎng)物質吸收的主要部位。腸絨毛越長越發(fā)達，小腸與營養(yǎng)物質的接觸面積越大，營養(yǎng)物質吸收能力越強。而腸絨毛高度受隱窩干細胞增殖、幼稚上皮細胞遷移以及成熟上皮細胞凋亡脫落的共同影響，絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度比值（The Ratio of Villi Height to Crypt Depth，V/C）可作為衡量動物腸道健康的重要指標[9]。利用腸道組織切片染色技術，經光學顯微鏡直接觀察溫熱環(huán)境下腸道黏膜形態(tài)結構的變化情況發(fā)現，熱應激導致畜禽腸絨毛頂端破裂，黏膜上皮脫落，固有層裸露形成潰瘍，腸腺萎縮，且顯著水腫，各腸段V/C 出現不同程度降低，整個腸道黏膜形態(tài)結構損傷嚴重[10-12]。熱應激導致腸絨毛上皮細胞中促凋亡因子半胱天冬酶3（caspase-3）、半胱天冬酶8（caspase-8）、半胱天冬酶9（caspase-9）、B 淋巴細胞瘤2 關聯X 蛋白（B cell lymphoma 2-Associated X，Bax）等表達上調，抗凋亡因子B 淋巴細胞瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）表達下調導致[13]，最終導致了腸絨毛的凋亡脫落。從蛋白組學層面分析熱應激條件下腸道黏膜的差異蛋白的研究發(fā)現，下調的蛋白主要集中在三羧酸循環(huán)、電子傳遞鏈和氧化磷酸化等通路，說明熱應激導致畜禽腸道黏膜細胞的能量代謝紊亂和線粒體氧化應激[14]。通過透射電鏡觀察熱應激大鼠空腸組織的超微結構也發(fā)現，熱應激導致細胞線粒體出現腫脹、空泡化等現象[15]，提示熱應激導致腸道上皮細胞損傷可能與線粒體凋亡途徑有關。熱應激引起細胞DNA 氧化損傷[16]，導致組織或者血液中的氧自由基、抗氧化酶活性顯著變化[17-20]。因此，熱應激導致的細胞線粒體氧化應激是腸道絨毛結構損傷的原因之一，線粒體氧化應激促使畜禽腸道上皮細胞出現凋亡、壞死、脫落。這也解釋了飼料中添加一定量的硒、維生素C、維生素E、黃酮等抗氧化劑可一定程度緩解熱應激造成的畜禽腸道損傷。另一方面，熱應激使得腸道黏膜損傷細胞修復受阻。研究表明，熱應激影響了絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）介導的細胞損傷修復過程[11]，且高溫環(huán)境下腸道表皮生長因子（Epithelial Growth Factor，EGF）及其受體的表達顯著下調，阻礙腸道上皮細胞的增殖再生[21]。Yu 等[22]也發(fā)現，熱應激通過介導細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/2（Extracellular-Regulated Kinase 1/2，ERK1/2）途 徑調控腸道上皮細胞的存活、增殖和遷移，溫熱環(huán)境下腸道細胞ERK1/2 磷酸化蛋白表達顯著上調，進一步改變與增殖、分化、生長相關基因mRNA 的表達。

溫熱環(huán)境對畜禽腸道吸收功能的影響還表現在機體對營養(yǎng)物質選擇性偏好的改變。熱應激條件下葡萄糖轉運能力和血糖濃度升高，空腸鈉-糖共轉運載體1（Sodium-Dependent Glucose Transporter 1，SGLT-1）表達可提高大約50%[23-25]。有研究發(fā)現，熱應激條件下，氨基酸轉運載體rBAT、y+LAT1、CAT1基因的mRNA表達均顯著降低，對蛋白質物質的吸收能力降低[26]。因此，熱應激條件下，機體偏好吸收糖類物質而非蛋白質。機體溫度升高后，機體血液會更多地流向外周組織散熱，導致腸道血流量減少[27]。Hall 等[28]把接受動脈注射細胞低氧標記[3H]米索硝唑的大鼠暴露在高溫環(huán)境下，發(fā)現在小腸內的[3H]米索硝唑滯留高達29%。脯氨酸-4-羥化酶可羥基化缺氧標記物缺氧誘導因子（Hypoxia Inducible Factor，HIF）的功能亞基，使其保持非活性狀態(tài)，Pearce 等[29-30]研究發(fā)現，熱應激條件下畜禽腸道脯氨酸-4-羥化酶β含量較低，導致HIF活性升高。提示在熱環(huán)境下，畜禽腸道組織缺血缺氧。而這正可能是造成機體偏好吸收糖類物質，進而通過糖酵解途徑獲得能量的原因。

2 熱應激對豬禽腸道屏障功能的影響

腸道通過腔管狀結構將腸道內物質與機體內環(huán)境有效分開，吸收腸腔內水分和營養(yǎng)物質的同時，防止有害大分子、內毒素、病原菌等入侵，發(fā)揮屏障功能。根據組成和功能，可將腸道屏障劃分為機械屏障、化學屏障、免疫屏障和微生物屏障[31-32]。熱應激導致腸道形態(tài)損傷，腸道屏障的結構基礎遭到破壞，腸道通透性增加，屏障功能受損。

2.1 熱應激對腸道機械屏障的影響 腸道黏膜上皮細胞之間通過緊密連接、黏附連接和橋粒來維持細胞的正常結構。緊密連接是多種蛋白相互作用形成的復合體，是決定細胞通透性的主要因素，包括跨膜蛋白如閉鎖蛋白（Occludin）和閉合蛋白家族（Claudins）、膜周蛋白如閉合小環(huán)蛋白（ZO-1）以及細胞骨架肌動蛋白和肌球蛋白[33]。熱應激導致畜禽腸上皮細胞跨膜電阻降低，通透性增加，腸道完整性遭到破壞[8,27]，這與緊密連接蛋白的表達和分布變化有關。相關的畜禽腸道黏膜蛋白組學研究表明[14-15]，熱應激導致的差異蛋白主要參與細胞結構及流動性、葡萄糖及能量代謝、應激應答與防御、細胞增殖和凋亡等生物學過程；信號通路分析發(fā)現，主要富集于細胞骨架、細胞流動性、緊密連接、MAPK 等相關通路；且進一步WB 驗證表明，熱應激激活MAPK、NF-κB 通路，降低緊密連接蛋白Occludin、ZO-1、鈣粘附蛋白E（E-cadherin）等的表達。過高的環(huán)境溫度可升高腸道上皮細胞中磷酸化蛋白激酶（Protein Kinase C，PKC）、磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶（Myosin Light Chain Kinase，MLCK）、磷酸化肌球蛋白輕鏈（Myosin Light Chain，MLC）等蛋白的表達，而MLC 磷酸化可誘導肌動球蛋白互作，進而調控細胞骨架蛋白收縮，使得緊密連接被打開，腸道通透性增加[34]。

短時間溫和熱刺激下，為維持細胞正常屏障功能，腸道上皮會上調MLCK、酪蛋白激酶Ⅱ-α蛋白（Casein Kinase II-α，CK II-α），出現熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）和熱休克轉錄因子-1（Heat Shock Transcription Factor，HSF-1）介導的ZO-1、Claudin 3 和Occludin 蛋白等代償性升高[23,35-36]。這與畜禽在限飼或者營養(yǎng)匱乏條件下，腸道上皮細胞出現代償性增殖的結果一致[37-38]。有研究表明，采食量降低（限飼或者低營養(yǎng)攝入）可引起畜禽腸道絨毛長度變短、形態(tài)受損、黏膜完整性降低[37-39]。熱應激導致畜禽采食量顯著降低，提示采食量降低可能是腸道黏膜機械屏障損傷的原因之一。

Pearce 等[23,29-30]在畜禽熱應激試驗中設置常溫環(huán)境配對飼喂組（即常溫條件下，采食量與熱應激組相同）用來消除不同采食量的交互影響，結果發(fā)現低營養(yǎng)攝入導致的腸道結構損傷與熱應激相似，都出現腸道完整性降低和血液內毒素濃度升高的現象，但是兩者的蛋白和mRNA 譜圖有巨大差異，熱應激導致了281 個蛋白表達差異，而采食降低只造成20 個蛋白差異表達。并且熱應激導致機體體溫升高，易使腸道缺血缺氧，腸道局部產生并積累大量酸性代謝產物，引起細胞酸中毒從而導致細胞代謝障礙和組織損傷；同時缺氧導致三磷酸腺苷耗盡，改變腸道上皮細胞離子泵活性，細胞外Ca2+內流增加，加重細胞組織水腫，促進腸道通透性增加[2-3]。因此，熱應激導致的腸道損傷不應只考慮采食降低這個因素，應該綜合考慮機體體溫升高時腸道缺血缺氧的情況。

此外，熱應激可顯著增加畜禽腸道中的肥大細胞數目[12]，而肥大細胞可釋放類胰蛋白酶和組胺等物質增強上皮組織通透性。因此，溫熱環(huán)境增加腸道通透性可能還與肥大細胞增多有關。

2.2 熱應激對腸道化學屏障的影響 化學屏障指的是覆蓋在腸道上皮表面的腸液，包括腸道上皮細胞和黏膜下腺體分泌的黏液、消化液以及腸道菌群產生的抑菌物質等，腸液的主要化學成分包含黏蛋白（Mucin，MUC）、溶菌酶、防御素、胃腸消化酶、膽汁、胃酸、抗菌肽等，腸液可潤滑腸道并抑制有害菌黏附、定植，維護腸道健康。長時間高溫高熱使得畜禽腸道黏膜出現潰瘍性壞死脫落，腺體結構被破壞，杯狀細胞數量下降導致黏液分泌不足[12]，胃腸道消化酶分泌減少，腸道菌群組成改變[26]，造成腸道黏液減少、成分改變，從而影響腸道的化學屏障功能。目前，熱應激對畜禽腸道化學屏障的影響還未受太多關注，需要進一步研究。

2.3 熱應激對腸道免疫屏障的影響 熱應激造成的腸道免疫反應主要是指腸道形態(tài)及屏障損傷造成的內毒素及病原菌易位引起的腸道炎癥反應。腸道黏膜免疫系統主要包括腸道相關淋巴組織和分泌型抗體，其中腸道相關淋巴組織包括腸黏膜相關淋巴組織、彌散性淋巴組織，而分泌型抗體以分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin，sIgA）為代表?？梢酝ㄟ^測定腸道上皮內淋巴細胞數量及分布、sIgA 含量及檢測T淋巴細胞亞群來評價腸道的免疫狀態(tài)。溫熱環(huán)境下，畜禽各腸段的肥大細胞數目增加[12]，腸道sIgA 含量顯著降低[40-41]；腸黏膜中病原識別受體Toll 樣受體2（Toll-Like Receptors 2，TLR2）、TLR4表達顯著下降；細胞抗炎癥因子干擾素-γ（Interferon，IFN-γ）、白細胞介素-2（Interleukin-1，IL-2）、IL-4、IL-10mRNA 轉錄顯著降低；且腸系膜淋巴結中抗原識別細胞CD3+T、CD3+CD4+CD8-T 顯著降低，而CD3+CD4-CD8+T 細胞顯著升高。進一步通過基因芯片技術發(fā)現，熱應激通過介導酪氨酸激酶-轉錄因子（Janus Kinase-Signal Transducer And Activator Of Transcription，JAK-STAT）通路使得抗原呈遞改變，導致畜禽腸道的免疫應答功能減弱[41-42]。病原體逃脫腸道免疫系統屏障后進入機體血液，引起機體激烈的免疫炎癥反應，可能導致動物個體的死亡。

2.4 熱應激對腸道微生物屏障的影響 腸道存在一個由腸道共生菌與宿主形成的微生態(tài)空間結構，良好的菌群平衡能夠促進腸道生長發(fā)育，增強腸道消化吸收功能，抵御外來病原菌的黏附和定植，對腸道發(fā)揮正常生理功能至關重要。李永洙課題組[26,43-44]利用16S rDNA的PCR-DGGE 技術研究雞的腸道菌群結構，發(fā)現熱應激影響了空腸、回腸等部位菌群結構和多樣性，乳桿菌等有益菌的生長受到抑制，但促進了卵形擬桿菌等有害菌的繁殖。這和彭騫騫等[45]利用相同技術分析熱應激雞盲腸菌群結構的研究結論一致。但是腸道微生物數量龐大，結構復雜，而16S rDNA 的PCR-DGGE 技術在分析高豐度菌群時定量不準、分析低豐度菌時分辨率有限，近年來飛速發(fā)展的測序技術可以克服這一不足，利用測序技術分析熱應激畜禽腸道菌群變化已有相關報道。Wang 等[46]利用16S rRNA 測序技術分析熱應激肉雞回腸菌群結構發(fā)現，熱應激導致肉雞回腸菌群物種豐富度提高，其中梭狀芽孢桿菌、鏈霉菌、糞桿菌、羅氏桿菌、阿利西伯菌、固氮螺菌和顫桿菌含量均有所增加，而糞球菌和鏈球菌含量降低。Zhu 等[47]利用宏基因組測度技術發(fā)現，熱應激導致蛋雞的糞便菌群中，厚壁菌門數量顯著降低，擬桿菌門數量升高，且進一步的功能預測發(fā)現，熱應激導致與半胱氨酸和蛋氨酸代謝、苯甲酸鹽降解等相關代謝途徑更豐富，而降低了視黃醇代謝和苯丙烷生物合成等代謝途徑，這些改變都是造成腸道代謝紊亂的原因。Dinan 等[48]認為應激可能通過迷走神經使丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis，HPA）和腸道微生物產生互作，改變腸道微生物組成，進而影響腸道結構和功能。綜上，熱應激會嚴重影響畜禽腸道的菌群結構和多樣性，同時破壞腸道結構。

但是外界環(huán)境溫熱信號如何改變腸道菌群進而影響腸道結構和功能？目前比較主流的觀點認為微生物主要是通過其代謝產物如短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）影響宿主腸道健康。SCFAs 是由未被胃和前腸分解的非淀粉多糖、抗性淀粉、低聚糖、糖醇等碳水化合物經后腸解糖細菌發(fā)酵生成的，主要是乙酸、丙酸、丁酸。產短鏈脂肪酸菌主要包括腸桿菌、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、雷普沃氏菌屬、嗜酸乳桿菌、霍氏真桿菌等，詳細參見Ara Koh 等[49]的綜述。SCFAs 是結腸細胞的主要能源物質，直接為腸道細胞提供能量。SCFAs 還可以降低腸道pH，抑制有害病原菌生長。并且SCFAs 可通過激活AMPK 信號通路保護腸道的緊密連接結構，維持細胞骨架形態(tài)，保護腸道屏障功能，提高跨膜電阻值，降低腸道的滲透性[50-51]。因此，熱應激可能通過影響產SCFAs 菌屬活性，降低腸道SCFAs 的濃度，影響腸道完整性。熱應激影響了哪些產SCFAs 菌，有待進一步研究。

目前有關畜禽熱應激腸道菌群的研究主要集中在雞上，對其他畜禽的研究還鮮有報道，且已有報道也主要是集中在前腸段菌群，而對菌群豐富的后腸段（盲腸、結腸）部位的菌群研究非常有限，腸道菌群隨著熱應激時間長短的動態(tài)變化也未見報道，這幾個方面都可以作為畜禽熱應激進一步研究的方向。

3 小 結

綜上所述，熱應激導致畜禽體溫升高，采食降低，損害畜禽腸道的消化吸收功能，并導致腸道屏障功能紊亂，嚴重損害畜禽的腸道健康。近年國內外有關熱應激影響畜禽腸道健康的研究主要集中在對腸道形態(tài)結構、腸道完整性的損傷及機制的探討，而對熱應激條件下化學屏障變化、腸道菌群變化、腦-腸-菌互作、中樞調控和腸道內分泌互作的影響等還未見深入的報道。機體是一個復雜的有機整體，多層面結合探討熱應激的分子機制可作為下一步的研究方向。